羅淼，黃榮

成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，功能分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 611130）

毛木耳（Auricularia polyricha）又稱黃背木耳，屬于擔(dān)子菌綱，木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳屬（Auricularia）的毛木耳種（A.polytricha）[1]，是食藥兩用性食用菌，具有益氣強(qiáng)身、活血、止血、止痛、防癌抗癌之功效[2]。毛木耳多糖屬于酸性雜多糖，由五種單糖和葡萄糖醛酸組成[3]。毛木耳多糖具有提高機(jī)體免疫力、抗癌抑癌、抗凝血、降血脂、抗衰老及改善心臟功能等作用[4-5]。目前對(duì)黑木耳多糖的研究居多，毛木耳多糖較黑木耳多糖含有較多的膠質(zhì)，提取難度較黑木耳更高，但毛木耳產(chǎn)地分布廣泛，產(chǎn)量豐富，價(jià)格比黑木耳便宜，其子實(shí)體中多糖含量明顯高于黑木耳中的含量，具有深入研究的價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)毛木耳的研究主要集中在栽培技術(shù)方面，而對(duì)毛木耳多糖純化工藝還未見報(bào)道[6]。大孔樹脂由于其獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)及材料性質(zhì)，多應(yīng)用于黃酮[7]、多糖等[8-9]的分離純化。研究首先采用復(fù)合酶-超聲波提取毛木耳粗多糖，并進(jìn)一步選用D-101、AB-8、X-5、HPD-100、MCA-9、D-141、HPD-100A這7種大孔吸附樹脂對(duì)毛木耳提取物進(jìn)行純化研究，篩選出最佳的純化樹脂及最優(yōu)的分離，為更有效地開發(fā)和利用毛木耳資源提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與材料、試劑

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析）；PHS-3CW數(shù)字酸度計(jì)（上海殷特）；FA2204N分析天平（上海菁華公司）；202-1A電熱恒溫干燥箱（北京中興公司）；KS康氏震蕩器（江蘇榮華儀器制造有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

毛木耳粉（于5—6月份采自四川什邡市澗氐鎮(zhèn)木耳種植基地，于60 ℃烘干，粉碎過(guò)0.250 mm篩）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（成都康邦生物科技有限公司）；D-101型大孔樹脂（天津大學(xué)農(nóng)藥廠）；D-141、X-5大孔樹脂（上海試劑一廠）；AB-8、HPD-100、MCA-9、HPD-100A型大孔樹脂（南開大學(xué)化工廠）；苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 復(fù)合酶-超聲波法提取毛木耳多糖

稱取一定量毛木耳粉，按適當(dāng)料液比提前浸泡24 h，加復(fù)合酶[添加量為毛木耳粉質(zhì)量3%（纖維素酶∶果膠酶=1∶1）]于溶液中，調(diào)節(jié)pH 4，60 ℃水浴下酶解60 min，煮沸滅酶10 min。在超聲功率200 W、溫度45 ℃下提取20 min，離心，在上清液中加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），劇烈振蕩30 min，離心，取上層清液濃縮、醇沉、干燥，得毛木耳粗多糖[10-11]。

1.3 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[12]測(cè)定毛木耳多糖含量。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.017 8X-0.017 5，R2=0.995 8，線性范圍在0～32 mg/mL的范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

式中：C為試液中的葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；D為多糖的稀釋因素；F為換算因子；W為毛木耳質(zhì)量，g。

1.4 大孔樹脂的篩選

將預(yù)處理的D-101、AB-8、X-5、HPD-100、MCA-9、D-141、HPD-100A型大孔樹脂（濕樹脂）[7]，各取5 g置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL樣液，于25 ℃恒溫振蕩3 h，靜置24 h，過(guò)濾，測(cè)定濾液的多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算各種樹脂的吸附率E（%）[7]。將靜態(tài)吸附后的樹脂用適量純化水進(jìn)行洗脫后，加入80%乙醇，振蕩3 h，靜置24 h，充分解吸后過(guò)濾，測(cè)定濾液的多糖質(zhì)量濃度，計(jì)算各樹脂解吸率B（%）[7]。

式中：C0為吸附前多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余液多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為樣品體積，mL；V1為吸附后剩余溶液體積，mL；V2為解吸體積，mL。

1.5 D-101靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線

取5 g預(yù)處理好的D-101型大孔樹脂，放入50 mL錐形瓶中，加入25 mL質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的毛木耳粗多糖溶液，將錐形瓶于搖床振蕩4 h，每0.5 h取2 mL溶液，用1.3小節(jié)的方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算吸附率，繪制吸附曲線。

1.6 D-101大孔樹脂純化工藝單因素試驗(yàn)

1.6.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

取7份預(yù)處理好的D-101型大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂），裝于10 mm×200 mm的層析柱中，加入質(zhì)量濃度為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0 mg/mL的粗多糖溶液，調(diào)節(jié)pH 4，以2.0 mL/min的速度上樣并靜置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小節(jié)的方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹脂吸附率。

1.6.2 上樣液pH對(duì)吸附率的影響

取6份預(yù)處理好的D-101型大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂），裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按1.6.1小節(jié)確定最佳質(zhì)量濃度條件，用稀鹽酸調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的粗多糖溶液pH 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，以2.0 mL/min的速度上樣并靜置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小節(jié)的方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹脂吸附率。

1.6.3 上樣液速度對(duì)吸附率的影響

取6份預(yù)處理好的D-101型大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂），裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按以上確定的最佳條件，取質(zhì)量濃度4.0 mg/mL，pH 4的粗多糖溶液，分別以1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL/min的速度上樣并靜置2 h，每5 mL收集流出液，按1.3小節(jié)的方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹脂吸附率。

1.6.4 洗脫劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

取7份預(yù)處理好的D-101型的大孔吸附樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按上述步驟確定的最佳上樣條件進(jìn)行上柱，以相同速率用適量純化水進(jìn)行洗脫后，各層析柱分別用10%，30%，50%，70%，80%，90%和95%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫速度2.0 mg/min，收集洗脫液，按1.3小節(jié)的方法測(cè)定含量，計(jì)算大孔樹脂解吸率。

1.6.5 洗脫速率對(duì)解吸率的影響

取5份預(yù)處理好的D-101型的大孔吸附樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按上述步驟確定的最佳上樣條件進(jìn)行上柱，以相同速率用適量純化水進(jìn)行洗脫后，各層析柱用80%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫速率為0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mg/min，收集洗脫液，按1.3小節(jié)的方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹脂解吸率。

1.6.6 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響

取5份預(yù)處理好的D-101型的大孔吸附樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，按上述步驟確定的最佳上樣條件進(jìn)行上柱，以相同速率用適量純化水進(jìn)行洗脫后，各層析柱用2，3，4，5和6 BV的80%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫速率為2.0 mL/min，收集洗脫液，按1.3小節(jié)的方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算大孔樹脂解吸率。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以上樣液pH（A）、上樣液質(zhì)量濃度（B）和上樣液速度（C）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平值見表1。

表1 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的選取

從表2可以看出，D-101型樹脂在吸附率以及解吸率上都較高，表現(xiàn)出良好的吸附和解吸性能。因此，最終選擇D-101型大孔樹脂作為接下來(lái)試驗(yàn)的樹脂。

表2 七種大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

2.2 D-101靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線

如圖1所示，D-101型大孔樹脂對(duì)多糖的吸附在前2 h呈上升趨勢(shì)，在2 h后吸附率呈穩(wěn)定趨勢(shì)，逐漸平穩(wěn)。

圖1 靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)曲線

2.3 吸附工藝研究

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

如圖2所示，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度小于4 mg/mL時(shí)，大孔樹脂對(duì)多糖的吸附率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度過(guò)大時(shí)，明顯可以看出吸附率不再上升，反而下降。因此，選取4 mg/mL為上樣液最佳質(zhì)量濃度。

圖2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

2.3.1.2 上樣液pH對(duì)吸附率的影響

pH對(duì)多糖的存在影響很大，因而也會(huì)影響到吸附率。如圖3可知，選取pH 4上樣，吸附率達(dá)到最佳。

圖3 上樣液pH對(duì)吸附率的影響

2.3.1.3 上樣液速度對(duì)吸附率的影響

由圖4可知，總體來(lái)看，上樣液速度在吸附過(guò)程中的影響不是很大，因此，選擇2.5 mL/min作為上樣液速度，既可保證吸附的程度又節(jié)約了時(shí)間。

圖4 上樣液速度對(duì)吸附率的影響

2.3.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)影響結(jié)果，以對(duì)毛木耳多糖吸附率影響顯著的三個(gè)因素（上樣液pH、上樣液質(zhì)量濃度、上樣液速度）為自變量，采用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用Design Expert軟件分析，以上樣液pH、上樣液質(zhì)量濃度、上樣液速度為響應(yīng)變量，多糖吸附率為響應(yīng)值，進(jìn)行回歸擬合分析，可得到模型：Y=78.70+ 0.90A+1.70B+1.14C-0.48AB+0.18AC-0.51BC-2.26A2-1.11B2-1.58C2。

其中，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。方程中的B、A2影響極其顯著，C、C2的影響顯著。該模型的R=0.954 4，R值越接近于1，擬合度越高，自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系越顯著。表4中，F(xiàn)A=5.52，F(xiàn)B=19.52，F(xiàn)C=8.90，所以各因素對(duì)吸附率的影響程度大小為上樣液質(zhì)量濃度＞上樣液速度＞上樣液pH。

表4 吸附率回歸方程的方差分析結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化D-101大孔樹脂對(duì)毛木耳多糖吸附率的最佳方案為上樣液質(zhì)量濃度4.68 mg/mL，上樣液pH 4.14，上樣液速度2.63 mL/min，此條件下理論吸附率為79.48%。

采用交互作用組圖即可對(duì)兩兩因素交互影響毛木耳多糖吸附率的效應(yīng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，如圖5所示。各個(gè)響應(yīng)曲面的開口均為向下的凸面，表示該模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)為最大值。各個(gè)等高線呈圓形，兩因素的交互作用不明顯。綜合分析可得上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的數(shù)值影響最大。

圖5 兩因素交互作用對(duì)吸附率影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.4 洗脫工藝研究

2.4.1 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)解吸率有所影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加時(shí)，解吸率升高，由圖6可知，95%的乙醇和80%的乙醇洗脫能力相差不大，綜合考慮，選擇80%的乙醇為最佳洗脫體積分?jǐn)?shù)，既節(jié)約成本，同時(shí)也具有良好的洗脫效果。

圖6 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

2.4.2 洗脫速率對(duì)解吸率的影響

由圖7可知，當(dāng)洗脫速率增大時(shí)，解吸率會(huì)減小，但洗脫速率過(guò)小，需花費(fèi)時(shí)間過(guò)久，綜合考慮，選擇2.0 mL/min為最佳洗脫速率。

圖7 洗脫速率對(duì)解吸率的影響

2.4.3 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響

由圖8可知，當(dāng)洗脫液用量超過(guò)4 BV時(shí)，解吸率不會(huì)出現(xiàn)大幅度增加趨勢(shì)，故選擇4 BV 80%乙醇溶液為最佳洗脫劑用量。

圖8 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響

2.5 最佳條件的純化結(jié)果

取3份預(yù)處理好的D-101型的大孔樹脂，每份5 g（濕樹脂）分別裝于10 mm×200 mm的層析柱中，毛木耳多糖溶液5 mg/mL，pH 4，以2.5 mL/min的速率上柱，以相同速率用適量純化水洗脫，再用4 BV的80%乙醇溶液以2.0 mL/min的速率洗脫，收集洗脫液，按1.3小節(jié)的方法測(cè)定。純化前多糖含量為8.31%，純化后為23.59%，表明純化效果較好。

3 結(jié)論

研究探討大孔樹脂純化毛木耳多糖的最佳工藝條件，通過(guò)比較7種大孔樹脂的靜態(tài)吸附-洗脫效果，并結(jié)合樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)，確定采用型D-101大孔樹脂純化提取粗多糖。結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面試驗(yàn)，以多糖吸附率為檢測(cè)指標(biāo)，優(yōu)化出D-101型大孔樹脂吸附多糖最佳工藝條件：上樣液質(zhì)量濃度4.68 mg/mL，上樣液pH 4.14，上樣液速度2.63 mL/min，理論吸附率為79.48%。再通過(guò)對(duì)洗脫工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得出D-101型大孔樹脂解吸條件：4 BV 80%乙醇溶液，2.0 mL/min的洗脫速率進(jìn)行解吸，其解吸率為81.75%。在最佳純化工藝條件下多糖含量由8.31%增加到 23.59%，毛木耳多糖的純化率較好，結(jié)果穩(wěn)定可靠。