歐 雪，吳夢(mèng)西，廖一漠，劉書亮，陳安均，高 鵬，徐 飛，敖曉琳*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610101；3.四川李記樂(lè)寶食品有限公司，四川 眉山 620036）

四川泡菜是以新鮮蔬菜為原料，添加香辛料和食鹽等輔料發(fā)酵制成[1]。按不同食鹽添加量可將四川泡菜分為中鹽泡菜：食鹽量≤10%，如調(diào)味泡菜；低鹽泡菜：食鹽量≤6%，比如家庭自制泡菜；超低鹽泡菜：食鹽量≤3%，比如一些預(yù)包裝休閑泡菜[2]。食鹽在發(fā)酵過(guò)程中能抑制致病微生物生長(zhǎng)并確保食品安全性，但鹽濃度過(guò)高又會(huì)影響泡菜的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，江玉琴等[3]在鹽濃度（10%、14%、18%）下自然發(fā)酵芥菜90天，結(jié)果表明食鹽添加量越高泡菜總酸和氨基酸含量越低。而超低鹽濃度（1%～3%）發(fā)酵易導(dǎo)致泡菜過(guò)度酸軟，縮短泡菜保質(zhì)期[4-5]。因此研究泡菜適宜的食鹽添加量對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中提高泡菜品質(zhì)具有重要意義。Xiong T.等[6]研究不同鹽濃度（2%、5%、8%）對(duì)自然發(fā)酵酸菜理化特性、微生物結(jié)構(gòu)及其代謝物（有機(jī)酸、糖、醇）的影響，結(jié)果表明鹽濃度主要影響酸菜發(fā)酵早期階段。申文熹等[7]的研究結(jié)果證明在自然發(fā)酵條件下，2%和5%鹽濃度組泡菜較8%鹽濃度組泡菜中乳酸菌種類更豐富。但目前采用接種發(fā)酵模式探討不同食鹽濃度下四川泡菜品質(zhì)變化的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道。

目前，本實(shí)驗(yàn)室已從自然發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)泡菜中篩選得到兩株優(yōu)勢(shì)乳酸菌L.plantarum RS66CD和L.fermentum Lm-4，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)這兩種菌株具有改善產(chǎn)品風(fēng)味和抑制雜菌生長(zhǎng)等特性[8]。因此，本研究復(fù)配運(yùn)用這兩種優(yōu)勢(shì)菌株制備液體發(fā)酵劑，采用接種發(fā)酵模式[9]，檢測(cè)鹽濃度為2%、5%和8%的蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)與感官品質(zhì)變化，期望為研發(fā)接種發(fā)酵低鹽四川泡菜產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

白蘿卜、泡菜鹽、八角和花椒購(gòu)自雅安市吉選超市；植物乳桿菌(L.plantarum)RS66CD：實(shí)驗(yàn)室保藏，從優(yōu)質(zhì)泡菜中分離得到，具備良好的發(fā)酵特性；發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)Lm-4：實(shí)驗(yàn)室保藏，具有改善泡菜風(fēng)味和抑菌作用。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基和PCA培養(yǎng)基購(gòu)自凱恒生物科技有限公司；氫氧化鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅、鹽酸、冰乙酸、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、亞硝酸鈉和硼酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸、乙腈：色譜純，購(gòu)自武漢科瑞興科技有限公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DZF-6020質(zhì)構(gòu)分析儀，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；NR10QC手持式色差儀，深圳市三恩時(shí)科技有限公司；UV-1800PC紫外分光光度儀，上海美普達(dá)儀器有限公司；SW-CJ4F超凈工作臺(tái)，力辰科技；PHS4C+精密pH計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀、7890A-5975CGC-MS聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；50/30μm DVB/CAR/PDMSPME萃取頭，美國(guó)Supelco公司。

1.4 制作方法

1.4.1 乳酸菌發(fā)酵劑制備

植物乳桿菌RS66CD與發(fā)酵乳桿菌Lm-4經(jīng)過(guò)活化后分別于MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到 108CFU/mL，再進(jìn)行離心（4 500 r/min，5 min，4℃）。棄取上清液，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)洗滌沉淀3次，最后調(diào)整菌懸液濃度（107～108CFU/mL）并將植物乳桿菌RS66CD與發(fā)酵乳桿菌Lm-4菌懸液以1∶1混勻制得復(fù)合菌種發(fā)酵劑，混合后立即接種。

1.4.2 泡菜制作方法

新鮮蘿卜洗凈，切成（3×2×1）cm3的塊狀備用；純凈水燒開冷卻，量取1.5 L，加入適量的泡菜鹽攪拌均勻（2%鹽濃度組：40 g泡菜鹽；5%鹽濃度組：80 g泡菜鹽；8%鹽濃度組：160 g泡菜鹽）。稱取500 g切好的蘿卜再加入花椒（2.3%）、八角（0.13%）和1.5 L鹽水到泡菜壇中，最后加入預(yù)先制備好的發(fā)酵劑，制得2%、5%和8%鹽濃度組的泡菜各兩壇，置于室溫（25℃）發(fā)酵。

1.5 分析方法

1.5.1 取樣

本試驗(yàn)發(fā)酵起始時(shí)間為2020年7月24日，取樣為0 h以及每隔24 h后取次樣，分別為發(fā)酵第0、1、2、3、4、5和6天。取樣時(shí)在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行，先將泡菜搖勻后取樣。

1.5.2 感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)10名具有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的食品相關(guān)人員組成評(píng)定小組，依據(jù)表1對(duì)泡蘿卜產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)分?？傮w得分=色澤×10%+香氣×20%+質(zhì)地×30%+滋味×40%，總分100分[10]。

表1 蘿卜泡菜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria for Radish pickles

1.5.3 質(zhì)構(gòu)儀分析

參考樸泓潔等學(xué)者的方法[11]，并稍作修改。取尺寸一致的泡菜樣品，采用TPA模式、P2探頭，質(zhì)構(gòu)測(cè)定參數(shù)為：測(cè)前速率1 mm/s、測(cè)中速率1 mm/s、測(cè)后速率10 mm/s，測(cè)試距離固定為5 mm，觸發(fā)力5 g。每個(gè)樣品測(cè)試9次。

1.5.4 色差儀分析

取大小一致的樣品，使用色差儀在室溫條件下采用取出鏡面反射模式進(jìn)行色澤測(cè)定。測(cè)試參數(shù)分別為亮度值 L*、紅綠值 a*和黃藍(lán)值 b*。通過(guò) L*、a*、b*值可以計(jì)算得出總色差值△E值，△E計(jì)算公式如下：

1.5.5 理化指標(biāo)測(cè)定

1.5.5.1 pH值和總酸的測(cè)定

pH值的測(cè)定方法參考GB/T10468-1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測(cè)定方法》[12]；總酸含量的測(cè)定采用GB/T12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》酸堿滴定法，總酸含量以乳酸計(jì)[13]。

1.5.5.2 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

亞硝酸鹽的測(cè)定參考《GB 5009.33-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與亞硝酸的測(cè)定》中的分光光度法[14]。

1.5.6 微生物分析

乳酸菌活菌計(jì)數(shù)參考GB/T4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[15]。

菌落總數(shù)的測(cè)定參考GB/T4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[16]。

1.5.7 有機(jī)酸含量測(cè)定

色 譜 柱 ：C18柱 (Welch materials)，250 nm×4.6 nm，5μm。流動(dòng)相：100%乙腈、1%磷酸水溶液，pH 2.8，臨用前超聲脫氣20 min。流速1 mL/min，進(jìn)樣量10μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫35℃。標(biāo)曲的制作參考王芮東等[10]學(xué)者的方法，并稍作修改。有機(jī)酸混標(biāo)用超純水稀釋后用0.22μm的濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。以色譜圖結(jié)果的峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)將一定量有機(jī)酸混標(biāo)加入樣品處理液中，計(jì)算絕對(duì)回收率。待測(cè)樣品定量與定性：通過(guò)保留時(shí)間定性，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.5.8 揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測(cè)

采用SPME-GC-MS法進(jìn)行測(cè)定。萃取條件：參考夏季等的方法[17]，并稍作修改。稱取5.0 g泡菜勻漿和1.0 g NaCl于20 mL萃取瓶中放入50℃恒溫水浴鍋中，將預(yù)先老化過(guò)的萃取頭插入萃取瓶中吸附30 min，最后將萃取頭插入進(jìn)樣口，解析5 min。氣相色譜條件：不分流進(jìn)樣模式，以氦氣作為載氣，流速設(shè)為1.0 mL/min。升溫程序：進(jìn)樣口溫度設(shè)為250℃，進(jìn)樣溫度為40℃，進(jìn)樣時(shí)間設(shè)為3 min，以5℃/min速率升至150℃，保持3 min，再以10℃/min速率升至230℃，保持3 min；質(zhì)譜條件：電離方式：電子電離，能量：70 eV，離子源溫度：230℃，接口溫度：250℃；質(zhì)量掃描范圍：25.00～450.00 m/z。

定性和定量分析：由GC-MS得到的色譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)在標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)NIST11中比對(duì)檢索，選取相似度＞80的物質(zhì)進(jìn)行定性分析，并準(zhǔn)確鑒定出各樣品的揮發(fā)性成分，采用面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel、SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，Origin 8.5制圖，所以試驗(yàn)均平行進(jìn)行3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度人工接菌發(fā)酵蘿卜泡菜發(fā)酵成熟后感官評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一般泡菜的總酸含量達(dá)到0.4 g/100g時(shí)，即可認(rèn)為泡菜成熟，風(fēng)味最佳[7]。因此根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，分別在第3、5和6天將2%、5%和8%鹽濃度組的蘿卜泡菜取出進(jìn)行感官分析，結(jié)果如表2所示：從總分來(lái)看，2%和5%鹽濃度組泡菜綜合得分顯著高于8%鹽濃度組，且2%鹽濃度與5%鹽濃度組差異并不顯著（P＞0.05）。對(duì)比發(fā)現(xiàn)2%鹽濃度組泡菜色澤鮮亮，具備泡菜應(yīng)有的特殊香氣，且咸淡適宜，更被消費(fèi)者喜愛(ài)。5%鹽濃度組泡菜在色澤和滋味上不及2%鹽濃度組，但其泡菜風(fēng)味濃郁，質(zhì)地脆嫩爽口。8%鹽濃度組雖然在質(zhì)地方面具明顯優(yōu)勢(shì)，但其滋味過(guò)咸，不符合消費(fèi)者的飲食要求。

表2 不同鹽濃度蘿卜泡菜感官品質(zhì)變化Table 2 The sensory quality of Radish pickles with different salt concentration changes

2.2 不同鹽濃度接種發(fā)酵蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)特性的變化

由圖1-a所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各組別蘿卜泡菜的硬度均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，（P＜0.05），鹽濃度越高，泡菜硬度降低速率越緩慢，可能是在高滲透壓環(huán)境下，蔬菜細(xì)胞脫水更快，組織細(xì)胞變致密，使硬度降低速度減慢。除硬度外，脆度是影響泡菜感官品質(zhì)的另一個(gè)重要指標(biāo)。如圖1-b所示，鹽濃度越低，泡菜脆度降低速率越快。這是因?yàn)榈望}濃度下乳酸菌利用底物產(chǎn)酸速率較快，使泡菜質(zhì)地變軟，脆性下降。這與張其圣等[5]的研究結(jié)果一致。圖1-c顯示的是泡菜咀嚼度的變化情況，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，鹽濃度高的試驗(yàn)組咀嚼度降低的速度更加緩慢。由此可見(jiàn)，鹽濃度對(duì)泡菜質(zhì)構(gòu)特性有一定影響，8%鹽濃度的質(zhì)構(gòu)特性最佳，這與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

圖1 不同鹽濃度蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中硬度(a)、脆度(b)、咀嚼度(c)的變化Figure 1 Changes in hardness(a)、crispness(b)and chewiness(c)of Radish pickles with different salt concentrations during fermentation

2.3 不同鹽濃度接種發(fā)酵蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中色差指標(biāo)變化

色差儀測(cè)得的a*表示紅色度，a*越大表示越紅，a*越小表示越綠；b*表示黃色度，b*越大表示越黃，b*越小表示越藍(lán)；L*表示亮度，L*越大表示越亮，越小表示越暗；△E表示總色差大小。由表3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，各組別L*值均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且鹽濃度越高降低的速率越慢，可能與微生物利用底物的效率有關(guān)。鹽濃度產(chǎn)生的滲透壓越高會(huì)抑制微生物的生命活動(dòng)和代謝效率。各組別a*和b*的差異并不大，△E的變化趨勢(shì)與L*的變化規(guī)律基本相同，由圖2可知2%、5%、8%鹽濃度組分別在第3、5、6天達(dá)到成熟要求，當(dāng)各組達(dá)到成熟要求時(shí)各組的L*值分別為48.50±0.98、45.83±1.10和45.01±0.23。結(jié)果可以看出鹽濃度越高，泡菜成熟時(shí)的顏色越暗，這與感官分析結(jié)果一致。

表3 不同鹽濃度蘿卜泡菜色差指標(biāo)變化Table 3 The color difference index of Radish pickles with different salt concentration changes

2.4 不同鹽濃度接種發(fā)酵蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化

2.4.1 pH值和總酸含量的變化

pH值和總酸是影響泡菜風(fēng)味的重要指標(biāo)，同時(shí)也是反映微生物在特定環(huán)境下代謝活動(dòng)情況的綜合參數(shù)。不同鹽濃度蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中的pH值和總酸含量變化如圖2所示，在發(fā)酵開始后的3 d內(nèi)pH值顯著下降至3.5左右。2%鹽濃度組在發(fā)酵前兩天產(chǎn)酸速度最快，且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程始終保持pH值最低，總酸含量最高，而最高鹽濃度組產(chǎn)酸速度最慢。這種現(xiàn)象是在較高食鹽濃度下，發(fā)酵環(huán)境的高滲透壓會(huì)抑制乳酸菌等微生物的代謝活動(dòng)，而低鹽發(fā)酵能加快泡菜成熟[6]，這與申文熹等[7]的研究結(jié)果相一致。

圖2 不同鹽濃度蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中pH值和總酸的變化Figure 2 Changes of pH and total acid during the fermentation of Radish pickles with different salt concentrations

2.4.2 亞硝酸鹽的變化

泡菜中存在的亞硝酸鹽來(lái)源于蔬菜自帶的硝酸鹽在一些細(xì)菌產(chǎn)生的“硝酸鹽還原酶”作用下，轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽[18]。過(guò)多攝入亞硝酸鹽對(duì)人體有致癌作用，因此亞硝酸鹽是評(píng)價(jià)泡菜產(chǎn)品食用安全的重要指標(biāo)。如圖3所示隨著發(fā)酵的進(jìn)行，前兩天內(nèi)亞硝酸鹽含量顯著增加。2%、5%和8%鹽濃度組分別在發(fā)酵第2天、第4天以及第5天達(dá)到亞硝酸鹽濃度 最 大 值 ，分 別 為 (9.66±0.74)、(10.09±0.25)和(11.62±0.72)mg/kg，均符合國(guó)標(biāo)要求的亞硝酸鹽含量安全標(biāo)準(zhǔn)（20 mg/kg）。鹽濃度越高泡菜亞硝峰出現(xiàn)的時(shí)間越遲，可能是因?yàn)辂}濃度越高對(duì)產(chǎn)硝酸鹽還原酶微生物的代謝產(chǎn)生阻礙作用。到發(fā)酵中后期，各組別亞硝酸鹽含量會(huì)逐漸下降可能是乳酸菌的大量繁殖從而抑制產(chǎn)硝酸鹽還原酶微生物的活性，而酸性條件下這種抑制作用更加明顯[19]。由此證明，在接種發(fā)酵條件下中低鹽發(fā)酵有利于控制泡菜中亞硝酸鹽的產(chǎn)生。

圖3 不同鹽濃度蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的變化Figure 3 Changes of nitrite during the fermentation of Radish pickles with different salt concentrations

2.5 不同鹽濃度接種發(fā)酵蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物及菌落總數(shù)的變化規(guī)律

2.5.1 菌落總數(shù)的變化

鹽濃度對(duì)微生物的生長(zhǎng)的影響本身是一個(gè)多階段且復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)不同鹽濃度組蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中總菌落和乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖4所示：菌落總數(shù)總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，其中2%鹽濃度組在第3天達(dá)到峰值（8.44±0.05)Lg（CFU/mL）而5%和8%鹽濃度組在發(fā)酵第4天時(shí)達(dá)到峰值，數(shù)量相差不大（P＞0.05），隨后明顯下降，可能是在低pH和高濃度有機(jī)酸的環(huán)境下，微生物的生命活動(dòng)受到抑制，再加上在高滲透壓作用下微生物數(shù)量總體下降。總體來(lái)看，鹽濃度越高，菌落總數(shù)越低，但對(duì)于較高鹽濃度組差異并不顯著（P＞0.05）。

2.5.2 乳酸菌的數(shù)量變化

由于直投式發(fā)酵菌株在發(fā)酵初期存在明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，且在低鹽發(fā)酵環(huán)境中這種優(yōu)勢(shì)更加明顯，因此在發(fā)酵初期，所有組別的乳酸菌數(shù)量（圖4）均出現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，這符合黃道梅等[20]采用多菌協(xié)同發(fā)酵泡菜，不同高鹽濃度組蘿卜泡菜在發(fā)酵前期時(shí)乳酸菌含量均上升的結(jié)果。盡管不同鹽濃度組乳酸菌數(shù)量達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)不同但發(fā)酵結(jié)束時(shí)數(shù)量比較接近，可能與植物乳桿菌RS66CD能夠產(chǎn)生一定量的胞外聚合物使其具備優(yōu)良的抗逆性有關(guān)[21]。

2.6 不同鹽濃度接種發(fā)酵蘿卜泡菜風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

2.6.1 有機(jī)酸含量的變化

在泡菜的發(fā)酵過(guò)程中，各種有機(jī)酸的積累是形成泡菜特殊風(fēng)味的重要原因，其中，草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸以及琥珀酸等有機(jī)酸是泡菜發(fā)酵過(guò)程中的主要代謝物，因此對(duì)發(fā)酵過(guò)程中這7種有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。

從發(fā)酵過(guò)程中草酸含量變化（圖5-a）來(lái)看，各組別草酸含量均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01），其中在發(fā)酵后熟階段，2%鹽濃度組下降速率最大，在發(fā)酵第6天，草酸含量降至(0.042 0±0.011 0)mg/g?？赡苁窃诎l(fā)酵后期大量耐酸性微生物大量繁殖并產(chǎn)生較多的醇類物質(zhì)與草酸反應(yīng)生成酯類物質(zhì)[22]，或者被微生物自身利用生成其他物質(zhì)。

如圖4-b所示，原料中DL-酒石酸含量為(0.015 0±0.004 8)g/100 g。隨著發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，2%鹽濃度組的酒石酸含量在發(fā)酵1 d后顯著下降（P＜0.05）隨后升高，發(fā)酵第4天又緩慢下降至(0.008 0±0.005 7)g/100 g。5%和8%鹽濃度組整體呈現(xiàn)緩慢升高再顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。

圖4 不同鹽濃度蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中菌落總數(shù)和乳酸菌的數(shù)量變化Figure 4 Changes in the total number of colonies and the number of lactic acid bacteria during the fermentation of Radish pickles with different salt concentrations

乳酸是泡菜發(fā)酵過(guò)程中提供柔和風(fēng)味的物質(zhì)之一，從乳酸含量的變化（圖5-c）可以看出，各組別原料中乳酸含量為0 g/100g或者其含量低于儀器檢測(cè)限，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各組別泡菜中乳酸含量在發(fā)酵前兩天均先上升后降低。相較于5%和8%鹽濃度組，2%鹽濃度組在發(fā)酵初期，乳酸含量增速較快，可能是在發(fā)酵前半階段主要進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵，接種的乳酸菌在此階段代謝活動(dòng)較快，不會(huì)受到高鹽濃度的抑制，因此代謝產(chǎn)生乳酸的速度較快[23]。在發(fā)酵前期乳酸的含量與鹽濃度呈負(fù)相關(guān)，熊濤等學(xué)者[24]通過(guò)不同鹽濃度對(duì)發(fā)酵圓白菜的菌系代謝變化的研究也證實(shí)了這一結(jié)論。乳酸含量的迅速增高能夠很好地抑制泡菜中包括病原菌在內(nèi)的雜菌的生長(zhǎng)，這對(duì)泡菜的安全性有重要意義。而在發(fā)酵后期由于酯化反應(yīng)生成酯類芳香物質(zhì)抑制乳酸菌的生命活動(dòng)，導(dǎo)致乳酸含量降低[25]。對(duì)于高鹽濃度組，在發(fā)酵后熟階段乳酸含量降低可能是在高鹽濃度的環(huán)境中，某些耐鹽微生物比如酵母菌、霉菌和致病微生物等雖然可以利用蔗糖，但是不能產(chǎn)生乳酸。當(dāng)然在較低pH值和底物不足的環(huán)境下，乳酸菌代謝活動(dòng)受到抑制，也是造成發(fā)酵后期乳酸含量降低的原因之一。

乙酸是泡菜在發(fā)酵過(guò)程中的重要代謝物之一，其主要來(lái)源是微生物代謝，而它又能與醇類物質(zhì)結(jié)合生成酯類，是形成泡菜特殊風(fēng)味的重要物質(zhì)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，各組別泡菜中的乙酸含量(圖5-d)均呈現(xiàn)曲折上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，而2%鹽濃度組速率高于其他兩組，可能因?yàn)樵诎l(fā)酵初始階段，乳酸菌代謝活動(dòng)受到較高鹽濃度發(fā)酵環(huán)境的抑制，產(chǎn)酸速率減慢。

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各組別泡菜中檸檬酸的含量均顯著上升（P＜0.05），圖5-e表明，在發(fā)酵過(guò)程中，鹽濃度越高，泡菜中檸檬酸含量越高，這可能是因?yàn)樵诟啕}濃度下微生物利用檸檬酸的能力減弱。在泡菜的發(fā)酵過(guò)程中，蘋果酸能使泡菜呈現(xiàn)令人愉悅的風(fēng)味。由圖5-f可以看出，2%鹽濃度組蘿卜泡菜中L-蘋果酸總量最高，而8%鹽濃度組在發(fā)酵第4天才檢測(cè)出蘋果酸，這可能與蘋果酸酶的含量有關(guān)，相關(guān)研究報(bào)道證明，蘋果酸可以被微生物細(xì)胞內(nèi)的蘋果酸酶催化成乳酸[26]。

圖5 不同鹽濃度蘿卜泡菜發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的含量變化Figure 5 Changes of organic acid content in Radish pickles with different salt concentrations during fermentation

如圖5-g所示，原料中的琥珀酸含量較低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行各組別均顯著增加（P＜0.01），2%、5%和8%鹽濃度組在分別發(fā)酵第3、5和6天，琥珀酸含量增 加 至 (0.061 8±0.000 2)、(0.005 98±0.001 8)和(0.003 19±0.008 3)g/100g。隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)可能是琥珀酸作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，只是參與微生物的繁殖和代謝，最后生成可溶性鹽導(dǎo)致其含量降低。

2.6.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

泡菜中的含有的各種風(fēng)味物質(zhì)是形成泡菜特殊香味和滋味的原因，其主要是由揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（氨基酸和有機(jī)酸類化合物）構(gòu)成。為了檢測(cè)不同鹽濃度下接種乳酸菌發(fā)酵蘿卜泡菜含有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異，采用SPME-GC-MS檢測(cè)3種成熟后的泡菜樣品，結(jié)果如圖6所示。3種鹽濃度蘿卜泡菜共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)50種，其中包括5種酯類、2種酮類、19種醇類、3種酸類、8種醛類、2種醚類、6種烴類、2種酚類和3種其他類化合物。2%、5%和8%鹽濃度組蘿卜泡菜檢出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分別為29、34和24種。造成不同鹽濃度泡菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類差異的原因可能是泡菜中絕大多數(shù)微生物在高鹽濃度（8%）下受到抑制，發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)種類相對(duì)較少。而2%鹽濃度下的泡菜中接種的乳酸菌快速繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群，從而產(chǎn)生大量乳酸使泡菜酸度急劇下降，不耐酸微生物的繁殖代謝受到影響，造成一些泡菜特殊風(fēng)味物質(zhì)比如酮類和酯類化合物種類較少[27]。

圖6 不同鹽濃度蘿卜泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類相對(duì)含量及物質(zhì)數(shù)量Figure 6 Relative content and quantity of volatile flavor substances in Radish pickles with different salt concentrations

將不同鹽濃度下泡菜中主要揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量變化匯總?cè)绫?所示，在這3種鹽濃度發(fā)酵處理中，醇類物質(zhì)種類最豐富，其中5%鹽濃度組有12種醇類物質(zhì)遠(yuǎn)多于云琳等學(xué)者[28]接種植物乳桿菌和腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）發(fā)酵制備的蘿卜泡菜。醇類化合物相對(duì)含量最高分別為43.91%、46.61%和52.25%。其中又屬芳樟醇和桉葉油醇的含量較高，這兩種醇類物質(zhì)不僅呈現(xiàn)令人愉快的風(fēng)味，還能與酸類物質(zhì)生成更多復(fù)雜的呈味物質(zhì)[29]。3種鹽濃度組蘿卜泡菜中8%鹽濃度組醇類物質(zhì)含量最高，可能是因?yàn)樵谳^高鹽濃度下，耐鹽性強(qiáng)的酵母菌代謝旺盛，大量醇類物質(zhì)積累。但酯類物質(zhì)最少（相對(duì)含量0.29%）可能是乳酸菌代謝受到高滲透壓作用抑制，產(chǎn)生的酸類物質(zhì)較少，從而與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生成的酯類物質(zhì)較少。酸類物質(zhì)在2%鹽濃度泡菜中相對(duì)含量最多，因?yàn)槿樗峋x旺盛，產(chǎn)生較多酸類化合物。醚類物質(zhì)在2%鹽濃度組泡菜中相對(duì)含量最高，其次是5%鹽濃度組。其中4-烯丙基苯甲醚和茴香腦是八角和花椒中主要的揮發(fā)性香氣成分，對(duì)蘿卜泡菜風(fēng)味形成有非常大的貢獻(xiàn)[17]。各組別出現(xiàn)含量差異的原因可能與菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)，不同鹽濃度發(fā)酵處理下存活的微生物種類不同，因此利用相應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)生醚類化合物的能力則不同[30]。5%鹽濃度組含有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類豐富且相對(duì)含量較高。其中酯類物質(zhì)相對(duì)含量較其他兩組更高，它們能在泡菜中呈現(xiàn)怡人的甜味和果香、花香等香氣[25]。二甲基三硫是構(gòu)成泡菜的主體風(fēng)味物質(zhì)，其閾值較低[26]，在低含量下就能產(chǎn)生濃郁的香味，不同鹽濃度泡菜中都檢測(cè)到的該物質(zhì)，該物質(zhì)在5%鹽濃度下的泡菜中相對(duì)含量最高，使得泡菜風(fēng)味更加突出。此外，酮類化合物二-庚酮等能賦予泡菜清香爽口的口感，烴類化合物也是使泡菜具有獨(dú)特風(fēng)味的重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，他們?cè)?%鹽濃度組檢測(cè)出的種類和相對(duì)含量均優(yōu)于其他兩組。

表4 不同鹽濃度蘿卜泡菜中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量Table4 Relative content of main volatile flavor compounds in Radish pickles with different salt concentrations

3 結(jié)論

鹽濃度對(duì)蘿卜泡菜的微生物代謝和感官品質(zhì)具有顯著影響。2%鹽濃度組產(chǎn)酸速度快，且能在最快時(shí)間出現(xiàn)亞硝峰，顯著縮短蘿卜泡菜發(fā)酵成熟時(shí)間，而5%鹽濃度組次之。從微生物數(shù)量變化上來(lái)看，鹽濃度越高，菌落總數(shù)越低。就風(fēng)味物質(zhì)含量變化而言，2%鹽濃度蘿卜泡菜中有機(jī)酸的產(chǎn)生速率更快，2%鹽濃度下微生物能充分利用底物，積累更多的L-蘋果酸和琥珀酸，泡菜的滋味濃郁協(xié)調(diào)；5%鹽濃度組形成的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類最多，其中醇類物質(zhì)高達(dá)12種，烴類、酯類和酚類化合物的種類和相對(duì)含量均多于其余兩組。在感官品質(zhì)方面，8%鹽濃度組泡菜盡管質(zhì)地脆嫩但其滋味過(guò)咸不易被接受，5%鹽濃度在風(fēng)味上略勝一籌，2%鹽濃度組泡菜在色澤和滋味上優(yōu)于其余兩組。綜上所述，將本實(shí)驗(yàn)室自制的乳酸菌菌劑運(yùn)用于傳統(tǒng)蘿卜泡菜發(fā)酵工藝，綜合分析各項(xiàng)指標(biāo)，鹽濃度范圍在2%～5%下泡菜更具備優(yōu)質(zhì)四川泡菜所特有的風(fēng)味和口感。相反，8%鹽濃度為會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)延遲泡菜的成熟且口感較差，這與熊濤學(xué)者采用自然發(fā)酵模式研究不同鹽濃度對(duì)酸菜品質(zhì)的影響所得結(jié)果有一定差異，證明接種發(fā)酵對(duì)降低泡菜中食鹽的添加量有一定積極作用，但仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)確定接種發(fā)酵下蘿卜泡菜最適宜鹽濃度以及研究菌群結(jié)構(gòu)與品質(zhì)變化的關(guān)系。