袁裕超 趙曉佳 孫玉鳳 談家金

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)原產(chǎn)于北美地區(qū)，目前廣泛分布于北美、歐洲以及東亞等地區(qū)。1982年在我國南京紫金山首次報(bào)道了松材線蟲病的發(fā)生[1]，根據(jù)國家林業(yè)局2021年第5號(hào)公告，松材線蟲病疫情突破了其適生區(qū)北界，目前已擴(kuò)散至遼寧省20個(gè)縣[2]。

在線蟲病害發(fā)展過程中，往往伴隨著伴生細(xì)菌的作用。早在1901年，已經(jīng)有了細(xì)菌和線蟲共同侵染造成病害的報(bào)道[3]，隨著線蟲病害研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明細(xì)菌與某些線蟲密切相關(guān)，由根結(jié)線蟲(Meloidigyneincognita)和青枯病菌(Pseudomonassolanacearum)共同侵染造成的青枯病萎蔫程度比單獨(dú)接種時(shí)嚴(yán)重[4]，在煙草根結(jié)線蟲的發(fā)生上，也有相似報(bào)道，研究者認(rèn)為其病害發(fā)生與土壤微生物群落之間的相互作用息息相關(guān)[5]，并已有幾種相關(guān)細(xì)菌被報(bào)道[6]。某些線蟲和細(xì)菌之間還存在著共生關(guān)系，例如殺螺線蟲(Onchocercidae)和沃爾巴克氏菌(Wolbachia)，沃爾巴克氏菌為殺螺線蟲提供三磷酸腺苷(ATP)，殺螺線蟲破壞寄主免疫系統(tǒng)，以便于沃爾巴克氏菌寄生[7]。有學(xué)者提出松材線蟲病是一種由線蟲和細(xì)菌共同侵染引起的復(fù)合侵染病害[8]，在病害發(fā)生過程中，伴生細(xì)菌通過產(chǎn)生低濃度的有致蔫活性的苯乙酸來促進(jìn)松材線蟲的繁殖[9-10]。在松樹被松材線蟲侵染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有殺線活性的萜烯類物質(zhì)來抵御線蟲的侵入，假單胞菌(Pseudomonassp.)作為松材線蟲的伴生細(xì)菌，在其體內(nèi)具有一條完整的萜烯類生物降解途徑[11]，從而使得線蟲能適應(yīng)松樹體內(nèi)環(huán)境，表明了松材線蟲伴生細(xì)菌在提高松材線蟲生態(tài)適應(yīng)能力方面的潛力。

耐寒性作為有機(jī)體暴露在低溫下的存活能力，也是絕大多數(shù)生物具備的能力[12]，線蟲也不例外[13]。研究表明，低溫下松材線蟲的存活和繁殖能力均會(huì)受到影響[14]，松材線蟲具有溫度適應(yīng)性，在不同溫度培養(yǎng)下，其體型最終會(huì)趨于穩(wěn)定[15]，低溫誘導(dǎo)可以使松材線蟲幼蟲進(jìn)入擴(kuò)散型三齡蟲態(tài)(DL3)以適應(yīng)低溫[16]。但除去DL3外，是否存在其他因素會(huì)影響松材線蟲的低溫適應(yīng)能力還未有過相關(guān)報(bào)道。為了適應(yīng)寒冷的環(huán)境，線蟲會(huì)進(jìn)行一系列生理生化反應(yīng)，在體內(nèi)大量積累脂滴和糖類，這些反應(yīng)也是為隨后的生長季節(jié)保存資源。脂肪酸是脂質(zhì)的組成物質(zhì)，而且能降低水結(jié)冰對線蟲的傷害[17]，除此之外，甘油和海藻糖也可能與線蟲的低溫適應(yīng)性有關(guān)[18]，但就伴生細(xì)菌在松材線蟲低溫適應(yīng)性中的作用還未有人探究。針對目前松材線蟲病疫情擴(kuò)散形勢，研究松材線蟲低溫適應(yīng)性相關(guān)影響因素刻不容緩。因此，本研究將從低溫適應(yīng)性的角度分析松材線蟲病擴(kuò)散的動(dòng)力因子。

1 材料與方法

1.1 供試松材線蟲蟲株和伴生細(xì)菌菌株

本試驗(yàn)所用的松材線蟲蟲株為GD19、AH23和LN15，分別采集于云南松、落葉松和馬尾松，采集地點(diǎn)、時(shí)間和寄主見表1。采集的松材線蟲蟲株樣品放置在冰箱內(nèi)4 ℃長期保存，所用伴生細(xì)菌菌株從松材線蟲蟲體上分離的蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)(GD1)，并放置在冰箱內(nèi)-20 ℃長期保存。

表1 不同地理種群松材線蟲寄主以及采集地點(diǎn)時(shí)間

1.2 線蟲、細(xì)菌的活化與培養(yǎng)

取出冰箱內(nèi)的松材線蟲，接種到剛長滿灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平面上，在溫度25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，待線蟲將菌絲取食盡，用貝爾曼漏斗法分離線蟲。取出冰箱內(nèi)保存的甘蠟樣芽胞桿菌，吸取400 μL菌液于20 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃，200 r/min黑暗條件下?lián)u培8 h，搖培后取出，在超凈工作臺(tái)劃線分離，在溫度25 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落，重復(fù)搖培一次，獲得活化細(xì)菌。

1.3 線蟲與細(xì)菌的預(yù)處理

將分離得到的線蟲放入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心3 min，去除上清后用0.1%硫酸鏈霉素[19]處理1 h，隨后用無菌水清洗蟲液，重復(fù)3次；將細(xì)菌放入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心3 min，去除上清，用無菌水清洗3次。

將線蟲懸浮液體積定容至10 mL，搖勻后吸取20 μL蟲液，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)5次取其均值計(jì)算線蟲懸浮液濃度；用平板涂布計(jì)數(shù)法和紫外分光光度計(jì)法[20]對細(xì)菌濃度進(jìn)行測定。

1.4 經(jīng)菌株GD1處理后線蟲存活率的測定

將濃度為5 000條/mL的3個(gè)不同種源地松材線蟲懸浮液分別1 mL，然后分別與1 mL細(xì)菌濃度為1×107菌落/mL細(xì)菌GD1懸浮液等體積混合作為處理組；以等濃度線蟲懸浮液和無菌水混合的為對照組。每組設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。將兩組都置于溫度10 ℃下，每隔4 d在顯微鏡下觀察線蟲存活情況，以針刺法判斷線蟲是否存活，將無反應(yīng)者判斷為死亡，統(tǒng)計(jì)線蟲存活率。

1.5 經(jīng)菌株GD1處理后線蟲繁殖力的測定

將濃度為1 000條/mL的3個(gè)不同種源地松材線蟲懸浮液分別1 mL，然后分別與1 mL細(xì)菌濃度為1×107菌落/mL細(xì)菌GD1懸浮液等體積混合，搖勻后吸取1 mL蟲液接種到長滿灰葡萄孢的60 mm無菌培養(yǎng)皿上，作為處理組；以等濃度線蟲懸浮液和無菌水混合的為對照組。每組設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。置于15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)14 d后，處理組線蟲取食完灰葡萄孢時(shí)，將兩組分別用貝爾曼漏斗法分離并計(jì)數(shù)。

1.6 經(jīng)菌株GD1處理后AH23蟲株脂肪酸質(zhì)量濃度的測定

將1 mL蟲株濃度為20 000條/mL的AH23蟲株懸浮液與1 mL細(xì)菌濃度為1×107菌落/mL細(xì)菌GD1懸浮液等體積混合作為處理組；以等濃度線蟲懸浮液和無菌水混合的為對照組。將每管蟲液置于10 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置48 h后取出，減壓抽干，加入0.5 mL石油醚-乙醚混合液，渦旋后靜置1 h，放入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心1 min；加入0.25 mL氫氧化鉀-甲醇溶液，渦旋振蕩，靜置1 h；隨后再次振蕩，加入0.25 mL去離子水，靜置30 min分層；再放入離心機(jī)內(nèi)，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心2 min，去上清液，用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫7890A+5975C)對每管蟲液中線蟲進(jìn)行脂肪酸測定[21]，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)通過IBM SPSS Statistics 24獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株GD1對蟲株存活率及繁殖力的影響

由表2可知，蟲株AH23、LN15在伴生細(xì)菌GD1作用下，其在低溫10 ℃下的存活率有了顯著提高，但GD1對GD19的低溫存活率無顯著影響。

在處理時(shí)間內(nèi)，處理和對照組的線蟲存活率呈下降趨勢。從第4 d開始，蟲株AH23和LN15處理組與對照組的存活率即表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，這種差異一直維持到處理后第20 d。第4 d時(shí)，AH23處理組和對照組的存活率分別為87.9%和72.4%；LN15處理組和對照組的存活率分別為84.9%和66.9%。第20 d時(shí)，AH23處理組和對照組的存活率分別為77.5%和57.1%；LN15分別為75.7%和58.4%。蟲株GD19處理組在供試時(shí)間內(nèi)，與對照組線蟲的存活率均無顯著差異。

AH23、LN15蟲株在伴生細(xì)菌GD1作用下，繁殖力有了顯著提高，但GD1對GD19的低溫繁殖力無顯著影響。在溫度15 ℃，培養(yǎng)14 d后，AH23處理組和對照組的蟲量分別為1 608、1 272條，LN15處理組和對照組的蟲量分別為1 504、1 112條，均達(dá)到了極顯著差異(P<0.01)；GD19處理組和對照組的蟲量分別為1 700、1 804條，兩者無顯著差異。

表2 低溫下不同處理的松材線蟲存活率和繁殖量

處理不同處理不同時(shí)間蟲株LN15的存活率/%04d8d12d16d20d繁殖量/條LN15+GD1100(84.91±1.82)A(80.72±1.44)A(80.48±0.77)A(77.11±0.91)A(75.72±0.91)A(1504±45.75)ALN15+H2O100(66.85±1.17)B(66.61±1.62)B(61.12±0.91)B(60.28±0.39)B(50.40±0.66)B(1112±51.41)B

處理不同處理不同時(shí)間蟲株GD19的存活率/%04d8d12d16d20d繁殖量/條GD19+GD1100(86.56±1.07)a(86.23±0.86)a(80.80±1.05)a(79.17±1.18)a(76.59±0.43)a(1700±46.65)aGD19+H2O100(88.30±0.91)a(87.91±0.25)a(81.81±0.76)a(77.70±0.54)a(76.07±1.26)a(1804±97.06)a

2.2 菌株GD1對AH23蟲株體內(nèi)脂肪酸質(zhì)量濃度的影響

通過GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀測定后，AH23蟲株體內(nèi)脂肪酸共獲得28種，其中，十八碳二烯酸質(zhì)量濃度最高，癸酸質(zhì)量濃度最低，處理組和對照組兩種脂肪酸質(zhì)量濃度均無顯著差異。

由表3可知，處理組與對照組各大類脂肪酸(總脂肪酸、不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸)質(zhì)量濃度無明顯差異，處理組總脂肪酸質(zhì)量濃度為348.93 mg·L-1，其中飽和脂肪酸(SFA)質(zhì)量濃度為97.19 mg·L-1，不飽和脂肪酸(UFA)質(zhì)量濃度為251.74 mg·L-1；對照組總脂肪酸質(zhì)量濃度為329.28 mg·L-1，其中飽和脂肪酸質(zhì)量濃度為95.12 mg·L-1，不飽和脂肪酸質(zhì)量濃度為234.16 mg·L-1。

通過SPSS對脂肪酸數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)菌株GD1處理后，蟲株AH23共有6種脂肪酸質(zhì)量濃度發(fā)生顯著變化，其中，(Z)-9-十六碳烯酸、(Z)-11-二十碳烯酸、(Z)-5,8,11,14-二十碳四烯酸和(Z)-13,16-二十二碳二烯酸質(zhì)量濃度升高((Z)表示脂肪酸立體異構(gòu)體的構(gòu)型為順式異構(gòu)體)，而辛酸和十五烷酸質(zhì)量濃度降低。菌株GD1處理后，蟲株AH23的不飽和脂肪酸(Z)-5,8,11,14-二十碳四烯酸的質(zhì)量濃度升高為44.55 mg·L-1，而對照組為42.90 mg·L-1，其差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，其余幾種脂肪酸差異均為顯著水平(P>0.05)。

表3 不同處理的AH23蟲株脂肪酸的質(zhì)量濃度

3 結(jié)論與討論

松材線蟲病作為一種對松樹具有毀滅性威脅的重大病害，自傳入我國以來不斷擴(kuò)散，近幾年已擴(kuò)散至我國北方部分省份，給我國森林安全帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。關(guān)于松材線蟲的文獻(xiàn)資料證明伴生細(xì)菌在松材線蟲病發(fā)病過程中扮演重要作用[8，22-23]；溫度是影響松材線蟲擴(kuò)散的重要影響因素，松材線蟲耐寒性可通過馴化等手段得到提高[24]；通常把存活率和繁殖力作為評價(jià)松材線蟲活力的重要指標(biāo)[25-26]；伴生細(xì)菌能有效提高線蟲在逆境中的存活和繁殖能力，如大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)胞囊內(nèi)外的細(xì)菌能提高其在土壤中長期存活的能力[27]；從松材線蟲上分離到具有較強(qiáng)致蔫活性的假單胞菌能促進(jìn)松材線蟲的繁殖[23]；在外界條件不適宜線蟲存活時(shí)，伴生細(xì)菌能協(xié)助松材線蟲度過逆境，包括提高松材線蟲的抗氧化能力以及對松樹防衛(wèi)反應(yīng)代謝產(chǎn)物萜類物質(zhì)的拮抗活性等[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在伴生細(xì)菌GD1作用下，AH23和LN15蟲株的低溫存活率和繁殖力均有顯著提高，該結(jié)果與早先研究者在研究熒光假單胞菌(P.fluorescens)對松材線蟲乙醇適應(yīng)性的影響結(jié)果相似[30]，均表現(xiàn)了伴生細(xì)菌能顯著提高松材線蟲的環(huán)境適應(yīng)能力。但菌株GD1對蟲株GD19的低溫存活率和繁殖力均無顯著影響，這是由于GD1作用的特異性。

由于脂肪酸熔點(diǎn)較低以及其維持細(xì)胞脂質(zhì)膜在低溫環(huán)境中的流動(dòng)性，脂肪酸經(jīng)常作為研究生物低溫適應(yīng)性的指標(biāo)[31-33]。菌株GD1對蟲株AH23的存活率和繁殖力均有顯著提高，因此本研究通過研究GD1對AH23蟲體內(nèi)脂肪酸質(zhì)量濃度的影響，分析菌株GD1對松材線蟲低溫適應(yīng)能力的影響。低溫下，菌株GD1對AH23蟲體內(nèi)總不飽和脂肪酸的質(zhì)量濃度提高具有促進(jìn)作用，其中4種不飽和脂肪酸的質(zhì)量濃度升高顯著，不飽和脂肪酸質(zhì)量濃度的提高是線蟲越冬時(shí)的應(yīng)急反應(yīng)[34]，Liu et al.[17]也認(rèn)為不飽和脂肪酸質(zhì)量濃度的提高有助于松材線蟲低溫存活力的提升[17]。不過關(guān)于線蟲體內(nèi)質(zhì)量濃度升高最為顯著的(Z)-5,8,11,14-二十碳四烯酸在線蟲低溫適應(yīng)性中的作用還值得進(jìn)一步研究。冬季松材線蟲由于周圍環(huán)境的變化，會(huì)不斷積累脂肪酸，使得體內(nèi)脂肪酸總量遠(yuǎn)超夏季松材線蟲體內(nèi)的脂肪酸總量[17]，但是從本研究的脂肪酸總量來看并沒有顯著的提高，這是因?yàn)榫闓D1的處理效應(yīng)較弱所導(dǎo)致。

綜上所述，低溫下，菌株GD1有助于促進(jìn)線蟲分解體內(nèi)的硬脂酸為線蟲提供更多的能量以應(yīng)對溫度的變化，另一方面促進(jìn)體內(nèi)部分不飽和脂肪酸的生成，提高細(xì)胞流動(dòng)性，使其在較低溫度中保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而使得線蟲在較低溫度下能更好地存活和繁殖。但菌株GD1的作用具有特異性，且其對總脂肪酸的處理效應(yīng)較弱。