莫盛龍 夏宗元 李 繼 侯正科 劉紅昌* 黃明進

（1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/石斛研究院，貴州貴陽 550025；2福泉市華源生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州福泉 551608；3貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室，貴州貴陽 550025）

蜜環(huán)菌Armillaria mellea，隸屬于擔(dān)子菌亞門Basiaiomycotina 傘菌目Agaricales泡頭菌科Physalacriaceae 蜜環(huán)菌屬Armillaria（Fr.）Staude，是傳統(tǒng)的藥食兩用大型真菌，具有重要的經(jīng)濟價值。蜜環(huán)菌是天麻生長所必需的共生真菌，為無法進行光合作用的天麻提供生長繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)，對天麻品質(zhì)及產(chǎn)量的影響較大[1-5]。在藥理上蜜環(huán)菌有與天麻相似的功效，人工液體發(fā)酵生產(chǎn)的蜜環(huán)菌菌絲體或菌球及其發(fā)酵液制成的蜜環(huán)菌制劑主要用于治療神經(jīng)衰弱、失眠、耳鳴、眩暈、四肢麻木及癲癇等疾病[6-8]。

核糖體基因被認為是最能反映物種間遺傳關(guān)系的指標之一，核糖體基因間隔區(qū)可分為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）和基因內(nèi)間隔區(qū)（Intergenic Spacer，IGS）2 種。IGS 區(qū)域相對于ITS區(qū)域而言是比較低的保守基因區(qū)間，可進一步對相近的物種進行區(qū)分[9]。液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)蜜環(huán)菌，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效率高，為可連續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)。筆者對11份蜜環(huán)菌種質(zhì)的rDNA-IGS區(qū)段進行序列測定，利用DNAMAN 軟件對其進行分類及特征序列比對；并在相對一致的液體培養(yǎng)條件下對其進行培養(yǎng)，選擇優(yōu)勢蜜環(huán)菌菌株，采用三因素三水平正交試驗，對其培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期為蜜環(huán)菌種質(zhì)資源的分類、鑒別及液體培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株于 2020 年 6 月收集，M-01—M-07 均來自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，M-08購自貴州省都勻市勻洞鎮(zhèn)馬場村峻康生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，M-09購自黔東南興昌菌業(yè)科技有限公司，M-10購自湖北省宜昌市裕禾菌業(yè)有限公司，M-11為貴州省福泉市仙橋鄉(xiāng)月塘村野生蜜環(huán)菌子實體分離純化菌株，共11份蜜環(huán)菌種質(zhì)。經(jīng)貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室鑒定，均為蜜環(huán)菌屬Armillaria（Fr.）Staude種質(zhì)，其中 M-01、M-02、M-04、M-05、M-08、M-09、M-10 為高盧族高盧蜜環(huán)菌Armillaria gallica，M-06、M-07為蜜環(huán)菌族蜜環(huán)菌Armillaria mellea，M-03、M-11為高盧族芥黃蜜環(huán)菌Armillaria sinapina。

1.2 培養(yǎng)基配制

分離純化培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基，按照說明書方法使用，倒入500 mL的錐形瓶中，每瓶200 mL。

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂粉12 g，pH6.0；馬鈴薯去皮切丁，加入適量的清水煮沸，持續(xù)沸騰期間用鐵勺搗碎，單層紗布過濾3次，濾液加水至1 L 后，加入其他原料，攪拌煮沸，倒入50 mL的試管中，每支30 mL。

優(yōu)勢蜜環(huán)菌的篩選培養(yǎng)基：玉米淀粉8 g，黃豆粉8 g，葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，酵母浸膏2 g，磷酸二氫鉀2 g，七水硫酸鎂1 g，VB11 g；先將玉米淀粉（1.2 g）和黃豆粉（1.2 g）按比例稱量，倒入200 mL 的培養(yǎng)瓶中，再將葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、維生素B1溶于1 L 的水中，加熱煮沸充分溶解，按每瓶150 mL倒入培養(yǎng)瓶中。

1.3 蜜環(huán)菌分離純化與活化

蜜環(huán)菌的分離：將野外采集到的蜜環(huán)菌子實體在超凈工作臺上用75%的酒精棉球擦拭菌蓋表面，迅速用無菌水沖洗菌蓋，再用無菌棉球擦干菌蓋上的水，用鑷子撕去菌蓋表皮，在菌柄與菌蓋交接處切取0.3~0.5 cm2的組織塊，接種于PDA 培養(yǎng)基上，置25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)30 d，并與搜集的蜜環(huán)菌原種，存放于4~8 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。蜜環(huán)菌的活化：將分離純化和收集的原種菌絲或菌塊接種于活化培養(yǎng)基中，置25 ℃的培養(yǎng)室內(nèi)避光培養(yǎng)15 d，置4~8 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蜜環(huán)菌rDNA-IGS序列分析

蜜環(huán)菌原種活化后，各取一支試管取出菌絲，清除培養(yǎng)基后，用液氮速凍，磨成粉狀，DNA 提取按照真菌基因組DNA 提取試劑盒操作。引物的選擇與合成采用間隔區(qū)基因的引物5SA/CNL12[10]。5SA堿基序列為5'-CAGAGTCCTATGGCCGTGGAT-3'，CNL12堿基序列為5'-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3'，由北京擎科生物科技有限公司重慶分公司合成。rDNA-IGS 序列擴增：PCR 反應(yīng)體積為 30 μL，其中金牌Mix（green）26 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板2μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min后，94 ℃變性40 s，58.9 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。取 2.5 μLPCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析以便了解擴增情況，其余擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司重慶分公司進行雙向測序和拼接。采用DNAMAN 6.0軟件構(gòu)建聚類圖及序列比對分析。

1.5 優(yōu)勢蜜環(huán)菌菌株篩選

在超凈工作臺中取出試管中已活化的新生菌絲，刮除殘留在菌絲上的培養(yǎng)基，切成1 cm 的小段，接種于優(yōu)勢蜜環(huán)菌篩選培養(yǎng)基中。每150 mL 搖瓶接種1 小段，每份蜜環(huán)菌接種3 瓶，在25 ℃、黑暗及150 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)15 d。將菌球取出清水清洗，統(tǒng)計菌球個數(shù)，在黑暗環(huán)境下觀察菌球熒光，每瓶選4顆較大的菌球，測量其直徑，所有菌球放在單層紗布上濾水過夜，稱鮮重，60 ℃烘干，稱干重，計算折干率。

1.6 優(yōu)勢蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)基篩選

采用L（934）正交試驗，試驗因素為磷酸二氫鉀（A）、七水硫酸鎂（B）、VB（1C）。磷酸二氫鉀水平分別為 1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L；七水硫酸鎂水平分別為 0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L；VB1水平分別為 0.1 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L。接種及培養(yǎng)方式同1.5。

表1 優(yōu)勢蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 11份蜜環(huán)菌種質(zhì)rDNA-IGS序列分析

2.1.1 聚類分析

11 份蜜環(huán)菌種質(zhì)樣品測序峰圖較好，序列拼接后，利用DNAMAN 6.0 軟件對所有序列進行多重對位排列，將對位排列結(jié)果中5’和3’端的非對位排列區(qū)去除，通過構(gòu)建同源樹對11份蜜環(huán)菌種質(zhì)進行聚類。由圖1可知，11份蜜環(huán)菌種質(zhì)劃分為兩個大類，相似度為82%，Ⅰ類包括M-01—M-05 和M-08—M-10，相似度為100%，Ⅱ類包括M-06、M-07 和M-11，相似度為100%。

圖1 基于rDNA-IGS序列的11份蜜環(huán)菌種質(zhì)聚類分析

2.1.2 特征序列分析

利用DNAMAN 6.0軟件分別對兩類蜜環(huán)菌序列進行多重對位排列，將對位排列結(jié)果中5’和3’端的非對位排列區(qū)去除，進行序列對比。在Ⅰ類蜜環(huán)菌種質(zhì)中，M-01發(fā)生2個堿基的變異，在225 bp處由T→A，在247 bp處由A→G；M-02發(fā)生1個堿基變異，在 6 bp 處由 A→G；M-05 發(fā)生 1 個堿基變異，在465 bp 處由 A→G；M-09 發(fā)生 1 個堿基變異，在 6 bp處由A→G；M-10 發(fā)生2 個堿基變異，在 225 bp 處由T→A，在 465 bp 處由 A→G。共有序列長度為861 bp，其中堿基A、C、G、T 所占比例分別為31.2%、25.6%、18.9%、24.3%。在Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)中，M-11發(fā)生 17 個堿基變異，在 5 bp 和 284 bp 處由 C→T，在28 bp 處由 T→C，在 706 bp 處由 A→G，在 730 bp 處由 G→A，在 439~444 bp 和 430~535 bp 處均發(fā)生堿基缺失，其中在439 和444 bp 處為堿基C 的缺失，在440~443 bp、530 bp、532 bp、534 bp 和 535 bp 處為堿基A 的缺失，在431 bp 處為堿基G 的缺失，在533 bp處為堿基T 的缺失。共有序列長度為804 bp，其中堿基 A、C、G、T 所占比例分別為 33.5%、25.2%、17.1%和24.3%。將兩類的共有序列進行對比，去除非對位排列區(qū)后（表2），兩類蜜環(huán)菌核糖體基因序列差異較大，A、C、G、T 均有不同程度的變異，相似度為72.61%，共有序列長度為632 bp。其中堿基A、C、G、T 所占比例分別為 33.9%、24.8%、16.6%、24.7%。

表2 兩類蜜環(huán)菌rDNA-IGS共有序列對比結(jié)果

2.2 液體培養(yǎng)優(yōu)勢菌株篩選

2.2.1 顯著性分析

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，采用Duncan 新復(fù)極差法進行方差分析比較數(shù)據(jù)的差異顯著性。由表3 可知，M-03 菌球的直徑最大（16.43 mm），M-04 次之（14.21 mm），M-06 最小（2.84 mm）；M-09 菌球的個數(shù)最多（160 個/150 mL），M-10 次之（130個/150 mL），與M-04、M-08 差異不顯著，M-03 最少（34 個/150 mL），與M-01、M-05、M-06 差異不顯著；M-09 菌球的干重值最高（1.683 g/150 mL），M-08 次之（1.509 g/150 mL），M-06 最?。?.029 g/150 mL）；在黑暗條件下觀察菌球熒光情況，發(fā)現(xiàn)M-02 的熒光最強，M-09、M-10、M-08 和 M-04 熒光較弱，M-03、M-05 和 M-07 熒光弱，而 M-01、M-06、M-11 幾乎沒有熒光。因此，M-09 菌球生長情況較好，主要表現(xiàn)為菌球的直徑較大，個數(shù)較多，菌絲干重值較高，折干率較小以及熒光強度較強，M-03 雖菌球直徑最大，但菌球個數(shù)和干重較少，而M-06、M-01 和M-11表現(xiàn)最差。

表3 蜜環(huán)菌種質(zhì)菌球生長情況

2.2.2 聚類分析

以菌球的直徑、個數(shù)、干重以及折干率為指標，利用SPSS 軟件采用WORD 聚類法，對11 份蜜環(huán)菌種質(zhì)進行分類。由圖2 可知，11 份蜜環(huán)菌種質(zhì)在歐氏距離為25 時，分為兩個大類，Ⅰ類包括M-02、M-04 和 M-08—M-10，Ⅱ類包括 M-01、M-03、M-05、M-06、M-07 和M-11。Ⅰ類蜜環(huán)菌種質(zhì)整體表現(xiàn)較優(yōu)。

圖2 基于菌球表型的11份蜜環(huán)菌種聚類分析

2.3 優(yōu)勢蜜環(huán)菌培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 顯著性分析

以M-09 為優(yōu)勢蜜環(huán)菌，對其培養(yǎng)基進行優(yōu)化，由表4可知，處理2菌球的直徑最大（11.82 mm），與處理1 差異不顯著，處理9 最?。?.06 mm），與其他處理均差異顯著；處理3 的菌球個數(shù)最多（129 個/150 mL），與處理7 差異不顯著，處理1 最少（51 個/150 mL）；處 理 7 菌 球 干 重 值 最 高（1.766 g/150 mL），與其他處理均差異顯著，處理8次之（1.379 g/150 mL），處理9最?。?.105 g/150 mL），但與處理1 差異不顯著。因此直觀分析認為處理7 為較優(yōu)培養(yǎng)基，菌球干重值最高，個數(shù)較多。

表4 優(yōu)勢蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)結(jié)果

2.3.2 正交分析

以菌球干重為指標，采用LSD 法進行正交分析，由表5可知，比較各因素極值排出影響因素大?。≧越大的因素越重要）：VB1＞磷酸二氫鉀＞七水硫酸鎂。經(jīng)方差分析，由表6 可知，A、B、C 三因素的F值均小于F0.05（2，2），因此三個水平菌球干重差異均不顯著，所以選擇平均數(shù)大的作為最優(yōu)組合，即A3、B1、C3。

表5 優(yōu)勢蜜環(huán)菌正交試驗結(jié)果（菌球干重）

表6 正交設(shè)計方差分析表（完全隨機模型）

3 小結(jié)與討論

當(dāng)前野生天麻資源匱乏，栽培天麻的產(chǎn)量、質(zhì)量參差不齊，給市場供應(yīng)帶來了一定的壓力。蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)制品在藥理上與天麻有相似功能，通過利用蜜環(huán)菌來緩解天麻市場的需求，具有重要意義?；蚴强刂粕镄誀畹年P(guān)鍵因素之一，試驗通過分析不同蜜環(huán)菌種質(zhì)之間的rDNA-IGS 序列上的堿基差異，并通過液體培養(yǎng)，探究它們之間是否存在某種聯(lián)系。試驗結(jié)果表明，rDNA-IGS 序列的聚類與菌球表型的聚類存在一定的差異，即在rDNAIGS 序列的聚類中，第Ⅰ類包括M-01~M-05 和M-08~M-10，第Ⅱ類包括M-06、M-07 和M-11，而在菌球表型的聚類中，第Ⅰ類包括M-02、M-04 和M-08~M-10，第Ⅱ類包括M-01、M-03、M-05~M-07 和M-11，聚類結(jié)果存在差異，這可能是因為蜜環(huán)菌rDNA-IGS 比較保守的緣故。另外，M-03 在貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室被鑒定為芥黃蜜環(huán)菌。鑒定方法是采用引物ITS1/ITS4 擴增其rDNAITS 序列，其聚類結(jié)果與研究中rDNA-IGS 序列的聚類結(jié)果一致，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫中對比發(fā)現(xiàn)M-03 與數(shù)據(jù)庫中的一株芥黃蜜環(huán)菌聚為一類，故認為M-03 可能為芥黃蜜環(huán)菌，可能是由于芥黃蜜環(huán)菌在核糖體基因上變異范圍較廣，或高盧蜜環(huán)菌與芥黃蜜環(huán)菌之間親緣關(guān)系較近造成了分類結(jié)果的差異。M-09 蜜環(huán)菌菌球液體培養(yǎng)表現(xiàn)較優(yōu)，主要體現(xiàn)在菌球的個數(shù)和干重上，同時M-09 在Ⅰ類蜜環(huán)菌中6 bp處由A→G，該位點可能與菌球的個數(shù)或干重有關(guān)。Ⅱ類蜜環(huán)菌中M-11 變異位點有17 個，主要表現(xiàn)為堿基的缺失，在菌球的表型上表現(xiàn)為菌球較小，個數(shù)較少，干重較低。

蜜環(huán)菌作為天麻共生真菌，同時具有較高的藥用價值，其培養(yǎng)條件的研究引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。前人對蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)的研究多在于培養(yǎng)基的優(yōu)化上，尤其是碳源、氮源的研究。程顯好等[11]對分離自山東煙臺和威海地區(qū)的蜜環(huán)菌菌株液體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明最適碳源和氮源分別是糊精和豆餅粉提取液。楊海旭[12]發(fā)現(xiàn)秦巴山區(qū)蜜環(huán)菌優(yōu)良菌株的最佳碳氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。唐興國等[13]采用正交試驗同樣對櫟樹枝、毛竹根、葡萄糖、蔗糖、果糖、馬鈴薯等碳源、氮源進行優(yōu)化，獲得一種蜜環(huán)菌液體種改良培養(yǎng)基配方（櫟樹枝100 g/L，毛竹根50 g/L，蔗糖20 g/L，馬鈴薯200 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，七水硫酸鎂1.5 g/L，VB110 mg/L，pH 自然）。以上研究均對培養(yǎng)基中的碳源、氮源進行優(yōu)化，且篩選出較優(yōu)的碳源和氮源以及適當(dāng)?shù)谋壤?，但對于培養(yǎng)基中用量較少、價格較貴的成分研究較少。研究不僅對液體培養(yǎng)優(yōu)良菌株進行篩選，還在固定碳源氮源的條件下，對磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂及VB1的比例進行優(yōu)化，得到其較優(yōu)比例為5∶1∶2，以期在篩選適宜于液體培養(yǎng)的優(yōu)勢蜜環(huán)菌的同時，減少此類成分用量并篩選出合適的比例。