余科 麻智芳 安苗 羅均 黃勝 梁志強(qiáng) 邵儉 潘秋芝任芳 龍金梅

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025;2.貴州省黔南州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧水產(chǎn)所,都勻 558000;3.貴州省從江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,從江 557400;4.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所,長(zhǎng)沙 410153;5.貴州省錦屏縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,錦屏 556700)

鯉(Cyprinus carpioLinnaeus)是一種有著幾千年的文化史和馴養(yǎng)史的魚(yú)類(lèi),在全球100多個(gè)國(guó)家進(jìn)行養(yǎng)殖,產(chǎn)量居世界的第四位和中國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的第四位[1,2]。鯉亞種的分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系多有爭(zhēng)議,Kirpichnikov[3]基于形態(tài)差異提出外高加索鯉C.c.carpio、中亞鯉C.c.aralensis、遠(yuǎn)東鯉C.c.haematopterus和東南亞鯉C.c.viridiviolaceus四個(gè)亞種,而后外高加索鯉和中亞鯉被證實(shí)有共同祖先[4],合用C.c.carpio一個(gè)亞種名[5]。東南亞鯉的有效性同樣受到質(zhì)疑[6],Steffens[7]認(rèn)為它可能來(lái)自中國(guó)。Balon[8]基于形態(tài)和生理特征只認(rèn)可歐洲鯉和東亞鯉2個(gè)野生亞種,伍獻(xiàn)文[9]基于形態(tài)和地理分布差異,提出外來(lái)的西鯉、遠(yuǎn)東鯉和華南鯉3個(gè)亞種,并成為我國(guó)鯉魚(yú)資源調(diào)查中關(guān)于形態(tài)和分類(lèi)的主要依據(jù),分子遺傳學(xué)研究也支持華南鯉是遠(yuǎn)東鯉分離的一個(gè)亞種[10—12]。由于地理隔離、適應(yīng)性突變積累、自然和人類(lèi)的選擇壓力綜合作用,鯉已經(jīng)發(fā)展出許多種群和品系[13],我國(guó)擁有世界上數(shù)量最多的鯉天然種群、馴化品系和人工品種[14],其中從江田魚(yú)C.c.congjiangensis[15]、湖南呆鯉[16]、廣西金邊鯉C.c.var.jinbian[17]、曬江鯉[17]和桂林禾花鯉[18]等地方性稻田鯉備受人們關(guān)注,并在傳統(tǒng)稻魚(yú)共生系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。

從江縣隸屬貴州省黔東南苗族侗族自治州,地處都柳江中下游,周邊與榕江、黎平、廣西融水和三江等縣接壤,東北部與錦屏、湖南的通道和靖州等縣比鄰,是我國(guó)南方湘黔桂苗、侗族聚居的核心區(qū),少數(shù)民族風(fēng)情獨(dú)特,稻田鯉馴養(yǎng)已有上千年[19,20]。根據(jù)外形和體色有烏鯉、荷包鯉和火鯉等當(dāng)?shù)厮追Q(chēng)品種[19,21],它們具有性情溫順、抗病力強(qiáng)、活動(dòng)力弱和不善跳躍等特點(diǎn),在稻田淺水環(huán)境不易逃遁,統(tǒng)稱(chēng)“呆鯉”或“田魚(yú)”,又因以稻田禾花為食而稱(chēng)“禾花魚(yú)”,現(xiàn)今許多村寨現(xiàn)仍延續(xù)著自繁自養(yǎng)自留種的繁養(yǎng)體系。本地鯉與糯禾構(gòu)成了一種稻魚(yú)共生和魚(yú)米同收的生態(tài)農(nóng)業(yè)模式,2011年從江侗鄉(xiāng)稻魚(yú)鴨復(fù)合系統(tǒng)獲聯(lián)合國(guó)“全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)”授牌,融水田鯉和從江田魚(yú)等先后獲得全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志,極大地促進(jìn)了稻田鯉的養(yǎng)殖利用。然而,隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的應(yīng)用和大量外來(lái)鯉品種涌入[17,22,23],稻田本地鯉的生存受到嚴(yán)重威脅[24,25],種質(zhì)面臨混雜風(fēng)險(xiǎn)。

目前,從江及周邊苗侗族地區(qū)稻田鯉的種質(zhì)特性研究步伐不斷加快,袁振興[26]研究了都柳江野鯉的遺傳多樣性,郭梁等[15]將從江田魚(yú)與青田田魚(yú)C.c.qingtianensis進(jìn)行了形態(tài)學(xué)對(duì)比分析,兩種“田魚(yú)”在形態(tài)上明顯區(qū)別于其他鯉魚(yú)種群或品系,廣西稻田鯉的遺傳結(jié)構(gòu)的研究也取得了一定成果[17,18,27,28]。然而從江及周邊苗侗族地區(qū)稻田鯉的遺傳背景我們還知之甚少,分類(lèi)地位及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍不確定,嚴(yán)重阻礙了其種質(zhì)保護(hù)和育種利用。系統(tǒng)發(fā)育分析可闡明魚(yú)類(lèi)種群之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,揭示種群和品系鮮為人知的混雜史,有助于遺傳育種和種質(zhì)保護(hù)工作[14],mtDNA是系統(tǒng)發(fā)育研究中最常用的遺傳工具,細(xì)胞色素b(Cytb)是系統(tǒng)發(fā)育分析中最常用的基因區(qū)[11]。為此,本文基于線粒體Cytb基因標(biāo)記技術(shù),對(duì)從江及鄰近6個(gè)縣稻田鯉的遺傳組成及系統(tǒng)關(guān)系開(kāi)展研究,揭示傳統(tǒng)稻魚(yú)復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)中鯉的種質(zhì)特征,旨在為鑒定與評(píng)價(jià)這一獨(dú)特的農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

稻田鯉分別采自貴州、廣西和湖南3省的從江、榕江、黎平、錦屏、三江、靖州和通道等7個(gè)縣22個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)28個(gè)村寨(表1和圖 1)。其中,從江縣全境設(shè)置12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)16個(gè)村寨;榕江、黎平和錦屏3縣設(shè)置6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)7個(gè)村寨;廣西三江縣設(shè)置2個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)3個(gè)村寨;湖南的靖州和通道2縣設(shè)置2個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)2個(gè)村。每個(gè)村寨盡量選取有自繁自育自留種習(xí)慣的1家農(nóng)戶,放低稻田水位徒手捉魚(yú),根據(jù)捕獲鯉魚(yú)多寡從中隨機(jī)挑選尾數(shù)不等的活魚(yú)樣品?，F(xiàn)場(chǎng)測(cè)量體長(zhǎng)和體重等常規(guī)生物學(xué)指標(biāo),取背部肌肉3—5 g浸泡于95%乙醇溶液試管中,置于保鮮冰盒回校后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling Site

表1 樣品采集信息Tab.1 Sample collection information

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

提取DNA 利用DNA提取試劑盒(北京天根)提取肌肉樣品基因組DNA,通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其完整性,再利用紫外分光光度計(jì)(Thermo Nano Drop 2000C)測(cè)定其吸光值。最后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物的篩選與PCR的擴(kuò)增Cytb擴(kuò)增引物的序列為L(zhǎng)14724:5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′,H15915:5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′[29],送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL:模板DNA 2.5 μL,2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物分別為1.25 μL,剩余體積用雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3min,94℃變性40s,52.5℃退火40s,72℃延伸50s,重復(fù)35個(gè)循環(huán),最后再72℃終延伸7min,4℃保存?zhèn)溆?。通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn),選擇特異性強(qiáng)的樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)得的上下游序列利用DNAStar5.0軟件包中的SeqMan進(jìn)行拼接并手工校對(duì)。從NCBI上下載廣西禾花鯉(MK088487)完整Cytb基因序列,比對(duì)保留相同序列長(zhǎng)度。運(yùn)用Mega6.06軟件[30]對(duì)不同序列間的堿基組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì),基于K2-P模型計(jì)算群體間的遺傳距離[31]評(píng)價(jià)遺傳差異,收集NCBI基因庫(kù)中國(guó)內(nèi)外鯉的Cytb基因序列與本研究單倍型序列,基于K2-P模型構(gòu)建不同單倍型間的NJ(Neighbor-Joining)和MP(Maximum parsimony)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),同時(shí)運(yùn)用MrBayes 3.2.7[32]構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)樹(shù)(Bayesian inference,BI),循環(huán)運(yùn)算設(shè)置10000000代,每隔1000代進(jìn)行樣本抽樣,運(yùn)算停止后用TreeGraph 2.15.0[33]繪制系統(tǒng)發(fā)育圖。利用Network5.0軟件[34],以中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法(MJ,Median-joining networks),按照單倍型頻率繪制神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖,展示單倍型之間的衍生和進(jìn)化關(guān)系。用DnaSP 5.10軟件計(jì)算單倍型數(shù)(Number of haplotypes,H)、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,π)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目(Number of polymorphic sites,S)和平均核苷酸差異(Mean number of pairwise differences,K)等多樣性評(píng)價(jià)參數(shù)。運(yùn)用Arlequin3.5軟件[35]進(jìn)行變異分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA),檢測(cè)遺傳變異來(lái)源,并計(jì)算群體間的分化系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 稻田鯉Cyt b基因的堿基組成和單倍型分布

447條長(zhǎng)度為1141 bp的Cytb基因同源序列,共檢測(cè)出54個(gè)變異位點(diǎn),無(wú)堿基的插入和缺失,有5個(gè)顛換和49個(gè)轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換與顛換比為11.23,轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在堿基G與A之間,占總變異的48.1%,略高于T與C轉(zhuǎn)換比的42.6%。堿基T(U)、C、A、G的平均含量分別是26.3%、29.9%、29.9%、14.0%,A+T的平均含量為56.2%大于 C+G 的平均含量43.9%。共界定了29種單倍型(MW683933—MW 683961),單倍型的分布見(jiàn)表 2,其中獨(dú)有的單倍型18個(gè),共享的11個(gè)。從江群體擁有最多的單倍型(19)和獨(dú)享單倍型(8),與周邊5個(gè)稻田群體有11個(gè)共享,Hap1、hap3-hap5和hap8是其優(yōu)勢(shì)單倍型。榕江群體無(wú)獨(dú)有單倍型,廣西三江有1個(gè),黎平有4個(gè),錦屏2個(gè),湖南有3個(gè)。Hap3、hap5、hap8、hap11、hap15和hap16在6個(gè)稻田鯉群體間廣泛分布,代表296尾個(gè)體,占總樣本數(shù)的66.22%。

2.2 稻田鯉的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及單倍型神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖

以鯽Carassius auratus auratus和三角鯉C.multitaeniata為外群,29種單倍型與歐亞鯉的39條Cytb基因序列構(gòu)建NJ、MP和BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),聚類(lèi)結(jié)果基本一致,其中MP系統(tǒng)樹(shù)見(jiàn)圖 2。

68條鯉Cytb基因序列(1124 bp)以100%置信度聚在一起,嚴(yán)格劃分為2大譜系(Clades)。Clade A由4個(gè)單倍型和歐洲鯉的4條序列以98%置信度聚類(lèi),下分2個(gè)亞支subclades(a1和a2),hap22及其衍生的3個(gè)單倍型組成a2,它們隸屬歐洲鯉亞種。Clade B由剩余的25個(gè)單倍型和亞洲的35條鯉序列以64%置信度構(gòu)成,其下分為7個(gè)亞支,其中b1、b3、b4和b5亞支中含17個(gè)單倍型,它們分別與珠江野鯉、元江野鯉、都柳江野鯉、紅河的華南鯉、廣東大肚鯉Big-belly carp、金邊鯉和桂林禾花鯉等聚類(lèi),分類(lèi)上屬華南鯉亞種;b2、b6和b7亞支中8個(gè)單倍型與日本鯉霞浦湖鯉、長(zhǎng)江野鯉、興國(guó)紅鯉C.c.var.xingguoensis、荷包紅鯉C.c.var.wuyuanen-sis、日本錦鯉C.c.Koi、青田田魚(yú)和俄羅斯散鱗鏡鯉Russian scattered scaled mirror carp聚類(lèi),屬遠(yuǎn)東鯉亞種。

結(jié)合表 2統(tǒng)計(jì),歐洲鯉亞種4個(gè)單倍型魚(yú)的33尾樣品分布于除錦屏外的5個(gè)群體,三江(15)和從江(10)的數(shù)量最多;遠(yuǎn)東鯉亞種8個(gè)單倍型魚(yú)的44尾樣品在6個(gè)群體都有分布,從江(26)和湖南(9)的數(shù)量最多;華南鯉亞種17個(gè)單倍型魚(yú)的370尾樣品在6個(gè)群體也有分布,且都是其優(yōu)勢(shì)的類(lèi)群。

表2 單倍型分布Tab.2 Haplotype distribution

29個(gè)單倍型的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)劃分為三個(gè)區(qū)(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ):Ⅰ區(qū)與Clade A對(duì)應(yīng),與其他2個(gè)區(qū)之間的突變步驟較長(zhǎng),湖南通道的hap22進(jìn)化出另外3個(gè)單倍型,在從江、榕江、黎平和三江擴(kuò)散開(kāi)來(lái)。Ⅱ區(qū)對(duì)應(yīng)Clade B的b1亞支,由從江和黎平各自2個(gè)獨(dú)有單倍型組成,因3個(gè)未知的單倍型缺失而在該區(qū)相互獨(dú)立分布。Ⅲ區(qū)是一個(gè)龐大的家族,Hap5和hap18與其余單倍型之間因存在1—2個(gè)缺失的單倍型,而略顯獨(dú)立,與圖 2中Clade B的聚類(lèi)情況一致,剩余的單倍型都以從江的Hap7為網(wǎng)絡(luò)中心向外輻射發(fā)展進(jìn)化而來(lái),顯示其祖先的等級(jí)。

圖2 鯉mtDNA Cyt b基因單倍型的MP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 MP Phylogenetic tree of mtDNA Cyt b gene haplotypes in C.carpio

2.3 稻田鯉的遺傳多樣性

如表 3所示,歐洲鯉為低Hd和低π,其遺傳多樣性值遠(yuǎn)低于亞洲的鯉魚(yú)類(lèi)群,亞洲的2個(gè)鯉亞種群體以華南鯉遺傳多樣性最高。在華南鯉群體中,從江具有最高的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)和單倍型多樣性,黎平具有最高的核苷酸多樣性,錦屏的Hd和π都最低。

表3 稻田鯉群體的遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity of rice field carp populations

2.4 稻田鯉群體間的遺傳差異及遺傳分化

如表 4所示,6個(gè)華南鯉稻田群體間的遺傳距離為0.0016—0.0036,以黎平與從江和三江之間差異最大,其次是三江與從江和湖南,湖南與從江和黎平以及榕江與錦屏之間差異最小。遺傳分化指數(shù)在0.0345—0.4233,錦屏與其他群體之間的遺傳分化最大,其次是三江群體,其他群體間的數(shù)值較小。2個(gè)譜系間的遺傳距離為0.0129,亞種間為0.0128、0.0129和0.0038,說(shuō)明譜系間或亞種間的遺傳差異水平高于6個(gè)華南鯉群體。譜系間或歐洲鯉與遠(yuǎn)東鯉和華南鯉之間分化值最高,遠(yuǎn)東鯉與華南鯉之間最低。

表4 稻田華南鯉群體間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)Tab.4 Genetic distance and genetic differentiation index among the rice field carp populations (C.c.rubrofucus)

6個(gè)華南鯉群體按省劃分3組:第1組為貴州省的從江、榕江、黎平和錦屏4個(gè)群體,第2組為湖南群體,第3組為廣西三江群體,其AMOVA結(jié)果見(jiàn)表 5。組間的變異貢獻(xiàn)率為2.17%,群體間為16.69%,群體內(nèi)為81.14%。這說(shuō)明稻田華南鯉的遺傳變異主要來(lái)源于群體內(nèi)個(gè)體間,其次才是地理群體間。遺傳分化指數(shù)Fst=0.167,并且差異極顯著(P＜0.0001)。

表5 基于mtDNA Cyt b序列的分子方差分析Tab.5 Molecular analysis of variance (AMOVA) based on mtDNA Cyt b sequence (AMOVA)

3 討論

3.1 稻田鯉的亞種地位及其母系血統(tǒng)來(lái)源追蹤

我國(guó)3個(gè)鯉亞種主要是分布于新疆額爾齊斯河流域的西鯉、黑龍江至閩江的遠(yuǎn)東鯉及珠江、元江、海南島等地的華南鯉[9]。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示,本研究29種單倍型嚴(yán)格劃分歐洲和亞洲2個(gè)地理譜系,Clade A中4個(gè)單倍型與歐洲鯉聚類(lèi),blast比對(duì)也發(fā)現(xiàn),hap22與希臘鯉(EU689059和DQ868871)和伏爾加河鯉(AY347295)的相似度為99.91%,另外3個(gè)單倍型與其相似度為99.56%—99.74%,表明該4種單倍型隸屬歐洲鯉類(lèi)型。我國(guó)自20世紀(jì)50年代起陸續(xù)引進(jìn)散鱗鏡鯉C.c.var.specularis amurensis和德國(guó)鏡鯉C.c.var.specularis germanensis等歐洲馴養(yǎng)鯉[36,37],以它們?yōu)槟副精@得芙蓉鯉C.c.“Furong”和穎鯉C.c.“Ying hybrid”等人工品種,本地區(qū)也有引種養(yǎng)殖的歷史[22,23,36]。4種單倍型魚(yú)33尾樣品在錦屏外其他5個(gè)稻田群體都有分布,揭示從江及鄰近地區(qū)稻田鯉受到歐洲馴養(yǎng)鯉母系基因的遺傳滲析。Clade B劃分7個(gè)亞支,b2、b6和b7中的8個(gè)單倍型魚(yú)與長(zhǎng)江野鯉、青田田魚(yú)、興國(guó)紅鯉、荷包紅鯉、日本錦鯉和俄羅斯散鱗鏡鯉等遠(yuǎn)東鯉的類(lèi)群或品系[11]聚類(lèi),表明其遠(yuǎn)東鯉亞種地位。Hap18與日本霞浦湖鯉和水生所上傳鯉的序列相似性達(dá)100%,Mabuchi等[38]認(rèn)為霞浦湖鯉系引進(jìn)的歐亞品系,該單倍型魚(yú)只有1個(gè)個(gè)體,可能為輸入型。Hap6、hap7和hap26分別與荷包紅鯉的序列相似度達(dá)99.82%—100%,3個(gè)單倍型顯示是荷包紅鯉的母系起源。Hap10、hap12和hap21與長(zhǎng)江野鯉和興國(guó)紅鯉相似度為99.91%—100%,hap13與荷包紅鯉相似度為99.74%。8個(gè)單倍型魚(yú)與興國(guó)紅鯉和荷包紅鯉的同源性較高,預(yù)示其相同的母系來(lái)源,該地區(qū)有興國(guó)紅鯉和荷包紅鯉及其雜交品種(如豐鯉、荷元鯉、岳鯉和建鯉等)的推廣養(yǎng)殖歷史[22,39]。8個(gè)單倍型魚(yú)的44尾樣品在6個(gè)稻田鯉群體中都有發(fā)現(xiàn),說(shuō)明本地區(qū)稻田鯉同樣遭受?chē)?guó)內(nèi)鯉養(yǎng)殖品種的母系遺傳物質(zhì)滲入。

b1、b3、b4和b5顯示是華南鯉亞種地位及其地理種群或地方品系的母系血統(tǒng)。b1亞支中4個(gè)單倍型在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖中(圖3)處于獨(dú)立的Ⅱ區(qū),系統(tǒng)樹(shù)中也相對(duì)獨(dú)立,與其他亞支關(guān)系較遠(yuǎn),但它們與珠江、都柳江和紅河的鯉魚(yú)以81%置信度聚類(lèi)在一支,歸屬華南鯉亞種是比較合適的,Hap14和hap17分別與珠江野鯉(KP993137)和都柳江野鯉(KY949559和KY949549)的相似性達(dá)100%,Hap27和Hap29與其相似度最高只有99.47%而獨(dú)立為小支,4個(gè)單倍型魚(yú)與都柳江野鯉高度同源。Hap5與廣東大肚鯉和都柳江野鯉序列相似度達(dá)100%,Zhou等[10]指出廣東大肚鯉和元江野鯉都屬華南鯉亞種,Hap5代表的32尾魚(yú)以從江的21尾最多,其次是榕江和湖南通道各4尾,廣西三江2尾和湖南靖州1尾最少,本支中也含都柳江野鯉的3個(gè)單倍型魚(yú),它是否為本地區(qū)所有或來(lái)自廣東還不能確定。b4中含有多達(dá)8個(gè)單倍型,Hap16、hap24和hap25分別與桂林禾花鯉相似度最高(100.00%、99.91%和99.74%),hap3和hap8與都柳江野鯉(KY949560和KY949562)的相似性最高(100%),與金邊鯉為99.91%和99.82%,另外3個(gè)單倍型與都柳江野鯉的序列相似性最高為99.91%、99.91%和99.82%,其次才是與金邊鯉(99.82%、99.74%和99.74%)。潘賢輝等[18]研究指出桂林禾花鯉和金邊鯉群體關(guān)系較近,推測(cè)由珠江水系右江的野生鯉演變而來(lái),程磊等[28]指出廣西禾花鯉母系起源上屬華南鯉。8個(gè)單倍型魚(yú)與桂林禾花鯉、都柳江野鯉和融水金邊鯉有相同母系血統(tǒng)來(lái)源,3地鯉魚(yú)分布區(qū)彼此鄰近,民族同根同源,文化、習(xí)俗和稻作方式相同,有稻田鯉的苗種交流與養(yǎng)殖推廣報(bào)道[17,19,27,40],前3個(gè)單倍型魚(yú)(92尾樣品)分布在三江外的5個(gè)稻田群體中,主要分布于桂林禾花鯉分布區(qū)全州縣鄰近的錦屏(55/60)、黎平(16/43)和湖南 (11/50),后5個(gè)(有185尾樣品)廣泛分布3省7個(gè)縣的稻田中,主要集中在都柳江流域的從江(115/203)、三江(13/55)、榕江(18/36)和黎平(13/43)四地,說(shuō)明b4亞支是本區(qū)域稻田中分布最集中的華南鯉類(lèi)群。b5亞支中的hap4、hap15、hap20和hap23與都柳江野鯉和元江鯉聚類(lèi),相似度為99.82%—100.00%,四個(gè)單倍型魚(yú)也屬華南鯉亞種,51尾樣品魚(yú)主要分布于從江(23尾)和三江(22尾)。

圖3 單倍型的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Neural Network Diagram of haplotypes

3.2 稻田鯉群體的遺傳結(jié)構(gòu)

稻田鯉遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)表明,分布于稻田中歐洲馴養(yǎng)鯉群體為低Hd低π,多樣性匱乏。雖然本研究樣本數(shù)有限,但前期關(guān)于歐洲鯉mtDNA多個(gè)基因區(qū)分析也同樣表明其遺傳變異程度極低[4,41,42],推測(cè)歐洲養(yǎng)殖和馴養(yǎng)鯉的早期存在瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng)[12],導(dǎo)致遺傳變異的局部丟失[8]。稻田中遠(yuǎn)東鯉和華南鯉2個(gè)亞種群體都為高Hd低π,Thai等[42]研究也指出中國(guó)鯉與歐洲鯉相比,其進(jìn)化歷史更長(zhǎng),表現(xiàn)出相當(dāng)高的單倍型多樣性和差異性,本研究稻田鯉的2個(gè)亞種群體也有同樣特點(diǎn)。稻田中最大的華南鯉群體也顯示是多個(gè)母系血統(tǒng)混合體呈高Hd(0.854),說(shuō)明多個(gè)母系血統(tǒng)來(lái)源的鯉品系混養(yǎng)和缺乏人工定向選育,能較大程度保持現(xiàn)有稻田鯉的基因型多樣性[28],然而錦屏群體的低Hd低π有點(diǎn)例外,統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)59尾樣本中有53尾歸屬hap16(啟蒙鎮(zhèn)便幌村21尾、啟蒙鎮(zhèn)岑根村14尾和敦寨鎮(zhèn)螺絲田村18尾),啟蒙鎮(zhèn)便幌村是一個(gè)典型自繁自育自留種的稻田鯉養(yǎng)殖點(diǎn),樣品魚(yú)遺傳同質(zhì)化,提示為創(chuàng)始者事件和瓶頸效應(yīng)的結(jié)果,Perdices等[43]指出廣泛的采樣可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的線粒體譜系,因此錦屏稻田鯉群體遺傳多樣性正確評(píng)價(jià)有待今后擴(kuò)大采樣范圍。從江群體具有廣泛采樣和大樣本量,其單倍型數(shù)最多,Hd也最高,但其π仍偏低,5個(gè)地理群體高Hd低π特點(diǎn)屬魚(yú)類(lèi)多樣性第二種類(lèi)型 (h＞0.5,π＜0.005)[44],遺傳多樣性水平與該物種的進(jìn)化速率正相關(guān)[45],Zhou等[11]提出華南鯉與遠(yuǎn)東鯉的分歧時(shí)間在中更新世,由于進(jìn)化歷史相對(duì)較短,加之經(jīng)歷過(guò)較嚴(yán)重的遺傳瓶頸[46]和種群擴(kuò)張[47],說(shuō)明華南鯉在經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后,進(jìn)化快速,積累了豐富的單倍型多樣性,但核苷酸突變積累略顯不足。

本研究稻田鯉的譜系或亞種間遺傳分化水平存在明顯差異,Clade A與Clade B間的遺傳距離(0.0129)和遺傳分化指數(shù)(Fst=0.7934,P＜0.001)都顯示出較大的遺傳差異和顯著的分化,歐洲鯉與亞洲的2個(gè)亞種鯉間同樣有較高遺傳差異(0.0128和0.0129)和分化水平(0.8902和0.8058),這符合歐洲和亞洲2個(gè)鯉群體古老分離的觀點(diǎn)[10]。亞洲的2個(gè)鯉亞種間遺傳距離(0.0038)和遺傳分化(0.3258)明顯偏低,顯示在系統(tǒng)樹(shù)中2個(gè)亞種未能獨(dú)立成單系群,Zhou等[11]認(rèn)為這種低水平遺傳差異能與其分歧時(shí)間較短有關(guān)。本研究6個(gè)稻田華南鯉群體間的遺傳分化指數(shù)為0.0345—0.4233,其中錦屏與另外5個(gè)群體間處于高度-中度分化等級(jí)[48],三江與剩余4個(gè)群體也處于高度-中度分化等級(jí),其余群體間為低度或無(wú)分化等級(jí)。華南鯉有17種單倍型,雖然共享單倍型有8種,且樣品數(shù)占比較高(342/370),但共享單倍型數(shù)和樣品數(shù)都集中分布在鄰近的2—3個(gè)地理種群間(如從江多達(dá)160尾),說(shuō)明共享單倍型魚(yú)在6個(gè)群體間的傳播是有限的,而獨(dú)有單倍型比例高達(dá)半數(shù)以上(9/17)。AMOVA分析顯示,群體間遺傳變異貢獻(xiàn)率為16.69%,處于中等遺傳變異,說(shuō)明群體間及其內(nèi)部均各自具有相互隔離的遺傳結(jié)構(gòu)[27]。這可能與各地理群體存在不同的創(chuàng)始群體、不同的選擇壓力和地理隔離等限制其基因流動(dòng)的結(jié)果[49]。

3.3 稻田鯉遺傳資源的保護(hù)和研究

程磊等[22]基于D-loop區(qū)和Cytb基因在廣西禾花鯉中觀察到少量歐洲鯉和遠(yuǎn)東鯉的入侵,本研究基于mtDNA Cytb基因的分子系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)從江及鄰近苗侗族地區(qū)稻田鯉受到歐洲鯉和遠(yuǎn)東鯉馴養(yǎng)品系的入侵,樣品數(shù)占總樣本量的17.23%(77/447),說(shuō)明本地區(qū)稻田鯉遭受?chē)?guó)內(nèi)外鯉馴養(yǎng)品系混雜的程度較為嚴(yán)重。因此,加強(qiáng)外來(lái)人工品種在稻田推廣養(yǎng)殖的監(jiān)管和追蹤十分必要。

另一方面,線粒體基因組中不同的基因和區(qū)段具有不同的進(jìn)化速率,在系統(tǒng)發(fā)育分析中有時(shí)會(huì)產(chǎn)生顯著的差異[14],當(dāng)聯(lián)合mtDNA多個(gè)基因序列時(shí),系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分辨率和準(zhǔn)確性會(huì)更高[50]。本研究借助Cytb基因的遺傳分析,初步闡明了從江及鄰近苗侗族地區(qū)稻田鯉的系統(tǒng)關(guān)系、遺傳組成及種群結(jié)構(gòu),獲得了第一手寶貴資料,但是否遭受?chē)?guó)內(nèi)外鯉品系父系基因遺傳滲析仍不得而知,需進(jìn)一步聯(lián)合多個(gè)核內(nèi)外基因的檢測(cè)和分析技術(shù),綜合評(píng)價(jià)該區(qū)域稻田鯉的種質(zhì)特征。