李君風(fēng)，趙杰，唐小月，代童童，董東，宗成，邵濤

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院飼草調(diào)制加工與貯藏研究所，江蘇南京 210095）

農(nóng)作物秸稈是自然界中最豐富、最廉價(jià)的反芻動(dòng)物飼料資源，開發(fā)利用適合于南方氣候條件下龐大的“非常規(guī)飼料資源”，并將其調(diào)制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料是促進(jìn)當(dāng)?shù)毓?jié)糧型畜牧業(yè)發(fā)展的有效措施。農(nóng)作物秸稈粗纖維含量高，水溶性碳水化合物含量低，難以調(diào)制出優(yōu)質(zhì)青貯飼料。目前許多研究通過添加外源纖維素酶，達(dá)到改善青貯發(fā)酵品質(zhì)的目的，但由于酶制劑成本高、性能不穩(wěn)定及pH 適應(yīng)范圍較狹窄等因素，限制了其在青貯中的廣泛應(yīng)用［1-2］。因此獲得能高效降解農(nóng)作物秸稈粗纖維的微生物資源是農(nóng)作物秸稈飼料化利用的關(guān)鍵。纖維素降解菌具有安全、低成本和適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，可降解植物中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物，并將其轉(zhuǎn)化為單糖進(jìn)而被乳酸菌利用。

近年來，隨著人們對(duì)微生物群體功能的認(rèn)識(shí)逐步加深，開始關(guān)注自然條件下微生物之間互作協(xié)同作用，并將這一理念應(yīng)用于纖維素降解的研究與實(shí)際應(yīng)用中［3］。纖維素降解復(fù)合菌系是由多種不同的細(xì)菌群落組成，它們能夠分泌降解能力強(qiáng)、種類多的纖維素降解酶［4］。復(fù)合菌系產(chǎn)生的酶系種類較單菌株更為多樣，進(jìn)而能避免單菌株降解粗纖維時(shí)的底物抑制和反饋抑制因素［5］。反芻動(dòng)物瘤胃是自然界中完善的天然消化發(fā)酵體系和微生態(tài)系統(tǒng)，被喻為豐富的纖維素降解菌資源庫［6］。從反芻動(dòng)物瘤胃中篩選出高效而穩(wěn)定的兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系，將其作為青貯添加劑來改善發(fā)酵品質(zhì)和消化率，更具有安全性、適應(yīng)性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。添加纖維素降解復(fù)合菌系，可有效地降低纖維素的結(jié)晶度、增加孔隙和表面積，可促進(jìn)酶與底物相互接觸并反應(yīng)，提高酶解糖化率［7］，釋放水溶性碳水化合物供乳酸菌利用，快速產(chǎn)生乳酸降低pH，抑制有害微生物的活性，提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)、適口性和消化率。Ren 等［8］發(fā)現(xiàn)在甜高粱（Sorghum bicolor）青貯中添加不同水平的瘤胃液能有效地改善甜高粱發(fā)酵品質(zhì)，增加結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解，提高乳桿菌屬（Lactobacillus）的豐富度。Zhao 等［9］將2 株具有較高纖維素酶活性的瘤胃源纖維素降解菌分別添加到象草（Pennisetum purpureum）、全株玉米（Zea mays）、甜高粱中青貯120 d 后，均降低了青貯飼料的粗纖維含量，釋放出水溶性碳水化合物，改善了發(fā)酵品質(zhì)。此外，瘤胃微生物能有效地分泌降解水稻（Oryza sativa）秸稈粗纖維所需的輔助酶，易獲得纖維素側(cè)鏈，促進(jìn)了復(fù)合菌系對(duì)植物多糖的降解能力［10］。因此挖掘與利用青貯用瘤胃高效纖維素降解微生物資源，豐富特色功能性微生物種質(zhì)資源庫，對(duì)優(yōu)質(zhì)青貯飼料生產(chǎn)具有重要的實(shí)際意義。

本試驗(yàn)從黑白花奶牛瘤胃中篩選高效兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系，探討其對(duì)水稻秸稈青貯過程中結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解及發(fā)酵品質(zhì)的影響，為纖維素降解復(fù)合菌系在農(nóng)作物秸稈青貯飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用及新型青貯添加劑的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

試驗(yàn)材料為成熟期的水稻（Yongyou No. 9），來自寧波市農(nóng)機(jī)畜牧中心試驗(yàn)地（29.87° N，121.53° E，海拔6 m，浙江），于2019 年7 月28 日將成熟期的水稻進(jìn)行刈割，并去除稻穗，切短（1~2 cm 左右）后，充分混合。隨機(jī)取6 份鮮樣，進(jìn)行化學(xué)及微生物成分分析。瘤胃內(nèi)容物收集于寧波市奶牛場(chǎng)黑白花奶牛［年齡在3 周歲，體重為（750±30）kg］。蛋白胨纖維素（peptone cellulose solution，PCS）培養(yǎng)基（g·L-1）：1 g 酵母膏，5 g 蛋白胨，2 g CaCO3，5 g NaCl，以1%水稻秸稈（堿性處理后）和0.3 g Whatman NO.1 濾紙為碳源。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、布什乳桿菌（Lactobacillus buchneri）為本實(shí)驗(yàn)室的乳酸菌。將其分別活化兩次后接入deMan-Rogosa-Sharpe 液體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)24 h 后，用生理鹽水調(diào)為1.0×108cfu·mL-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1黑白花奶牛瘤胃兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系的篩選及鑒定 采集黑白花奶牛瘤胃內(nèi)容物，將勻漿處理后的1 mL 濾液接種至裝有50 mL 蛋白胨纖維素液體培養(yǎng)基（PCS）的血清瓶中，39 ℃下厭氧振蕩培養(yǎng)6 d 后，按2%的接種量，轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中，重復(fù)6~9 次獲得穩(wěn)定的菌系，剛果紅染色初篩，耐酸誘導(dǎo)復(fù)篩，觀察不同時(shí)間點(diǎn)復(fù)合菌系對(duì)濾紙的崩解效果（圖1），篩選出濾紙崩解速度快、降解程度明顯的復(fù)合菌系作為復(fù)篩復(fù)合菌系［11］。經(jīng)酶活力測(cè)定，獲得高效兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系M6；收集培養(yǎng)液提取菌體DNA，對(duì)樣品DNA 送樣進(jìn)行高通量測(cè)序分析（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司），利用Illumina Miseq PE300 平臺(tái)測(cè)序［12］。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)復(fù)合菌系對(duì)濾紙的崩解效果Fig. 1 Disintegration of filter paper by microbial consortium during culture

將復(fù)合菌系M6 接種于以水稻秸稈為碳源的PCS 培養(yǎng)基中，于150 r·min-1、37 ℃條件下，培養(yǎng)6 d，每隔24 h取 樣 離 心，上 清 液 在10000 r·min-1下，離 心10 min，依 據(jù)Miller［13］和Luo 等［14］的 方 法，分 別 以 微 晶 纖 維 素（microcrystalline cellulose，MCC）、羧甲基纖維素（carboxymethylcellulose，CMC）、水楊苷和木聚糖為底物，測(cè)定外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的活力。每分鐘產(chǎn)生1 μmol 還原糖（葡萄糖或木糖）的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）［15］。每個(gè)酶活力測(cè)定設(shè)5 個(gè)重復(fù)。

1.2.2青貯飼料的調(diào)制 稱取120 g 切短的水稻秸稈裝填至聚乙烯袋中（45 cm×35 cm），用真空包裝機(jī)（DZD-400，南京奧米泰科技有限公司）迅速抽真空及熱塑封口。共計(jì)72 個(gè)青貯袋，其中54 個(gè)青貯袋用于γ 輻射滅菌，輻照源為60Coγ，輻射劑量為32 kGy，輻射時(shí)間為4 h［16］。試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)處理組：1）CK：新鮮水稻秸稈直接青貯；2）IRR：滅菌后水稻秸稈青貯；3）CLAB：滅菌水稻秸稈接種復(fù)合乳酸菌（包括植物乳桿菌>5×108cfu·g-1FW，戊糖片球菌>2×108cfu·g-1FW 和布什乳桿菌>2×108cfu·g-1FW）；4）M6：滅菌水稻秸稈接種纖維素降解復(fù)合菌系M6，復(fù)合菌系M6 在Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h（OD600≈1.2），接種濃度為1×106cfu·g-1FW。分別于青貯后的第3、6、15、45、60 和90 天開袋，取樣分析各項(xiàng)指標(biāo)。每個(gè)處理組各時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)5 個(gè)重復(fù)。

1.2.3水稻秸稈青貯前后生物化學(xué)分析 將新鮮水稻秸稈和青貯飼料按照四分法取60 g，65 ℃烘干48 h 至恒重，測(cè)定干物質(zhì)（dry matter，DM）含量，烘干樣品粉碎過1 mm 篩，用于測(cè)定粗纖維組分。采用范氏纖維分析法［17］，應(yīng)用濾袋技術(shù)測(cè)定鮮樣及青貯飼料的中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、酸性洗滌木質(zhì)素（acid detergent lignin，ADL）含量，纖維素含量為ADF 與ADL 之間的差值，半纖維素含量為NDF 與ADF 之間的差值。取20 g 青貯飼料樣品置于250 mL 錐形瓶，與120 mL 蒸餾水混合，在4 ℃冰箱靜置24 h 后，過濾提取浸提液，測(cè)定pH 值和有機(jī)酸［乳酸（lactic acid,LA）、乙酸（acetic acid,AA）、丙酸（propanoic acid,pa）、丁酸（butyric acid,BA）］含量。有機(jī)酸含量測(cè)定步驟參考宗成等［18］的方法，用安捷倫1260 型高效液相色譜儀測(cè)定（流動(dòng)相：2.5 mmol·L-1H2SO4；流速：0.5 mL·min-1；溫度：55 ℃）。采用弗氏評(píng)分法［19］以青貯飼料中乳酸、乙酸、丁酸占總酸的比例為基礎(chǔ)來評(píng)價(jià)青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。得分在81~100 分為優(yōu)；61~80 分為良；41~60 分為尚可；21~40 分為中；0~20 分為劣。

取10 g 新鮮水稻秸稈或青貯飼料于錐形瓶中，加入90 mL 蒸餾水混合，于37 ℃、150 r·min-1振蕩條件下培養(yǎng)1 h 后，分別利用deMan-Rogosa-Sharpe 瓊脂培養(yǎng)基（厭氧條件下在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（有氧條件下在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h），對(duì)鮮樣和青貯飼料中的乳酸菌、酵母菌、霉菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)［10］。剩余的青貯飼料進(jìn)行真空冷凍干燥處理，稱取0.5 g 凍干樣品至10 mL 離心管中，經(jīng)Millipore 水90 ℃浸提、活性炭和少量樹脂預(yù)處理離心，采用高效液相色譜法（安捷倫HPLC 1260，色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z，流動(dòng)相：0.3%的乙腈氨水溶液，流速：0.5 mL·min-1，溫度：35 °C）測(cè)定青貯飼料中單糖和雙糖（葡萄糖、纖維二糖、果糖、木糖、蔗糖）含量，采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定總的水溶性碳水化合物（watersoluble carbohydrate，WSC）含量［20-21］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 軟件GLM 程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），其模型為：Yijk= μ+αi+βj+αβij+ eijk，其中μ為平均值，αi為不同處理效應(yīng)，βj為不同青貯時(shí)間效應(yīng)，αβij為青貯時(shí)間與處理之間的交互作用，eijk為誤差。采用Tukey’s 多重比較法對(duì)處理組平均值進(jìn)行比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解復(fù)合菌系M6 的細(xì)菌組成及各酶活力

本試驗(yàn)從黑白花奶牛瘤胃中篩出一組兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系M6。如圖2 所示，復(fù)合菌系M6 屬水平上主要微生物組成為埃希氏菌屬（Escherichia）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus），相對(duì)豐富度分別為48.59%、31.49%和19.83%。纖維素降解復(fù)合菌系M6 在以水稻秸稈為碳源的培養(yǎng)過程中，其各種酶活力如表1 所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各種酶活力逐漸上升。培養(yǎng)第6 天，外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活力均達(dá)到最大值，分別為2.71、3.44、1.59 和3.91 U·mL-1。

表1 纖維素降解復(fù)合菌系M6 的各種酶活力Table 1 Various enzyme activities of cellulolytic microbial consortium M6（U·mL-1）

圖2 兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系M6 的細(xì)菌組成Fig. 2 Composition of facultative anaerobic cellulolytic microbial consortium M6

2.2 青貯前水稻秸稈的微生物成分和化學(xué)特性

新鮮和滅菌后水稻秸稈化學(xué)和微生物成分如表2 所示，滅菌后水稻秸稈各化學(xué)成分與滅菌前水稻秸稈幾乎沒有差異。滅菌后水稻秸稈沒有檢測(cè)到微生物，表明γ 射線能較好地消除水稻秸稈表面附著的微生物。

表2 滅菌前后水稻秸稈化學(xué)和微生物成分Table 2 Chemical composition and microbial population of fresh and irradiated rice straw prior to ensiling

2.3 水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)

表3顯示了水稻秸稈青貯過程中pH 值、有機(jī)酸含量和乳酸/乙酸（LA/AA）值的動(dòng)態(tài)變化，不同處理組、青貯天數(shù)以及它們的交互作用顯著影響了乳酸（LA）含量、pH 和LA/AA 值（P<0.001）。各處理組pH 值（除IRR 組外）雖有波動(dòng)，但整體呈下降趨勢(shì)。青貯3 d 后，M6 處理組pH 始終低于其他各組，且在青貯第60 天達(dá)到最低值4.62（P<0.05）。LA 含量在M6 處理組呈上升趨勢(shì)，而CK 和CLAB 呈先上升后下降趨勢(shì)。青貯45 d 后，M6 處理組LA 含量始終顯著高于其他各組（P<0.05），且在青貯90 d 達(dá)到最高值（23.90 g·kg-1DM）。隨著青貯的進(jìn)行，乙酸（AA）含量在CK 和M6 處理組中呈上升趨勢(shì)，CK 和M6 處理組乙酸含量均高于其他兩組。整個(gè)青貯期間，各處理組中丙酸和丁酸含量均低于對(duì)照組（CK）。對(duì)青貯第90 天的水稻秸稈青貯飼料有機(jī)酸含量進(jìn)行費(fèi)氏評(píng)分，結(jié)果如表4 所示。CK 組的得分為32，青貯發(fā)酵品質(zhì)中等；CLAB 與M6 組得分分別為69 和79，品質(zhì)為良。

表3 水稻秸稈青貯過程中pH 值、有機(jī)酸含量和乳酸/乙酸的動(dòng)態(tài)變化Table 3 Dynamic changes of pH value，organic acid content and lactic acid/acetic acid of rice straw silage

表4 青貯90 d 水稻秸稈發(fā)酵品質(zhì)費(fèi)氏評(píng)分Table 4 The Flieg score of fermentation quality of 90 days rice straw silage

2.4 水稻秸稈青貯過程中結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解

從表5 可知，處理和青貯時(shí)間均顯著影響水稻秸稈青貯飼料的NDF、ADF 和纖維素的含量（P<0.001）。整個(gè)青貯過程中，各結(jié)構(gòu)性碳水化合物組分（除酸性洗滌木質(zhì)素）整體呈下降趨勢(shì)。青貯15 d 后，NDF、ADF、纖維素含量在M6 組均顯著低于其他各組（P<0.05），半纖維素含量在M6 組也均低于其他各組，且在第90 天顯示最低的NDF（590.15 g·kg-1DM）、ADF（372.63 g·kg-1DM）、半纖維素（217.52 g·kg-1DM）和纖維素（318.61 g·kg-1DM）含量。青貯期間各組酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）含量差異不顯著（P>0.05）。

表5 水稻秸稈青貯過程中結(jié)構(gòu)性碳水化合物組分變化Table 5 Changes in structural carbohydrates components of rice straw silage（g·kg-1 DM）

2.5 水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物組分變化

水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物（WSC）、蔗糖、纖維二糖、果糖、木糖和葡萄糖的動(dòng)態(tài)變化如圖3 所示，不同處理、青貯時(shí)間和它們的交互作用均顯著影響水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物組分的含量（P<0.001）。青貯前15 d，除IRR 組，其他各處理組中WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量迅速下降，青貯15 d 后，WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量在復(fù)合菌系M6 組和滅菌組（IRR）保持相對(duì)較高水平，而對(duì)照組（CK）和乳酸菌處理組（CLAB），WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量持續(xù)下降，直到青貯結(jié)束時(shí)達(dá)到最低水平。青貯60 d 后，IRR 和M6 組各水溶性碳水化合物組分含量保持較高水平，其次為CLAB 組。

圖3 水稻秸稈青貯過程中水溶性碳水化合物，蔗糖，果糖，纖維二糖，木糖和葡萄糖的變化Fig. 3 Dynamic changes of residual water-soluble carbohydrates，sucrose，fructose，cellobiose，xylose，and glucose of rice straw silage

3 討論

本試驗(yàn)經(jīng)限制性誘導(dǎo)培養(yǎng)、剛果紅染色初篩，耐酸誘導(dǎo)篩選和濾紙降解復(fù)篩，從黑白花奶牛瘤胃中篩出一組兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系M6。通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法結(jié)合高通量測(cè)序?qū)?fù)合菌系M6 進(jìn)行微生物多樣性分析，復(fù)合菌系M6 屬水平上主要微生物組成為埃希氏菌屬（Escherichia）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）。這些微生物在纖維素降解中比較常見，如Pang 等［22］從牛瘤胃中分離到的纖維素降解大腸桿菌ZH-4（Escherichia coliZH-4）具有細(xì)胞外纖維素酶活性，可降解培養(yǎng)基中的纖維素。Luo 等［14］對(duì)成年和幼年期長(zhǎng)足大竹象蟲（Cyrtotrachelus buqueti）腸道中具有降解纖維素能力的微生物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)含有乳球菌，且對(duì)其進(jìn)行基因組分析，其富含糖苷水解酶（GH1 和GH3），推測(cè)其具有β-glucosidase 和β-galactosidase 活性［23］。Thet 等［6］從牛瘤胃液中篩出一株具有較高濾紙酶活力（FPase）的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。以上說明埃希氏菌屬、乳球菌屬和腸球菌屬的部分菌種具有產(chǎn)纖維素酶的基因，能夠分泌纖維素酶，降解纖維素。前期本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)復(fù)合菌系M6 進(jìn)行生理生化試驗(yàn)和酶學(xué)特性的研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系M6 的綜合性狀優(yōu)良，適宜于作為青貯添加劑。復(fù)合菌系M6 在以水稻秸稈為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)下，其各酶活力隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，并在培養(yǎng)第6 天達(dá)到最大值，其中木聚糖酶活性顯示最高為3.91 U·mL-1。復(fù)合菌系M6 能夠在無菌培養(yǎng)條件下分泌纖維素酶，并且能高效降解水稻秸稈，構(gòu)成穩(wěn)定的微生態(tài)體系，因此了解其生長(zhǎng)產(chǎn)酶規(guī)律，對(duì)更好地研究和利用纖維素降解復(fù)合菌系具有重要意義。此外，復(fù)合菌系M6 纖維素酶活力動(dòng)態(tài)的測(cè)定對(duì)于后續(xù)青貯發(fā)酵及實(shí)際應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

為了更加深入地評(píng)價(jià)復(fù)合菌系M6 降解粗纖維的效果，將復(fù)合菌系M6 添加到γ 輻射滅菌水稻秸稈青貯中，比較在無其他微生物的干擾條件下，復(fù)合菌系M6 對(duì)水稻秸稈結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解效果。整個(gè)青貯過程中，CK 和CLAB 組乳酸含量呈先上升后下降趨勢(shì)，表明水稻秸稈自身附著的乳酸菌或添加的外源乳酸菌，在青貯前期可利用發(fā)酵底物產(chǎn)乳酸，但是發(fā)酵45 d 后，由于水稻秸稈自身附著的乳酸菌或添加的外源乳酸菌中有異型發(fā)酵乳酸菌存在，在底物不足的情況下，將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸，使乙酸含量升高。M6 處理組pH 始終低于其他各組，青貯第60 天達(dá)到最低值（4.62）。青貯45 d 后，M6 處理組LA 含量始終顯著高于其他各組，這表明復(fù)合菌系M6 對(duì)水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的改善優(yōu)于添加乳酸菌的效果，這與費(fèi)氏評(píng)分結(jié)果相一致。水稻秸稈在復(fù)合菌系M6 的酶解作用下產(chǎn)生水溶性碳水化合物，而M6 中含有31.49%的乳球菌屬，乳球菌屬的存在可及時(shí)利用酶解下游的產(chǎn)物水溶性碳水化合物，產(chǎn)生乳酸，降低pH［24］，同時(shí)維持青貯過程中水溶性碳水化合物的含量，消除酶促反應(yīng)中產(chǎn)物的抑制作用［25］，提高纖維素降解復(fù)合菌系的降解效率，進(jìn)而有效地改善水稻秸稈的發(fā)酵品質(zhì)。

青貯過程中添加纖維素降解復(fù)合菌系可有效地降低纖維素的結(jié)晶度、增加孔隙和表面積，促進(jìn)酶與底物相互接觸并反應(yīng)，提高酶解糖化率，釋放水溶性碳水化合物，為乳酸菌發(fā)酵提供更多的發(fā)酵底物［26］。本試驗(yàn)青貯15 d后，水稻秸稈青貯飼料NDF、ADF、纖維素和半纖維素含量在M6 組均低于其他各組，且在第90 天達(dá)到最低的NDF（590.15 g·kg-1DM）、ADF（372.63 g·kg-1DM）、纖維素（318.61 g·kg-1DM）和半纖維素（217.52 g·kg-1DM）含量，表明添加復(fù)合菌系M6 加速了水稻秸稈結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解。Castro 等［27］研究指出應(yīng)用木質(zhì)纖維素降解微生物，可以有效地提高農(nóng)作物秸稈結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解效率。利用微生物酶解作用降解植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)性多糖，破壞其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使植物細(xì)胞壁內(nèi)可利用的水溶性碳水化合物釋放出來，同時(shí)也增加了微生物或酶對(duì)半纖維素和纖維素的可接觸表面積，進(jìn)一步將結(jié)構(gòu)性多糖降解為單、雙糖，供乳酸菌利用，產(chǎn)生LA，降低pH。石偉［28］將3 株篩選于青藏高原野牦牛糞便中的具有較高纖維素酶活性的芽孢桿菌，按一定接種比例與乳酸菌組合后添加至全株玉米青貯30 d 后，其NDF 和ADF 含量分別降低了16.63%和15.85%。

纖維素降解菌的酶解作用可促進(jìn)水稻秸稈中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解，釋放出額外的WSC 以補(bǔ)充乳酸菌發(fā)酵所需的底物，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，降低pH，抑制有害微生物的活性，提高青貯發(fā)酵品質(zhì)［29］。在青貯前15 d，各處理組（除IRR 組外）中WSC、蔗糖、果糖、木糖、纖維二糖和葡萄糖含量迅速下降，其后，M6 和IRR 處理組水溶性碳水化合物含量保持相對(duì)穩(wěn)定的水平。IRR 組各指標(biāo)表明，將滅菌后水稻秸稈直接青貯其各化學(xué)成分無顯著變化。纖維素降解復(fù)合菌系M6 使得青貯飼料保持了較高水平的WSC 含量，這是由于纖維素降解復(fù)合菌系降解結(jié)構(gòu)性碳水化合物釋放水溶性碳水化合物所致［30］。丁健等［31］在玉米青貯過程中添加纖維素酶，結(jié)果顯示添加纖維素酶可產(chǎn)生纖維二糖和麥芽糖，顯著增加了六碳糖、五碳糖和衍生糖的含量。添加纖維素降解復(fù)合菌系，可以彌補(bǔ)菌株之間的產(chǎn)酶差異，有利于組成完整全面的酶系，充分發(fā)揮各酶之間的協(xié)同作用，提高纖維素酶的活性和降解能力，使各個(gè)菌株相互協(xié)調(diào)生長(zhǎng)，并最大程度發(fā)揮復(fù)合菌系對(duì)結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解能力。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可推斷復(fù)合菌系M6 在水稻秸稈青貯中具有降解粗纖維和促進(jìn)乳酸發(fā)酵的雙重作用。青貯過程中，M6 組乙酸含量明顯提高，這可能是由于微生物酶解使半纖維素脫乙酰化，產(chǎn)生五碳糖，部分異型發(fā)酵乳酸菌可利用五碳糖發(fā)酵成乳酸和乙酸［32］。此外，青貯過程中多聚糖的生物降解會(huì)影響乳酸菌發(fā)酵效率和代謝途徑。新鮮的牧草中游離戊糖很少，而在兼性厭氧纖維素降解復(fù)合菌系M6 分泌的半纖維素酶作用下可釋放部分戊糖［33］，戊糖（木糖）可部分被乳酸菌利用，從而積累更多的乙酸。綜上所述，盡管青貯過程中添加外源微生物（纖維素降解復(fù)合菌系或復(fù)合乳酸菌），最終發(fā)酵品質(zhì)未達(dá)到優(yōu)質(zhì)青貯飼料的標(biāo)準(zhǔn)，但在一定程度上促進(jìn)了乳酸發(fā)酵，降低pH 值，改善水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)，其中復(fù)合菌系M6 改善效果最佳；在此也進(jìn)一步提示對(duì)于類似于水稻秸稈的青貯原料，水溶性碳水化合物嚴(yán)重不足，僅僅依靠添加外源微生物（纖維素降解復(fù)合菌系或復(fù)合乳酸菌）提高其發(fā)酵品質(zhì)的策略仍不夠，需與添加外源發(fā)酵底物相結(jié)合，才能達(dá)到理想的效果。

4 結(jié)論

與水稻秸稈自然發(fā)酵或添加復(fù)合乳酸菌相比，添加纖維素降解復(fù)合菌系M6 降低了水稻秸稈青貯飼料pH值，提高了LA 含量和LA/AA 值，維持了較高的水溶性碳水化合物含量，改善了水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)，復(fù)合菌系M6 在水稻秸稈青貯中具有降解粗纖維和促進(jìn)乳酸發(fā)酵的作用，在青貯飼料生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。