劉歡 王鑄 董爽 鄒吉祥 金華

(大連民族大學(xué)，大連，116600)(新疆昌吉高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)管理委員會(huì))(大連民族大學(xué))

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一種非蛋白類氨基酸[1]，是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B12等四氫吡咯類化合物的前體物質(zhì)，幾乎能在所有的動(dòng)植物體內(nèi)自主合成[2]。在醫(yī)學(xué)方面，5-氨基乙酰丙酸已作為一種新型光動(dòng)力藥物被廣泛應(yīng)用于治療腫瘤[3]和皮膚疾病[4]，并且取得了良好的效果。近年來(lái)，有研究表明，5-氨基乙酰丙酸能夠提高植物的抗逆性[5]，5-氨基乙酰丙酸可以參與調(diào)節(jié)葉綠素的合成和代謝，促進(jìn)光合作用[6]，能夠有效緩解干旱[7]、鹽堿[8]、低溫[9]等非生物脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的不利影響；Liu et al.[10]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，5-氨基乙酰丙酸通過(guò)提高光合同化作用、增加葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、誘導(dǎo)多種光合基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)甘藍(lán)型油菜生長(zhǎng)；Liu et al.[11]發(fā)現(xiàn)5-氨基乙酰丙酸能夠通過(guò)增強(qiáng)甜菜幼苗的光合性能，增加總氮和甘氨酸甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，緩解鹽度脅迫下瑞士甜菜的氧化損傷；孫萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，5-氨基乙酰丙酸可以顯著提高草莓植株凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)，促進(jìn)光合作用。由于5-氨基乙酰丙酸對(duì)人類和牲畜沒(méi)有毒害作用[13]，并在生態(tài)環(huán)境中易降解、無(wú)殘留，因此，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景[14]。

楊樹(shù)(PopulusL.)是世界上分布最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹(shù)種之一[15]，也是我國(guó)栽培面積最大的樹(shù)種[16]，楊樹(shù)在國(guó)土綠化、農(nóng)田防護(hù)林建設(shè)和工業(yè)用材林建設(shè)等方面具有重要地位[17]。吳屯楊(Populuswutunensis)是由本研究團(tuán)隊(duì)培育的抗逆速生小鉆類楊樹(shù)新品種[18]，在遼西北及新疆等鹽堿、干旱地區(qū)廣泛種植。雖然已有研究證實(shí)5-氨基乙酰丙酸可提高草本植物的抗逆性，但關(guān)于5-氨基乙酰丙酸在林木的應(yīng)用研究較少，且提高楊樹(shù)耐鹽堿能力上的研究還未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)5-氨基乙酰丙酸施用的效果尚不清楚。本試驗(yàn)以吳屯楊幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，研究外源5-氨基乙酰丙酸對(duì)鹽堿脅迫下的吳屯楊幼苗生長(zhǎng)、光合作用、抗氧化酶系統(tǒng)和蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面的影響，以期探索5-氨基乙酰丙酸在提高林木抗逆性的機(jī)制，為吳屯楊在鹽堿條件下的高效栽培提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與脅迫處理

實(shí)驗(yàn)所用材料由大連民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地所種植的樹(shù)齡8 a的吳屯楊枝條培育而成。于2018年4月選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的吳屯楊1年生枝條，在中下部截取20 cm作為插條，扦插于花盆(直徑20 cm)，栽培基質(zhì)選用V(草炭土)∶V(沙子)=1∶1。將扦插苗置于日光溫室內(nèi)同等條件下培育5個(gè)月，培育期間每隔3 d澆1次水。

于2018年9月，選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致、無(wú)病蟲(chóng)害的幼苗進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理：對(duì)照組的根部澆灌去離子水+葉面噴灑去離子水(CK)；處理1根部澆灌鹽堿混合溶液+葉面噴灑去離子水(N)；處理2根部澆灌鹽堿混合溶液+葉面噴灑濃度為50 mg·L-15-氨基乙酰丙酸溶液(NA)。使用500 mL濃度為200 mmol·L-1的M(NaCl)∶M(NaHCO3)=1∶1的溶液對(duì)處理1和處理2植株的根部進(jìn)行澆灌；在鹽堿脅迫后的3 d開(kāi)始進(jìn)行5-氨基乙酰丙酸處理，在上午09:00，每隔兩天對(duì)處理2的植株噴施50 mg·L-15-氨基乙酰丙酸(共7次)，噴施以葉片正反面浸濕并剛有液體下滴為宜。連續(xù)處理15 d后，隨機(jī)選取無(wú)殘缺、無(wú)蟲(chóng)害、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的葉片進(jìn)行試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 指標(biāo)的測(cè)定與方法

于鹽堿脅迫的1、5、10、15 d測(cè)量株高和地徑，并測(cè)定光合指標(biāo)。采用米尺及游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄幼苗的株高和地徑，根據(jù)4次測(cè)定結(jié)果分別計(jì)算鹽堿脅迫1、5、10、15 d幼苗的株高增長(zhǎng)量和地徑增長(zhǎng)量。采用Li-6400便攜式光合測(cè)定儀(Li COR,USA)和配套使用的紅藍(lán)光源葉室測(cè)定楊樹(shù)葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)(Ci)等[19]。

16 d時(shí)取新鮮葉片洗凈擦干，采用丙酮-乙醇混合浸提法[20]測(cè)定葉片中光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)；相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[21]測(cè)定；采用硫代巴比妥酸比色法[22]測(cè)定丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度；采用水浴浸提法[23]測(cè)定脯氨酸(Pro)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用氮藍(lán)四唑光化還原法[24]測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用愈創(chuàng)木酚法[25]測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性；采用紫外吸收測(cè)定法[26]測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。

氣孔特征參考指甲油涂抹印跡法[27]進(jìn)行測(cè)量，使用裝備有照相機(jī)(DFC 300-FX,Leica Corp,Germany)的萊卡光學(xué)顯微鏡(DM2500,Leica Corp,Germany)觀察并拍取照片(面積為0.3 mm×0.45 mm)，利用ArcGIS10.0軟件分別測(cè)量氣孔的長(zhǎng)度、寬度和面積，并統(tǒng)計(jì)每張印跡照片中的氣孔個(gè)數(shù)，計(jì)算氣孔密度；葉片蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)特征使用Quanta 200掃描電子顯微鏡(FEI Corp,USA)觀察并拍取照片[28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)吳屯楊生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表1可知，N處理與CK相比，吳屯楊的株高、地徑增長(zhǎng)量均顯著降低，在處理的15 d分別比CK降低了64.00%、67.44%，說(shuō)明鹽堿脅迫抑制了吳屯楊的生長(zhǎng)；而NA處理的植株株高和地徑增長(zhǎng)量則均高于N處理的植株，分別比N處理增加了171.93%和192.62%，表明噴施5-氨基乙酰丙酸能夠緩解鹽堿脅迫對(duì)吳屯楊幼苗生長(zhǎng)的抑制。

表1 不同處理下吳屯楊幼苗的株高和地徑

2.2 不同處理對(duì)吳屯楊幼苗光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、光合參數(shù)及氣孔特征的影響

由表2可知，N處理與CK相比，鹽堿脅迫顯著降低了吳屯楊幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別比CK下降了22.70%、60.13%、24.63%和24.31%；而NA處理則提高了植株的光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比N處理分別提高了19.81%、102.49%、22.08%和30.46%，說(shuō)明外施5-氨基乙酰丙酸能夠有效促進(jìn)葉片光合色素的合成。

由表3可知，N處理與CK相比，吳屯楊幼苗的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率隨著脅迫時(shí)間增加呈顯著下降趨勢(shì)，胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)；NA處理與N處理相比，植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率顯著提高，胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)顯著下降，表明外施5-氨基乙酰丙酸能夠提高光合效率以抵御脅迫，緩解鹽堿脅迫對(duì)吳屯楊幼苗光合作用造成的不良影響。

表2不同處理的吳屯楊幼苗的光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

mg·g-1

表3 不同處理下吳屯楊幼苗的光合參數(shù)

處理氣孔導(dǎo)度/mmol·m-2·s-105d10d15d胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)/μmol·mol-105d10d15dCK(0.183±0.003)a(0.183±0.004)a(0.182±0.002)a(0.185±0.002)a(209.667±5.185)a(213.333±8.179)a(204.333±6.944)c(208.000±3.742)bN(0.185±0.004)a(0.173±0.002)a(0.160±0.004)b(0.143±0.001)c(216.667±4.497)a(237.000±8.042)a(259.333±7.134)a(289.000±4.243)aNA(0.186±0.001)a(0.185±0.001)a(0.182±0.003)a(0.182±0.002)b(231.000±2.944)a(232.000±2.449)a(234.333±2.867)b(218.667±4.497)b

由表4可知，N處理與CK相比，植株氣孔長(zhǎng)度、寬度、面積和密度分別降低了13.46%、34.33%、30.80%和21.69%，氣孔變小且數(shù)量減少；NA處理與N處理相比，植株的氣孔長(zhǎng)度、寬度、面積和密度分別提高了0.35%、42.91%、10.90%和51.80%，表明外施5-氨基乙酰丙酸能夠通過(guò)擴(kuò)大氣孔和增加氣孔數(shù)量的方式提高植株光合作用，達(dá)到緩解鹽堿脅迫對(duì)植物光合作用造成的不良影響。

表4 不同處理下吳屯楊幼苗的氣孔特征

2.3 不同處理對(duì)吳屯楊幼苗抗氧化酶活性及脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

抗氧化酶系統(tǒng)被認(rèn)為是植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)重要的防御體系，抗氧化酶活性之間的平衡是確定超氧自由基和H2O2的穩(wěn)態(tài)水平的關(guān)鍵。

由表5可知，N處理與CK相比，吳屯楊幼苗的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的活性升高；NA處理與N處理相比，吳屯楊幼苗的抗氧化酶活性顯著升高，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的活性分別比N處理升高了34.60%、25.45%和20.57%，表明鹽堿脅迫下吳屯楊幼苗通過(guò)提高抗氧化酶活性來(lái)抵御鹽堿脅迫，外源5-氨基乙酰丙酸處理能夠顯著提高鹽堿脅迫下吳屯楊幼苗酶促防御能力。

表5 不同處理下吳屯楊幼苗的抗氧化酶活性及脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

脯氨酸是植物體內(nèi)重要的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠防止?jié)B透脅迫條件下蛋白質(zhì)的脫水變性，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡，防止水分散失。N處理與CK相比，吳屯楊幼苗脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了30.47%；NA處理與N處理相比，植株的脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了56.91%，表明噴施5-氨基乙酰丙酸可以通過(guò)提高脯氨酸含量來(lái)平衡胞內(nèi)滲透勢(shì)，從而減輕鹽堿脅迫造成的傷害。

2.4 不同處理對(duì)吳屯楊幼苗相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響

相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度變化是反映細(xì)胞膜受損傷程度的重要指標(biāo)。由表6知，N處理與CK相比，吳屯楊幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，比CK分別增加了32.71%和88.43%；NA處理則降低了吳屯楊幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，NA處理比N處理相比，相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛質(zhì)量摩爾濃度分別降低了13.14%和32.97%，表明噴施5-氨基乙酰丙酸能夠保護(hù)鹽堿脅迫下的吳屯楊幼苗的質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且能通過(guò)降低丙二醛質(zhì)量摩爾濃度緩解鹽堿脅迫對(duì)細(xì)胞膜的損害。

表6 不同處理的吳屯楊幼苗相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度

2.5 不同處理對(duì)吳屯楊幼苗葉片蠟質(zhì)的影響

植物表皮蠟質(zhì)具有親脂性，是植物適應(yīng)生物和非生物脅迫的有效成分。為了探究外源ALA對(duì)鹽堿脅迫下吳屯楊葉片蠟質(zhì)的影響，使用掃描電子顯微鏡觀察了其晶體結(jié)構(gòu)。由圖1可知，CK處理植株葉片蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；N處理后葉片蠟質(zhì)破碎；NA處理的植株蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的破碎情況得到了緩解，表明外施5-氨基乙酰丙酸對(duì)鹽堿脅迫下的吳屯楊幼苗的蠟質(zhì)有修復(fù)作用。

圖中A、B和C分別為CK、N和NA處理下吳屯楊幼苗的蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)。

3 討論

鹽堿脅迫下，植物的生長(zhǎng)狀態(tài)受到不良影響，植株的發(fā)育受到抑制，會(huì)造成植株矮小、生物量降低、葉片數(shù)量減少等現(xiàn)象[29]，本研究表明，鹽堿脅迫下吳屯楊幼苗的生長(zhǎng)受到抑制，噴施5-氨基乙酰丙酸后，鹽堿脅迫下的吳屯楊幼苗的株高和地徑顯著增加，表明外施5-氨基乙酰丙酸可以緩解鹽堿脅迫對(duì)植株生長(zhǎng)造成的傷害。葉綠素是植物光合作用中極為重要的因素，葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接決定著植物的光合能力，同時(shí)也是衡量植物耐鹽堿能力的重要指標(biāo)。植物光合能力與葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比。植物的光合作用在鹽脅迫下受到非氣孔限制因素以及氣孔限制因素等各種因素的影響[30]。氣孔是作物與外界環(huán)境進(jìn)行碳、水交換的重要通道。外施5-氨基乙酰丙酸可以提高西瓜葉片的凈光合速率[31]，說(shuō)明5-氨基乙酰丙酸可以通過(guò)促進(jìn)氣孔的開(kāi)放來(lái)提高植物的光合能力。本研究結(jié)果表明，5-氨基乙酰丙酸能有效提高鹽堿脅迫下葉片光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度，增加氣孔數(shù)量，增大氣孔面積，說(shuō)明外源5-氨基乙酰丙酸能增強(qiáng)吳屯楊幼苗吸水與運(yùn)輸能力，提高光合底物傳導(dǎo)能力，進(jìn)而提高光合效率。胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)的大小取決于植物周圍空氣中的CO2摩爾分?jǐn)?shù)、葉片的氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度和葉肉細(xì)胞的光合活性[32]。在本研究中，鹽堿脅迫下，植株胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)上升，外施5-氨基乙酰丙酸后植株胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)的上升趨勢(shì)得以緩解，由于鹽堿脅迫使葉肉細(xì)胞的光合活性降低。

蠟質(zhì)對(duì)植物葉片的保水性、抗輻射性和器官分化等方面都有重要的意義。表皮蠟質(zhì)是植物與環(huán)境接觸的第一道屏障，當(dāng)遇到環(huán)境中的不利因子時(shí)，表皮蠟質(zhì)能夠使其自身的晶體結(jié)構(gòu)及理化特性發(fā)生改變，構(gòu)建防御機(jī)制，以減少不利環(huán)境因素對(duì)植株的影響。有研究表明在鹽堿脅迫下，蠟質(zhì)表現(xiàn)出破碎狀態(tài)，對(duì)植物的保水性及生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重的影響[40]。本研究結(jié)果表明，吳屯楊幼苗在鹽堿脅迫后蠟質(zhì)呈破碎狀態(tài)，外施5-氨基乙酰丙酸后緩解了蠟質(zhì)的破碎狀況，因此推測(cè)5-氨基乙酰丙酸能夠通過(guò)對(duì)鹽堿脅迫植株蠟質(zhì)的修復(fù)提高植株的保水性，從而提高其抗鹽堿能力。

4 結(jié)論

吳屯楊幼苗由于鹽堿脅迫導(dǎo)致其光合色素合成受到抑制，光合能力下降，丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度和相對(duì)電導(dǎo)率增加，抗氧化酶活性增強(qiáng)，葉片表面蠟質(zhì)呈破碎狀態(tài)，表明吳屯楊具有一定的耐鹽堿能力，但其自身也受到了嚴(yán)重的損傷。外施5-氨基乙酰丙酸能夠提高鹽堿脅迫下吳屯楊的光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增強(qiáng)光合作用，保護(hù)光合系統(tǒng)，降低丙二醛的質(zhì)量摩爾濃度和相對(duì)電導(dǎo)率，提高SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性和脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性和滲透勢(shì)平衡，有效緩解鹽堿脅迫對(duì)植物的氧化傷害，修復(fù)蠟質(zhì)。