張海娟， 蘆光新*， 范月君， 周華坤， 周學麗， 竇聲云， 姚世庭， 顏琿璘，趙陽安， 馬坤， 祁巖慧， 邱鵬瀅

(1.青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016； 2.中國科學院西北高原生物研究所， 青海省寒區(qū)恢復生態(tài)學重點實驗室，青海 西寧 810008； 3.青海農牧科技職業(yè)學院， 青海 湟源 812100； 4.青海省草原改良試驗站， 青海 共和 813000)

高寒草地是青藏高原最主要的生態(tài)系統(tǒng)，總面積約為1.4億hm2，占青藏高原面積的53%左右[1-2]，具有支撐草牧業(yè)發(fā)展、調節(jié)區(qū)域氣候和維護生物多樣性等生態(tài)功能[3-4]。但在全球氣候變化和人類活動的共同驅動下，高寒草地面臨著嚴重退化問題。為此，國家采取了圍欄封育、補播、施肥和建植人工草地等一系列恢復改良措施[5-6]，取得了一定的成效。在退化高寒草地適應性管理的情勢下，人工補播結合土壤微生物調控等輔助措施是當前退化高寒草地生態(tài)恢復的關鍵手段[1]。

‘川草2號’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)2種多年生禾本科牧草因具高產、優(yōu)質、抗寒、耐貧瘠等特點，是當前應用于高寒草地的主要播種植物[7-9]，但在高寒地區(qū)極端的環(huán)境條件下，生長極易受限。叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是土壤中普遍存在的一種共生微生物，研究表明，它能與禾本科、豆科和莎草科等80%以上的陸生高等植物及大部分水生、半水生植物建立互惠共生關系[10-12]，從宿主植物處獲得碳源，供自身生長和繁殖，同時，為植物提供氮和磷等礦質養(yǎng)分[13-14]。因此，利用AM真菌促進多年生禾本科牧草在極端環(huán)境的生長對退化高寒草地生態(tài)修復具有十分重要的意義。

目前有關AM真菌促進禾本科牧草生長的研究已有很多，但多以盆栽接種試驗為主[15-20]，鮮見其促進禾本科牧草在高寒草地等自然生境中生長的研究。鑒于此，本文通過盆栽與大田相結合的試驗方法，研究了根內球囊霉(Glomusintraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草生長的影響，以期為植物微生物聯(lián)合生態(tài)修復技術在退化高寒草地恢復治理中的應用提供技術指導和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草購自四川省草原科學研究院。種子播種前，用10%H2O2消毒10 min，無菌水沖洗5次，濾紙吸干水分后使用。供試AM真菌為根內球囊霉和摩西球囊霉，通過白三葉草(Trifoliumrepens)擴繁篩選后使用。栽培基質為青海省草原改良試驗站的田間土，養(yǎng)分含量為：總氮1 469.56 mg·kg-1，氨態(tài)氮21.89 mg·kg-1，硝態(tài)氮64.98 mg·kg-1，有機質4.07%?；|晾干后過2 mm土壤篩，經121℃高壓蒸汽滅菌2 h后使用。培養(yǎng)盆缽為規(guī)格18 cm × 15 cm×13 cm(上口徑×下口徑×高)的塑料花盆，用75%的酒精反復擦拭消毒后使用。

1.2 試驗設計

1.2.1盆栽試驗 試驗設置接種根內球囊霉(GI)、接種摩西球囊霉(GM)和不接種(Control check，CK)3個處理，每個處理3次重復，2種牧草各9盆，共有18盆，隨機排列，隔天調換位置。每盆裝培養(yǎng)基質500 g，供試AM真菌菌劑20 g[21-22]，牧草種子播量均為50?！づ?1，出苗7 d后定苗至30株·盆-1。試驗在青海大學農牧實驗樓草地微生物實驗室進行，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設為22℃/20℃(D/N，16/8 h)，濕度均為60%，光照為52 000/0 lx(D/N，16/8 h)。栽培周期為2個月(2021年6月9日至2021年8月9日)，栽培期間每周澆1次Hoagland營養(yǎng)液[23-25]，每次每盆100 mL。

1.2.2大田試驗 2021年6月3日，在青海省草原改良試驗站項目試驗地的試驗小區(qū)(小區(qū)建于2020年5月，面積均為3 m × 5 m，條播，每個小區(qū)10條，圖1)單播種植2種多年生禾本科牧草‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草，隨機選擇有機肥(有機質含量≥ 45%，N + P2O5+ K2O ≥ 5%，購自蒲江縣綠地秸稈科技有限公司)施用量分別為0(L1，P1)和5.25 t·hm-2(L4，P4)的4個試驗小區(qū)進行AM真菌接種試驗。具體接種方法為：于每個小區(qū)中間4行隨機選擇9條長勢基本一致的30 cm的牧草樣帶(每個處理各3段)，清除周圍雜草石粒后，用75%酒精反復擦拭消毒的鏟子挖開樣帶根圍的土壤，深度為10 cm，取適量根樣裝在自封袋里帶回實驗室檢測土著菌根侵染情況，然后用消毒處理的塑料隔斷將樣段周圍圍起(深度15 cm)，均勻撒上供試AM真菌菌劑后覆原土，菌劑劑量均為300 g，在大田下生長3個月后檢測菌根形成情況和菌根侵染率及牧草生長狀況。

圖1 野外試驗小區(qū)布置圖Fig.1 Layout of test plot in the field

1.3 取樣及測定

1.3.1菌根侵染率 每個處理隨機取15株完整的植物根系，洗凈后用甲醛-乙酸-乙醇固定液(Formaldehyde acetic acid，F(xiàn)AA)固定過夜，次日采用臺盼藍染色法檢測菌根結構[25]，并按Biermann等的方法計算菌根侵染率[26]。

1.3.2牧草生長指標 盆栽試驗結束后，用直尺測定植物株高，每個處理隨機測定10株，3次重復；隨機取5株健康植株，表面清洗干凈后用濾紙擦干，分別測定單株地上和地下生物量，每個處理重復3次。大田接種試驗結束后，分別測定植物株高、葉片數、穗長、節(jié)數和出土第2節(jié)直徑，每個處理3次重復；同時，取適量植物根系測定菌根侵染率。

1.4 數據分析

用Excel軟件整理數據并作圖，IBM SPSS 26.0軟件做單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan法做多重比較。

2 結果與分析

2.1 接種AM真菌對2種盆栽多年生禾本科牧草菌根形成及侵染率的影響

GI和GM均能侵染‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的根系形成菌絲和泡囊等菌根結構(圖2)。GI或GM對2種多年生禾本科牧草的菌根侵染率無顯著差異。2種AM真菌對2種禾本科牧草的菌根侵染率均為GI組顯著高于GM組和CK組(P< 0.05)，GI對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的侵染率分別是GM的1.21倍和1.36倍(表1)。

圖2 2種盆栽禾本科牧草根系菌根形成情況Fig.2 Mycorrhizal formation of two potted gramineous herbages注：L代表‘川草2號’老芒麥；P代表‘阿壩’垂穗披堿草；a,b,c分別代表不接種、接種根內球囊霉和接種摩西球囊霉Note:L indicates Elymus sibiricus ‘Chuancao No.2’;P indicates Elymus nutans ‘Aba’;a,b,c indicate no inoculation,inoculation with Glomus intraradices,and inoculation with Glomus mosseae

表1 接種AM真菌對2種盆栽禾本科牧草菌根侵染率的影響Table 1 Effects on mycorrhizal infection rate of two potted gramineae herbages of AM fungi

2.2 接種AM真菌對2種盆栽禾本科牧草生長的影響

接種GI和GM 2個月后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的株高與不接種的CK處理相比無顯著差異。接種GM的‘阿壩’垂穗披堿草的地上生物量和‘川草2號’老芒麥的地下生物量顯著高于GI組和CK組(P< 0.05)(圖3)。

圖3 接種AM真菌對2種盆栽多年生禾本科牧草株高和生物量的影響Fig.3 Effects on height and aboveground and underground biomass of two potted gramineae herbages of AM fungi

2.3 大田下2種禾本科牧草根系土著菌根形成及侵染情況

‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草單播種植1年后，根系均受土著AM真菌侵染，施有機肥(L4，P4)增加了孢子和菌絲等菌根結構。方差分析結果表明，‘阿壩’垂穗披堿草的土著菌根侵染率顯著高于‘川草2號’老芒麥(P< 0.05)，施有機肥(L4,P4)的土著菌根侵染率顯著高于不施肥的CK處理(L1，P1)(P< 0.05)(圖4)。

圖4 大田下2種禾本科牧草根系土著菌根形成情況及菌根侵染率Fig.4 Mycorrhizal formation and infection rate of two gramineae herbages of indigenous mycorrhizal in the field注：L1，P1和OR-代表不施有機肥；L4，P4和OR+代表有機肥施量為5.25 t·hm-2。下同Note:L1,P1 and OR- indicate organic fertilizer rate is 0;L4,P4 and OR+ indicate organic fertilizer rate is 5.25 t·hm-2. The same as below

2.4 接種AM真菌對2種大田禾本科牧草菌根形成及侵染率的影響

大田下接種GI和GM 3個月后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的泡囊等菌根結構明顯多于不接種的CK處理(圖5)，施有機肥(L4，P4)顯著增加了‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的菌根結構，菌根形態(tài)從6月份的孢子結構為主，變?yōu)橐耘菽医Y構為主。菌根侵染率分析結果表明，GI和GM對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率均顯著高于CK處理(P<0.05)，GI組的菌根侵染率均顯著高于GM組，施肥處理組顯著高于不施肥處理組(P<0.05)。

圖5 大田下接種AM真菌對2種禾本科牧草根系菌根形成及侵染率的影響Fig.5 Effect on mycorrhizal formation and infection rate of two gramineae herbages inoculated with AM fungi in the field

2.5 接種AM真菌對2種大田禾本科牧草生長的影響

大田下接種GI和GM 3個月后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的生長與不接種的CK處理相比有所差異(表2)。經分析，在不施有機肥(L1，P1)時，GM組的‘川草2號’老芒麥的株高顯著低于GI組和CK組(P<0.05)，GI和GM組的穗長顯著低于CK(P<0.05)，GM組的出土第2節(jié)直徑顯著低于CK組(P<0.05)，葉片數和節(jié)數在GI，GM和CK組間均無顯著差異；‘阿壩’垂穗披堿草的各項生長指標在GI，GM和CK組間均無顯著差異；在施有機肥時(L4，P4)，GI組的‘川草2號’老芒麥的株高顯著低于GM組和CK組(P<0.05)，GM組的葉片數顯著高于GI組和CK組(P<0.05)，穗長、節(jié)數和出土第2節(jié)直徑在GM，GM和CK組間無顯著差異；GI組和GM組的‘阿壩’垂穗披堿草的株高和穗長均顯著低于CK組(P<0.05)，其余指標在不同接種處理間均無顯著差異。

表2 大田環(huán)境下接種AM真菌對2種禾本科牧草生長的影響Table 2 Effect on growth of two gramineae herbages inoculated with AM fungi in the field

3 討論

3.1 栽培條件對AM真菌促生效果的影響

AM真菌侵入寄主植物根系皮層細胞形成菌根后，能擴大寄主植物在土壤中的有效吸收范圍，加強植物對根際以外的水分和礦質營養(yǎng)的吸收[27]，進而促進牧草生長。本研究在控制溫度和水分等盆栽條件下對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草分別接種GI和GM后，2種多年生禾本科牧草的地上生物量均不同程度增加。然而，在大田環(huán)境下，對2種多年生禾本科牧草接種GI和GM后，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的生長情況與CK相比無顯著差異。這可能是因為土壤中微生物種類繁多，它們與AM真菌之間存在復雜的種間關系，其中不乏抑制AM真菌生長的菌種，進而影響了植物生長。同時，大田環(huán)境下不可控因素過多，如溫度、光照和水分等，也會影響AM真菌促生功能的正常發(fā)揮[28]。其他研究者也做了相似研究，得出的結論也有所差異。如高亞敏等對燕麥(Avenasativa)接種從祁連山退化高寒草地優(yōu)勢種植物鈍裂委陵菜(Potentillachinensis)根圍分離出的AM真菌后，燕麥幼苗的株高、莖粗和葉綠素b含量等增加[20]，這與本研究結果一致。王新軍等通過盆栽和野外相結合的試驗研究了摩西球囊霉等3種AM真菌對青藏高原路域星星草(Puccinelliatenuiflora)生長的影響，結果顯示盆栽接種AM真菌能顯著增加星星草的株高和生物量，野外接種AM真菌同樣也顯著增加了植被株高和覆蓋度[29]。這與本研究結果不同，可能是由研究對象、接種時間和接種方法等不同所致。曹麗霞等對退化羊草(Leymuschinensis)草原接種土著AM真菌后發(fā)現(xiàn)，植物群落的高度、蓋度、地上生物量和物種豐富度增加[30]。這可能是由供試AM真菌不同引起，土著AM真菌具有一定的環(huán)境適應性，更容易在高海拔極端環(huán)境下生存，而AM真菌的最適生長溫度在15℃以上[31]，外源AM真菌適應高寒冷涼環(huán)境需要較高的能量支撐。錢潔鑫以未退化草場5～20 cm土層的根土混合樣為菌根接種源對內蒙古錫林郭勒盟嚴重退化草原地段人工接種AM菌根后補播羊草，結果羊草蓋度增加了3.3倍，地上部生物量增加了1.6倍[32]，這可能是因為接種源和接種方法等不同導致。然而，石偉琦通過原位試驗對內蒙古草原大針茅(Stipagrandis)群落接種AM真菌后，短期內植物群落的物種豐富度、多樣性、植物群落的結構和凈初級生產力均未發(fā)生顯著變化[33]。蔡曉布等采用草地均勻打孔法，研究了接種AM真菌對長芒草(stipabungeana)的侵染效應及對其生長的影響，結果表明，接種處理根圍土壤AM真菌孢子密度和菌根侵染率等顯著提高，對植株地上部生長無顯著影響[34]。本研究也得出與上述相似的結論，即接種AM真菌對植物生長無顯著影響，卻能顯著提高菌根侵染率。這可能是因為外界環(huán)境因素干擾較大，AM真菌需要消耗更多能量來適應環(huán)境，供給寄主植物的能量較少所致。

3.2 施肥對菌根侵染率的影響

本研究結果顯示施有機肥的地塊，‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的土著菌根侵染率顯著高于不施肥處理，外源接種AM真菌后，施有機肥處理的菌根侵染率亦顯著高于不施肥的對照處理，表明施有機肥能促進AM真菌對禾本科牧草的侵染。原因可能是施有機肥增加了土壤中氮磷等養(yǎng)分含量[35]，激發(fā)了土壤中AM真菌的活性[36]，促使其為宿主植物提供更多的礦質能量[37]，也有可能是因為施有機肥引入了新的微生物菌種，影響了AM真菌的群落結構，進而影響了AM真菌對禾本科牧草的侵染[38]。

4 結論

大田環(huán)境下根內球囊霉和摩西球囊霉均能成功侵染高寒草地多年生禾本科牧草‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系，施有機肥能增強接種叢枝菌根真菌的菌根侵染率，但在短期內對多年生禾本科牧草生長無顯著影響。因此，以后可以結合施肥等田間管理措施開展叢枝菌根真菌接種效應研究，增加叢枝菌根真菌應用于退化草地生態(tài)修復等領域中的可能。