何淑欣，羅瓊，薛巧如，洪群華，周滿如*，張素中*

1. 廣州新華學(xué)院 藥學(xué)院（廣州 5105202）；2. 廣東省藥品檢驗(yàn)所（廣州 510663）

柑普茶，又名新會柑普洱茶，是由廣東新會大紅柑或小青柑和云南西雙版納勐?？h普洱茶為原料制作而成的一種茶，其特點(diǎn)入口甘醇、香甜，有獨(dú)特的陳香味，保健作用突出，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。柑普茶采用純天然的新會柑（國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，一般采用未成熟青柑除去果肉）和云南普洱茶（國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品）為原料，在沒任何添加劑的情況下，經(jīng)純生曬、半生曬制作而成。

新會柑主要成分為黃酮類化合物、揮發(fā)油、生物堿以及多糖。近年來柑普茶產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，茶企品牌不斷增多，新會小青柑普洱茶制備工藝多，但是目前關(guān)于新會小青柑普洱茶不同制備工藝及其功能作用研究報道較少。因此，加快探討不同制備工藝的新會小青柑普洱茶中沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素的含量及其抗氧化活性的差異顯得十分必要。

該試驗(yàn)以新會核心產(chǎn)區(qū)之一天馬新會柑為研究對象，探索新會小青柑普洱茶制備的最佳條件。采用正交試驗(yàn)方法，以沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素等物質(zhì)含量為考察指標(biāo)，對新會柑普茶的不同制備工藝進(jìn)行評價，并進(jìn)一步通過DPPH法對不同發(fā)酵條件下新會小青柑普洱茶進(jìn)行總黃酮抗氧化活性分析，為新會小青柑普洱茶的制備工藝及推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品與試劑

樣品：小青柑采摘時間為五月份，直徑大小為5 cm左右，為2018年江門新會陳皮核心產(chǎn)區(qū)天馬的小青柑9年駁枝柑（由江門市新會區(qū)捷和茶業(yè)有限公司、江門市新會區(qū)葵陳茶業(yè)有限公司、江門市新會區(qū)君厚茶業(yè)有限公司提供），見表1，茶葉來源為云南普洱茶熟茶（茶號：79562）。

表1 樣品來源

川陳皮素對照品（批號：C-015-180306，來源：成都瑞芬思生物科技有限公司）、桔皮素對照品（批號：J-022-181216，來源：成都瑞芬思生物科技有限公司）、沒食子酸對照品（批號：110831-201605，來源：中國食品藥品檢定研究院）、咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ枺?26PTO，來源：EPRS），DPPH（批號：STBC5115V），試劑盒購自廣州賽沫生物科技有限公司。

試劑：甲醇（色譜純，Honeywell）；磷酸（分析純，廣州試劑廠）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AE1204電子分析天平（上海良平）；XB220A電子分析天平（瑞士PRECISA）；KQ-300DE型數(shù)控超聲器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-50手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；超純水發(fā)生器（Milli-Q Advantage A10）、移液器20-200 μL（Finnpipette）；V-1800可見分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司]；ELx808TM酶標(biāo)儀（美國BioTek）；TG16W微量高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；TGL16M臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]。

1.3 制備工藝

1.3.1 半生曬法

采摘柑青皮（青皮）時期的新會柑，在果體頂部開口，利用工具將其柑肉挖出，只留下果殼，用水清洗干凈，晾干（不可以暴曬）；填充茶葉，取普洱熟茶均勻填充進(jìn)柑容器本體內(nèi)；高溫殺青：茶葉填充后，將柑容器本體放置在高溫蒸汽中進(jìn)行殺青，控制溫度為90～98 ℃，時間為8～15 min，得到初柑普茶；常溫冷卻（曬）：將提香后的初產(chǎn)品在溫度20～30 ℃下靜置5～8 h，揮發(fā)掉柑普茶中帶有余熱的水分，使柑普茶水分控制在3%～7%，得到產(chǎn)品（編號1001）。

1.3.2 純生曬法

按照1.3.1小節(jié)在青皮中填充普洱熟茶進(jìn)柑容器本體內(nèi)，不殺青，直接陽光曬足夠15 d，自然發(fā)酵，直至干透，得到產(chǎn)品（編號1002）。

1.3.3 低溫烘培法

按1.3.1小節(jié)制得初柑普茶，再將殺青后的初柑普茶靜置冷卻，冷卻溫度為20～25 ℃（室溫），時間為5～10 h，所述初柑普茶靜置定型后得到中柑普茶；將定型好的中柑普茶，置入進(jìn)行烘焙，烘焙溫度為55 ℃，烘焙時間為5～6 h，將所述中柑普茶完全烘干后得到終柑普茶；將烘干后的終柑普茶在溫度60 ℃的條件下，處理8 h，得到初產(chǎn)品；常溫冷卻（曬）：將提香后的初產(chǎn)品在溫度20～30 ℃下靜置8 h，揮發(fā)掉柑普茶中帶有余熱的水分，使柑普茶水分控制在3%～7%，得到產(chǎn)品（編號1003）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素的HPLC一測多評方法建立及樣品含量測定

1.4.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%磷酸溶液；梯度洗脫程序：0～25 min，5%～50% A；25～35 min，50%～ 90% A；35～40 min，90% A；41～50 min，5% A。每針樣品進(jìn)樣量10 μL，測定耗時50 min，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長276 nm。

1.4.1.2 精密度試驗(yàn)

取同一新會柑普茶混合對照品溶液，按1.4.1.1小節(jié)的色譜條件，在高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果顯示各特征峰的峰面積的SRSD為0.3%，表明儀器精密度良好，見表2。

表2 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果

1.4.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一新會柑普茶供試品溶液（編號1001）平行6份，按1.4.1.1小節(jié)的色譜條件，在高效液相色譜儀上各進(jìn)樣1次，記錄色譜圖，結(jié)果顯示各特征峰的峰面積的SRSD為0.1%～0.3%，表明方法重復(fù)性好，見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

1.4.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱定沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素對照品各20 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解并定容、搖勻。精密量取1，2，3，4和5 mL上述對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，即得到質(zhì)量濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08和0.10 mg/mL的對照品溶液，供HPLC分析。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到表4的線性回歸方程。

表4 標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程及相關(guān)系數(shù)

1.4.1.5 供試品溶液的制備

將3種不同制備工藝新會小青柑普洱茶打粉，精密稱取0.5 g試樣（0.425 mm），置錐形瓶中，精密加入100 mL 80%甲醇溶液，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放置室溫，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4.2 抗氧化活性

1.4.2.1 樣品前處理

各取約2 g樣品粉末，加100 mL 80%甲醇超聲提取1 h，用無菌管收集，充分混勻，取適量液體樣品在2～8 ℃條件下離心20 min左右（2 000～3 000 r/min），收集上清液。

1.4.2.2 DPPH法

按照DPPH試劑盒使用說明進(jìn)行試驗(yàn)，測得測定管和對照管的吸光度，定義每分鐘每毫升液體樣品使反應(yīng)體系的吸光度（A）每增加0.01時為一個總抗氧化能力單位，把測定管、對照管的吸光度，以及按試劑盒要求加入的反應(yīng)液總量、取樣量代入式（1）中，以計算總抗氧化能力（mL）。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用±s表示。采用SPSS 23.0軟件，數(shù)據(jù)正態(tài)分布的組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊則采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。并使用GraphPad Prism 9對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析不同制備工藝新會小青柑普洱茶中有效成分

按照1.4.1小節(jié)的HPLC分析條件[1-2]，對沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素對照品及不同年份的陳皮樣品進(jìn)行定性定量分析，將沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素對照品用80%甲醇溶解后高效液相混標(biāo)分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素的保留時間分別為9.602，21.265，39.776和41.031 min。

圖1 各對照品高效液相色譜圖

在三種不同制備工藝中，柑普茶樣品均能檢測出沒食子酸、咖啡因、川陳皮素和桔皮素，各組分具體見圖2。

圖2 三種不同制備工藝新會小青柑普洱茶樣品高效液相色譜圖

2.2 有效成分含量的差異性分析

與半生曬工藝相比，低溫烘培的小青柑普洱茶中沒食子酸、咖啡因、川陳皮素、桔皮素有效成分含量顯著上升（P＜0.05）；與半生曬工藝相比，純生曬的小青柑普洱茶中沒食子酸、咖啡因、川陳皮素、桔皮素有效成分含量顯著下降（P＜0.05）。與純生曬工藝相比，半生曬以及低溫烘培工藝的小青柑普洱茶中沒食子酸、咖啡因、川陳皮素、桔皮素有效成分含量顯著上升（P＜0.05）（見表5），提示低溫烘培在三種工藝制備的新會小青柑普洱茶有效成分含量最高（沒食子酸約為1.630±0.002 mg/g，咖啡因約為22.332±0.018 mg/g，川陳皮素約為1.263±0.000 mg/g，桔皮素約為0.978±0.001 mg/g），其次是半生曬工藝，含量最低是純生曬工藝。

表5 三種不同制備工藝有效成分含量的比較（±s）

表5 三種不同制備工藝有效成分含量的比較（±s）

2.3 抗氧化活性分析

DPPH分析法是一種篩選自由基清除劑，評價抗氧化活性的簡便方法，可用分光光度法進(jìn)行定量分析，其工作原理是DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm附近有強(qiáng)吸收。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時，DPPH的單電子被配對，在最大吸收波長處的吸光度變小，顏色變淺，且這種顏色的變淺程度與配對電子數(shù)呈劑量關(guān)系。因此，可通過在此波長處吸光度的測定來評價自由基的清除情況，從而評價試驗(yàn)樣品的抗氧化能力，此抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化性越大。陳玉霞等[3-4]試驗(yàn)也表明吸光度越低，表明樣品抑制或清除自由基能力越強(qiáng)。由表6可知，新會小青柑普洱茶在半生曬制備工藝下，抗氧化能力為1 282.3±20.726 1 g，優(yōu)于其他兩種工藝。與純生曬工藝相比，半生曬制備工藝下抗氧化能力顯著提高（P＜ 0.05）。與純生曬工藝相比，低溫烘焙制備工藝下抗氧化能力顯著下降（P＜0.05）。與半生曬工藝相比，純生曬與低溫烘焙制備工藝下抗氧化能力顯著下降（P＜0.05）。

表6 不同制備工藝新會小青柑普洱茶抗氧化能力結(jié)果（±s）

表6 不同制備工藝新會小青柑普洱茶抗氧化能力結(jié)果（±s）

組別 總抗氧化能力 (T-AOC) 活性DPPH法/g半生曬 1 282.3±20.73**純生曬 1 025.4±38.38##低溫烘焙 505.35±54.29**##注: *表示P＜0.05, **表示P＜0.01, 對比純生曬; #表示P＜0.05, 對比半生曬, ##表示P＜0.01, 對比半生曬。

由此可見，新會小青柑普洱茶的三種工藝條件對比下的抗氧化能力效果為半生曬＞純生曬＞低溫烘焙，結(jié)果見圖3。

圖3 三種制備工藝新會小青柑普洱茶抗氧化能力圖

3 討論

3.1 不同制備工藝對新會小青柑普洱茶有效成分影響

研究表明[5-9]，類黃酮和酚酸經(jīng)過熱處理后，結(jié)構(gòu)被破壞或釋放成游離態(tài)，致使新會小青柑普洱茶中其含量減少。試驗(yàn)研究三種制備工藝條件的區(qū)分主要為溫度以及溫度處理時長。半生曬工藝是在90～98 ℃，時間為8～15 min的處理，再進(jìn)行自然晾干。純生曬工藝是在30 ℃下自然晾干。低溫烘焙主要有兩個階段，第一階段在溫度為90～98 ℃，時間為8～15 min，第二階段在溫度60 ℃的條件下，處理8 h，有較長一段時間的溫度處理。從研究有效成分的含量測定結(jié)果可看出，半生曬和低溫烘焙制備工藝條件下制得的含量比純生曬的含量結(jié)果高，這可能與半生曬和低溫烘焙兩種制備工藝均經(jīng)過殺青步驟有關(guān)，提示殺青步驟可能促進(jìn)對小青柑與普洱茶的發(fā)酵，但仍需要進(jìn)一步研究。對于生產(chǎn)企業(yè)而言，純生曬制備工藝相對于其他兩種工藝簡單，但曬制時間長，需要大自然的日照，不可控因素多。半生曬和低溫烘焙兩種制備工藝可以縮短制備新會小青柑普洱茶工藝生產(chǎn)時間，為實(shí)際生產(chǎn)節(jié)約成本，為生產(chǎn)新會小青柑普洱茶提供參考依據(jù)。

3.2 不同制備工藝對新會小青柑普洱茶抗氧化能力影響

有研究表明[11]，陳皮總黃酮與普洱茶總黃酮具有協(xié)同抗氧化作用，導(dǎo)致抗氧化效力的差異，可能是由于陳皮、普洱茶總黃酮之間的抗氧化相互作用與復(fù)配黃酮的結(jié)構(gòu)和濃度有關(guān)，不同復(fù)配比影響反應(yīng)體系中分子間的相互作用。由于機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使 Fe3+還原成 Fe2+。DPPH可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，可通過比色可測出其抗氧化能力強(qiáng)弱。該試驗(yàn)通過比較新會小青柑普洱茶的三種工藝條件的抗氧化能力，其結(jié)果顯示半生曬法下抗氧化能力優(yōu)于純生曬法，純生曬法又優(yōu)于低溫烘焙法。根據(jù)體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果可得，半生曬條件的抗氧化能力總體較好。半生曬條件和低溫烘焙條件同樣都要進(jìn)行進(jìn)10 min的高溫殺青處理。但是由于低溫烘焙需要經(jīng)歷長時間、較高溫度的烘干，可能由于高溫對其抗氧化成分的活性和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。由此可見，新會小青柑普洱茶經(jīng)歷短時間的高溫處理對其總體抗氧化成分活性影響不大。另外，由于純生曬工藝需要較長時間進(jìn)行日照天然烘干，因此純生曬工藝更加需要對產(chǎn)品進(jìn)行防霉、防潮等保護(hù)措施。

3.3 進(jìn)展及意義

目前新會柑普茶已經(jīng)成為一種快消品，頗受消費(fèi)者青睞[12-13]，但是其藥理作用功效仍需進(jìn)一步研究。目前已有不少對新會柑普茶高效液相色譜指紋圖譜研究[14]，但是對新會小青柑柑普茶的制備工藝跟抗氧化能力之間的關(guān)系研究[15]目前較為少見。此次研究提示，新會小青柑普洱茶具有一定抗氧化功能，其具體作用機(jī)制以及對機(jī)體的藥理作用仍需下一步研究。

4 結(jié)論

半生曬制備工藝的新會小青柑普洱茶有效成分含量與抗氧化能力優(yōu)于低溫烘焙與純生曬、半生曬為最佳工藝，為新會小青柑普洱柑普茶的品質(zhì)鑒定及制備工藝提供參考依據(jù)。廣東有著豐富的柑橘資源，江門新會圍繞新會柑發(fā)展出了一系列相關(guān)產(chǎn)業(yè)，這促進(jìn)了陳皮產(chǎn)業(yè)的深度開發(fā)和應(yīng)用?；谛聲唐詹枰幌盗邢嚓P(guān)產(chǎn)業(yè)，必將會加速粵港澳大灣區(qū)農(nóng)產(chǎn)品與食品產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級，創(chuàng)造出更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，進(jìn)一步推動農(nóng)村與鄉(xiāng)鎮(zhèn)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展，因此應(yīng)重視其制備工藝及其藥理作用的研究。