張云翔，王梓濤，衛(wèi)棟，劉峰，戴振航，陳靜瑜（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院肺移植中心、胸外科，江蘇 無錫 214023）

1 離體肺臟機(jī)械灌注技術(shù)簡介

離體肺臟灌注技術(shù)（ex vivo lung perfusion，EVLP）是一種在體外模擬肺臟生理環(huán)境，通過機(jī)械泵提供肺循環(huán)血流動力，輔以保護(hù)性通氣，達(dá)到體外保存和評估供肺的手段［1-2］?，F(xiàn)代EVLP 的概念最早由Lund 團(tuán)隊提出，并由多倫多Cypel 團(tuán)隊等推廣至臨床應(yīng)用。EVLP 包含了灌注容器、泵管系統(tǒng)、血栓過濾器、氧合器、控溫裝置、呼吸機(jī)及配套管路等核心組件，采用以白蛋白右旋糖苷溶液為基礎(chǔ)的無細(xì)胞灌注液。其原理是通過肺保護(hù)性通氣氧合灌注液，經(jīng)肺靜脈流出至氧合器去氧后，微栓過濾，泵入肺動脈構(gòu)成肺循環(huán)。在肺灌注的過程中可實時監(jiān)測灌注液血氣、順應(yīng)性等指標(biāo)反應(yīng)供肺質(zhì)量，達(dá)到評估供肺的目的。也可進(jìn)行多種途徑的治療，達(dá)到修復(fù)供肺的目的。不同于直接移植發(fā)生的快速再灌注過程，EVLP 具有緩慢的程序性復(fù)溫和復(fù)灌的特點。經(jīng)EVLP 評估合格的供肺將再次冷藏保存后用于臨床移植。

2 離體肺臟機(jī)械灌注技術(shù)的實驗?zāi)Ｐ?/h2>

目前已構(gòu)建多種EVLP 實驗動物模型用于基礎(chǔ)研究。最常用的大型動物為豬。豬與人在解剖結(jié)構(gòu)、蛋白和基因水平高度相似，其成果具有易于臨床轉(zhuǎn)化的優(yōu)點［3］。但飼養(yǎng)成本高，實驗重復(fù)困難。用于EVLP 的小動物模型主要包括大鼠、小鼠、豚鼠和家兔。它們的成本低，易于大量重復(fù)實驗。尤其是大小鼠因為有成熟的肺移植模型而更為常用。同時，小動物模型灌注液使用量低，可靈活調(diào)整實驗條件，目前廣泛用于優(yōu)化灌注液組分等研究方向。然而，由于嚙齒類動物易發(fā)生肺不張，無法有效清除氣道內(nèi)分泌物，且耐受的灌注時間短等缺陷［4］，其研究成果的臨床轉(zhuǎn)化前景尚不明確。

3 離體肺臟機(jī)械灌注技術(shù)的臨床應(yīng)用

目前用于臨床的EVLP 系統(tǒng)有OCSTM Lung（Transmedics， Andover， USA）、Lung AssistTM （Organ Assist， Groningen， The Netherlands）、XPSTM 和LSTM（XVIVO， G?teborg， Sweden），還有一些中心采用自建的EVLP 系統(tǒng)［5］。如表1 所示，不同的EVLP設(shè)備灌注管路和原理不盡相同，目前較為常用的EVLP 方案為多倫多方案，采用肺靜脈插管引流的“閉環(huán)灌注”和無細(xì)胞灌注液， 如Lung AssistTM與XPSTM 系統(tǒng)。多倫多EVLP 方案臨床應(yīng)用的結(jié)果表明EVLP 可安全延長肺保存時間?？捎糜诓豢煽匦乃劳龉┓卧u估，在經(jīng)歷長達(dá) 3 h 的熱缺血損傷進(jìn)行 EVLP 評估后仍可安全用于移植。 EVLP 的臨床應(yīng)用使多倫多肺移植項目增長了70%的移植量。OCSTM Lung 則采用肺靜脈開放的“開環(huán)灌注”與含紅細(xì)胞的灌注液。目前已開展有多項關(guān)于EVLP供肺移植的臨床試驗。INSPIRE 試驗是在2011 年11 月至2014 年11 月進(jìn)行的一項前瞻性、隨機(jī)多中心EVLP 評估與移植試驗，結(jié)果顯示，OCSTM Lung 保存與標(biāo)準(zhǔn)冷藏移植效果相當(dāng)。EXPAND 試驗是一項前瞻性、單臂、多中心試驗，探索OCSTM Lung 用于邊緣供肺和循環(huán)死亡供者供肺，結(jié)果顯示EVLP 評估的87% 供肺用于移植，移植后臨床結(jié)果滿意。XPSTM 與OCSTM Lung 系統(tǒng)的后續(xù)改良實驗均已能夠?qū)崿F(xiàn)供肺24 h 離體灌注保存。

表1 目前主要的EVLP 系統(tǒng)

4 離體肺臟機(jī)械灌注技術(shù)干預(yù)疾病肺損傷的進(jìn)展

肺臟易受多種理化因素影響，常見的供肺不達(dá)標(biāo)原因包括感染、神經(jīng)源性肺水腫、肺不張等，由于EVLP 平臺提供了肺臟離體所需的生理環(huán)境并延長了保存時間。目前已有多項實驗探索將EVLP 平臺用于供肺修復(fù)和治療。除了對灌注系統(tǒng)、灌注液成分進(jìn)行調(diào)整等，干細(xì)胞療法、載體藥物、基因編輯等新技術(shù)應(yīng)用極大拓展了EVLP 治療肺損傷的應(yīng)用前景。

細(xì)胞因子作為一種重要介質(zhì)在肺損傷中發(fā)揮重要作用，如白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）作為一種保護(hù)性細(xì)胞因子，加入IL-10 的EVLP 實驗組供肺損傷明顯改善［6］，提示細(xì)胞因子會在EVLP 期間干預(yù)肺損傷。

細(xì)胞因子吸附器（cytokine adsorption， CA）目前已被應(yīng)用于心臟和腎臟移植手術(shù)［7-8］。研究指出，在EVLP 過程中使用CA 可干預(yù)肺損傷［7-8］。Kakishita 等［9］的實驗表明，與對照組相比，CA組灌注液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）低于對照組。然而有趣的是，在EVLP 期間通過CA 去除灌注液中炎癥因子并未顯著改善肺功能，作者推測可能是供肺的損傷程度低，尚有待進(jìn)一步明確。隨后，Iskender 等［10］進(jìn)行了更深入的研究，他們選用豬肺缺血/再灌注損傷（ischemiareperfusion injury， IRI）模型，在EVLP 灌注期間，CA 顯著改善了氣道壓力和動態(tài)順應(yīng)性。相比對照組，實驗組的X 線放射檢查顯示肺水腫減輕，離子濃度穩(wěn)定。實驗組的葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)生量降低，其組織髓過氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）活性降低，鏡下的肺損傷減輕。在另一項研究中［11］，CA 顯著降低了EVLP 期間灌注液中的細(xì)胞因子濃度。在移植后的再灌注期間，CA 組動態(tài)肺順應(yīng)性更好。再灌注結(jié)束時，實驗組的氧合功能和動態(tài)順應(yīng)性繼續(xù)優(yōu)于對照組，同時局部炎癥反應(yīng)降低。然而，CA 在吸附炎癥因子的同時也會去除灌注液中的小分子藥物和供肺所需部分營養(yǎng)物質(zhì)。在Iskender 等［11］的研究中，與對照組相比，灌注液中美羅培南和甲強(qiáng)龍的水平顯著降低。因此，仍需進(jìn)一步研究CA對循環(huán)物質(zhì)的影響。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）等多能干細(xì)胞已知可作用于多種炎癥相關(guān)信號通路并發(fā)揮抗炎作用，并可能參與組織修復(fù)和再生，可運用于急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）的治療。MSC 缺乏免疫原性而不引起效應(yīng)T 細(xì)胞活化，可避免供肺移植后的過度免疫激活。常用的MSC 主要有骨髓源性和臍帶源性。Mordant 等［12］提出，臍帶源性的MSC 由于其來源于新生兒，與成人細(xì)胞相比，具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。而其他人則指出臍帶源性的MSC 培養(yǎng)時存在多層增殖而會導(dǎo)致接觸抑制，骨髓源性則不會出現(xiàn)這種情況［13-14］。Pacienza 等［15］在經(jīng)熱缺血損傷的大鼠EVLP 模型中加入了臍帶源性MSC，并分析了EVLP 期間經(jīng)血管內(nèi)給藥后的肺部組織學(xué)變化。他們認(rèn)為臍帶源性MSC 可以減少氧化損傷和中性粒細(xì)胞外滲。盡管肺水腫情況沒有改善，但經(jīng)過治療，肺順應(yīng)性提高， MPO 活性降低。

多倫多課題組則進(jìn)行了EVLP 期間應(yīng)用骨髓源性MSC 的研究［12］。他們分別在氣管和血管內(nèi)給藥并且評估了不同給藥濃度。由于在血管內(nèi)的組織中檢測到MSC，并且氣道壓力隨著氣管給藥劑量的增加而增加，因此更推薦血管內(nèi)給藥的方式。此外，針對不同濃度梯度，他們認(rèn)為150×106（相當(dāng)于豬每千克體重5×106個MSC）是更合理的。Nykanen 等［16］在EVLP 期間應(yīng)用骨髓源性MSC 與抗炎細(xì)胞因子IL-10 結(jié)合，生成MSCIL-10，可使灌注液和肺組織中的IL-10 的水平升高。但是由于肺部代謝不良，其所處的酸性環(huán)境對氧和、順應(yīng)性等生理指標(biāo)的意義仍有待觀察。

另一項應(yīng)用多潛能成體祖細(xì)胞（multipotent adult progenitor cell， MAPC）治療熱缺血損傷供肺的研究發(fā)現(xiàn)，在肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中，MAPC 組的中性粒細(xì)胞和炎癥因子減少［17］。

為了更深入研究MSC 在EVLP 期間的作用機(jī)制，Lee 等［18］構(gòu)建了小鼠內(nèi)毒素急性肺損傷（acute lung injury， ALI）模型。研究認(rèn)為MSC 促進(jìn)介質(zhì)蛋白A4（Lipoxin A4， LXA4）的分解，有效緩解了ALI。同時，MSC 旁分泌的角化細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor， KGF）在這一過程中也發(fā)揮重要作用［19-20］。多倫多課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MSC 后，肺組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）濃度增加，灌注液中IL-8 濃度降低［21-22］。然而，關(guān)于灌注液中炎癥因子是否變化學(xué)界尚無定論。Mordant 等［12］報告說，與對照組相比MSC 組中并沒有IL-8 降低的表現(xiàn)。而Nakajima 等［23］的發(fā)現(xiàn)更為廣泛，在MSC 治療組中， IL-4 水平較高，但I(xiàn)L-12、IL-18 和γ-干擾素（interferon，IFN-γ）水平較低。然而他們也沒有發(fā)現(xiàn)IL-8 存在差異。同樣，Lee 等［16］的研究也沒有發(fā)現(xiàn)促炎性IL-8 或TNF-α 降低。許多研究中心受限于樣本量較小因而無法得出準(zhǔn)確的答案。MSC 應(yīng)用于EVLP 期間干預(yù)肺損傷的研究還存在一些問題。例如MSC 是否應(yīng)在灌注前對細(xì)胞活力進(jìn)行分析，尤其是冷凍復(fù)蘇細(xì)胞中死細(xì)胞所占比例對后續(xù)結(jié)果的影響也值得探索［24］。

目前，越來越多的研究認(rèn)識到干細(xì)胞的益處可能源于其分泌的產(chǎn)物細(xì)胞。外囊泡（extracellular vesicles， EV）得已廣泛研究。EV 是指由細(xì)胞釋放的無核、無法復(fù)制的膜顆粒，然后根據(jù)其大小或來源分為若干亞類［25］。同MSC 一樣，EV 具有生物學(xué)活性，而無免疫原性，可以介導(dǎo)多種免疫調(diào)節(jié)過程［26-27］。Lonati 等［28］將EV 應(yīng)用于EVLP 灌注，可有效降低肺血管阻力和灌注液中一氧化氮（nitric oxide， NO）等代謝物的產(chǎn)生，有效阻止了IRI 引起的肺組織ATP 減少。此外，EV 引起的內(nèi)皮素-1（endothelin，ET-1）下調(diào)可有助于降低血管阻力。除了IRI 模型外，EV 還被應(yīng)用于治療內(nèi)毒素引起的肺損傷［29］。在小鼠暴露于內(nèi)毒素同時給予MSC 旁分泌的EV，提示EV 可以降低炎癥細(xì)胞的發(fā)生率并降低BALF 中蛋白水平［30］。在人肺EVLP 實驗中，Park 等［31］用大腸桿菌構(gòu)建了肺損傷模型，通過在灌注液中加入含有抗菌作用的EV，使供肺在6 h EVLP 期間抗菌能力提升，肺動脈壓力降低。在細(xì)胞層面的研究中，Vitalei 等［32］通過在體外肺泡細(xì)胞EVLP 的灌注液中加入半透膜活性的3D 培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞（A549）的凋亡減少，活性得到更好地維持。這些研究提示了EV 具有良好的潛在應(yīng)用價值，然而EV 的用量、頻次等尚需要進(jìn)一步的探索。鑒于MSC 本身來源于異種供體，其分泌的的EV 可能存在異質(zhì)性，所產(chǎn)生的差異是否會影響EV 的含量和有效性尚不明確［24］。

EVLP 也可應(yīng)用于其他特殊情況導(dǎo)致的肺損傷修復(fù)。誤吸是腦死亡器官捐獻(xiàn)患者常見的肺損傷［33］。吸入的胃酸會導(dǎo)致肺支氣管上皮和肺泡上皮化學(xué)損傷，并在移植后出現(xiàn)嚴(yán)重的IRI。Nakajima 等［34］通過給豬氣道注射胃內(nèi)容物吸入來模擬吸入性肺損傷，他們在EVLP 期間經(jīng)氣道加入表面活性物質(zhì)。實驗組的供肺生理功能明顯改善，BALF 中的IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥因子降低。他們認(rèn)為EVLP 期間進(jìn)行表面活性物質(zhì)置換減少了炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生并防止磷脂酰膽堿的水解。然而，由于沒有進(jìn)行術(shù)后移植，也無法判斷移植后再灌注損傷情況。因此，EVLP 期間使用表面活性物質(zhì)是否能緩解術(shù)后IRI 損傷仍有待研究。

呼吸機(jī)相關(guān)的肺損傷也是常見的供肺損傷因素。由于捐獻(xiàn)患者在ICU 期間呼吸機(jī)的通氣模式可能使供肺暴露于過高的機(jī)械應(yīng)力，導(dǎo)致肺損傷［35］。為此，Bobba 等［36］提出在EVLP 過程中使用負(fù)壓通氣（negative pressure ventilation， NPV）模式代替?zhèn)鹘y(tǒng)的正壓通氣（positive pressure ventilation， PPV）。結(jié)果顯示，NPV 模式下的供肺炎癥因子減少，肺血管阻力降低且順應(yīng)性更高。但由于使用NPV 模式，通氣效率較PPV 低，且無法顯示實時氣體流量和壓力等重要參考指標(biāo)，因此，EVLP 期間使用NPV 仍值得改進(jìn)。

5 總結(jié)與展望

EVLP 干預(yù)肺損傷的應(yīng)用前景廣闊，但大多仍處于小規(guī)模試驗階段，EVLP 的全面推廣仍面臨運行成本高昂，流程規(guī)范化不足等現(xiàn)實問題，需進(jìn)一步研究探索。作為離體肺臟的保存和修復(fù)的重要平臺，EVLP 也將在肺臟病理生理學(xué)開展研究，異種器官移植和生物工程等領(lǐng)域發(fā)揮其獨特的作用［37-38］，為臨床提供更多高質(zhì)量的可移植供肺。