詹雯琦，劉淑集，李水根，蔡水淋，路海霞，王茵，劉智禹*

（1.福建師范大學(xué)，福建 福州 350007；2.福建省水產(chǎn)研究所國(guó)家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)分中心（廈門），福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013；3.福建省海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)校，福建 福州 350000）

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）又稱花蛤、雜色蛤等，北方俗稱蛤蜊，隸屬于雙殼綱、蛤蜊科，廣泛分布于遼寧、山東、福建等南北海區(qū)，是我國(guó)近海四大養(yǎng)殖貝類之一[1]，其產(chǎn)量大、價(jià)格不高，且肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，已成沿海地區(qū)百姓餐桌常見的一種水產(chǎn)品。目前，菲律賓蛤仔主要以生鮮形式銷售，少部分加工成罐頭等形式，產(chǎn)品附加值低。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為菲律賓蛤仔可入藥，《中華本草》中也記載其藥效。現(xiàn)今已有大量研究報(bào)道，菲律賓蛤仔富含多肽、多糖、糖胺聚糖、糖蛋白等生物活性物質(zhì)[2-4]，具有抗氧化[5-6]、降血糖[7]、降血脂[8]、抗腫瘤[9-10]、抑菌[11]、抗凝血[12]、促進(jìn)鐵吸收[13]等活性。

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs），屬于一種雜多糖，是一類由重復(fù)的二糖結(jié)構(gòu)單一組成的帶有負(fù)電荷的長(zhǎng)鏈大分子，具有羧基和硫酸基團(tuán)[14]。學(xué)者認(rèn)為，多糖的生物活性與它的分支度、溶解性、空間結(jié)構(gòu)、取代基種類等因素密切相關(guān)[15-16]。GAGs結(jié)構(gòu)特殊，其二糖單位為己糖醛酸和己糖胺，具有較強(qiáng)的生物活性[17]，成為生物高分子中的研究熱點(diǎn)。近年來，國(guó)內(nèi)外已從海參[18]、牡蠣[19]、扇貝[20]、合浦珠母貝[21]等海洋生物中分離到了GAGs。因此，本文以養(yǎng)殖菲律賓蛤仔為原料，采用水酶法提取GAGs，并通過離子色譜、紫外光譜、傅里葉紅外光譜及核磁共振技術(shù)對(duì)提取到的GAGs進(jìn)行分離純化與結(jié)構(gòu)表征，為該GAGs的結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)，也為菲律賓蛤仔等海洋貝類的高值化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

旋渦混合儀（XW-80A）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5810R）：德國(guó)Eppendorf公司；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-3200）：上海美譜達(dá)儀器公司；程控全自動(dòng)部分收集器（CBS-B）：上海滬西分析儀器廠有限公司；電子分析天平（BSA8201）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器（BT100J-1A）：慧宇偉業(yè)流體設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R系列）：上海申生科技有限公司；冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10N）：寧波新芝生物科技公司；傅里葉紅外光譜儀（380FT-IR）：美國(guó) Nicolet公司；核磁共振儀（Bruker-AVANCE600）：德國(guó) Bruker公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菲律賓蛤仔GAGs的制備

稱取50 g菲律賓蛤仔勻漿后，添加9 800 U/g中性蛋白酶，按料液比1∶1（g/mL）加入去離子水，50℃下酶解5 h，所得酶解液煮沸10 min滅酶。冷卻至室溫（24℃～26℃）后，10 000 r/min離心 10 min，收集上清液。調(diào)節(jié)上清液的pH值為7.0，加入95%乙醇（3倍體積），混勻，置于4℃下24h。后 4000r/min，離心15min，取沉淀。冷凍干燥得到菲律賓蛤仔GAGs粗品，得率為1.04%。用阿利新藍(lán)法[22]測(cè)定糖胺聚糖含量為7.13%（以干基計(jì)）。

1.3.2 DEAE-650M離子交換色譜分離純化菲律賓蛤仔GAGs

用去離子水清洗去除DEAE-650M中的細(xì)小顆粒，配制成凝膠，脫氣，裝柱，以去離子水為溶劑，以流速1 mL/min平衡24 h。

將GAGs粗品用去離子水配制濃度為90 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜除雜、上柱。依次用去離子水和 0.25、0.50、0.75、1.00 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，以1 mL/min的流速收集，每管收集5 mL，用阿利新藍(lán)比色法[22]檢測(cè)各管GAGs含量，每一濃度梯度洗脫至無洗脫峰出現(xiàn)。合并相同組分的洗脫峰、透析、濃縮、真空冷凍干燥得GAGs純化品。

1.3.3 紫外光譜分析

超高速動(dòng)能武器對(duì)地打擊毀傷效應(yīng)主要包括直接侵徹、撞擊成坑以及地沖擊毀傷[1,13-14] 3種。根據(jù)固體侵徹、半流體侵徹和流體動(dòng)力學(xué)侵徹，分別計(jì)算侵徹深度、成坑范圍和地沖擊效應(yīng)。

將所得的GAGs純化品用蒸餾水配制成1 mg/mL溶液，在波長(zhǎng)190 nm～600 nm進(jìn)行紫外光譜掃描，以蒸餾水作空白對(duì)照。

1.3.4 傅里葉紅外光譜分析

稱取GAGs純化品2 mg，加入干燥的KBr晶體200 mg，于瑪瑙研缽中研磨均勻，取適量壓片成透明狀，在4 000 cm-1～400 cm-1進(jìn)行傅里葉紅外光譜儀掃描分析。

1.3.5 核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析

稱取100 mg的菲律賓蛤仔GAGs純化品，溶解于600 μL的重水（D2O），在試驗(yàn)溫度為 25℃條件下，應(yīng)用Bruker-AVANCE 600核磁共振儀進(jìn)行13C-NMR和1H-NMR圖譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔GAGs的分離純化結(jié)果

菲律賓蛤仔GAGs粗品洗脫曲線見圖1。

圖1 菲律賓蛤仔GAGs粗品洗脫曲線Fig.1 The elution curve of crude GAGs from Ruditapes philippinarum

如圖1所示，菲律賓蛤仔GAGs粗品經(jīng)DEAE-650M離子交換柱層析分離得到2個(gè)峰，GAG-1和GAG-2，分別為 0.50、0.75 mol/L NaCl溶液洗脫部分。經(jīng)檢測(cè)，GAG-1的糖胺聚糖含量較高，為89.56%，是粗品的1.82倍，而GAG-2含量很低。收集峰GAG-1，經(jīng)透析、凍干后得淺黃色的菲律賓蛤仔GAGs純化品，顏色較粗品的淺褐色淡，說明DEAE-650M離子交換柱層析可以起到脫除色素的作用。

2.2 菲律賓蛤仔GAGs紫外光譜分析

利用紫外光譜對(duì)菲律賓蛤仔GAGs粗品、GAG-1和GAG-2分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菲律賓蛤仔GAGs粗品、純化品紫外光譜分析Fig.2 The UV spectrum of crude GAGs，GAG-1 and GAG-2 from Ruditapes philippinarum

由圖2可知，菲律賓蛤仔GAGs粗品、GAG-1和GAG-2 3個(gè)樣品的紫外光譜曲線基本重疊，在200 nm左右波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)，說明其含有羧基；在250 nm～280 nm波長(zhǎng)處有小吸收峰，說明可能含有少量的核酸或蛋白質(zhì)雜質(zhì)[23]。而GAG-1和GAG-2在260 nm和280 nm處的吸收與GAGs粗品相比有所降低，說明經(jīng)過DEAE-650M柱層析后除去了少量的雜質(zhì)，起到了純化的效果。

2.3 菲律賓蛤仔GAG-1紅外光譜分析

紅外光譜圖上的每個(gè)特征吸收峰，都是由相對(duì)應(yīng)的分子或原子或官能團(tuán)振動(dòng)引起的。對(duì)菲律賓蛤仔GAG-1在4 000 cm-1～400 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描，其結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 GAG-1的紅外光譜圖Fig.3 The infrared spectrum of GAG-1

由圖3可知，GAG-1在3426.62cm-1和1071.27cm-1處有強(qiáng)吸收，是因?yàn)樘欠肿觾?nèi)或分子間氫鍵的O-H伸縮振動(dòng)和O-H變角振動(dòng)（一級(jí)），說明有糖環(huán)醇羥基的存在[23]；在波數(shù)2 922.15 cm-1附近的吸收，說明是糖類的特征峰，存在糖環(huán)上亞甲基C-H伸縮振動(dòng)[23]；在波數(shù)1 645.99 cm-1附近有C=O鍵伸縮振動(dòng)的特征吸收峰，說明結(jié)構(gòu)中存在乙酰氨基[24]；而在波數(shù)1 549.49、1 383.17、1 233.75 cm-1處均為羧基的吸收峰，分別是由C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)、C=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)以及OH變角振動(dòng)引起；在波數(shù)927.03 cm-1處有吡喃環(huán)吸收峰，說明存在非對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)；在波數(shù)848.32 cm-1附近的吸收峰，說明結(jié)構(gòu)中存在硫酸基[25]。以上現(xiàn)象均說明GAG-1具備糖胺聚糖的基本特征[26]。由圖3分析可知，菲律賓蛤仔GAG-1含有羧基、乙酰氨基、硫酸基等。

2.4 菲律賓蛤仔GAG-1核磁共振分析

一維核磁共振氫譜（1H-NMR）一般可用于分析糖苷鍵構(gòu)型，大多數(shù)質(zhì)子共振峰集中在化學(xué)位移δ 3.0～4.5，圖譜峰重疊較嚴(yán)重[27]。一維核磁共振碳譜（13C-NMR）可用于測(cè)定糖殘基數(shù)目、異頭碳構(gòu)型、糖鏈的連接位置等，但因其測(cè)定的化學(xué)位移值范圍較大，致使其具有信號(hào)重疊少、分辨率高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多糖結(jié)構(gòu)的測(cè)定[28]。對(duì)菲律賓蛤仔GAG-1分別進(jìn)行1H-NMR和13C-NMR圖譜掃描檢測(cè)，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 菲律賓蛤仔GAG-1的1H-NMR圖譜Fig.4 The1H-NMR spectrum of GAG-1 from Ruditapes philippinarum

圖5 菲律賓蛤仔GAG-1的13C-NMR圖譜Fig.5 The13C-NMR spectrum of GAG-1 from Ruditapes philippinarum

在1H-NMR譜（圖4）中，化學(xué)位移1.99處的峰為GlcNAc的甲基信號(hào)[15]?；瘜W(xué)位移3.5～4.5之間是糖環(huán)上各氫信號(hào)；化學(xué)位移3.93和3.73處分別為GlcNAc和Gal的H2吸收峰；化學(xué)位移4.27和4.14處分別為Gal的H3和GlcNAc的H4吸收峰；化學(xué)位移4.50處為Gal H1吸收峰。由于化學(xué)位移4.95是α吡喃糖H1質(zhì)子和β構(gòu)型吡喃糖H1質(zhì)子化學(xué)位移的分界點(diǎn)[29]，圖4中沒有大于4.95的峰，說明菲律賓蛤仔GAG-1的糖環(huán)構(gòu)型為β-構(gòu)型[30]。

在13C-NMR譜圖（圖5）中，化學(xué)位移22.50處為GlcNAc-C2位上的乙?；屑谆辗?。化學(xué)位移61.02和68.66處分別是6-硫酸化-GlcNAc-C6和6-硫酸化-Gal-C6的吸收峰。而非端基碳（C2、C3、C4和 C5）未發(fā)生取代的信號(hào)在化學(xué)位移70.92～74.58，且共振峰重疊嚴(yán)重；化學(xué)位移77.34處的峰取代質(zhì)子信號(hào)，表示樣品為1，4-糖苷鍵連接；化學(xué)位移104.30、103.71和103.56這3處峰比較強(qiáng)，分別是異頭碳的化學(xué)位移，且均大于103，表明這可能存在3個(gè)單糖[31]，且都是β構(gòu)型，這與1H-NMR分析結(jié)果一致?；瘜W(xué)位移177.37、174.99、174.05處為己糖醛酸羧基或乙酰氨基的信號(hào)[32]。

因此，綜合1H-NMR和13C-NMR圖譜分析結(jié)果，說明菲律賓蛤仔GAG-1是以β-D-Glc（1→4）-為主要的連接方式。但是由于GAG-1的糖胺聚糖含量只有89.56%，純度不高，1H-NMR和13C-NMR兩種圖譜雜峰較多，無法精確判斷糖殘基的類型和相對(duì)含量。

3 討論與結(jié)論

本文采用水酶法從菲律賓蛤仔中提取了GAGs粗品，經(jīng)DEAE-650M柱層析純化后得到GAG-1和GAG-2等2個(gè)組分，其中GAG-1的糖胺聚糖含量為89.56%，比粗品提高了82.43%，而GAG-2含量很低。通過光譜檢測(cè)可以判斷分離純化后的菲律賓蛤仔GAG-1的分子結(jié)構(gòu)中存在羧基、乙酰氨基、硫酸基等基團(tuán)，與王瑞芳等[33]的研究結(jié)果類似，她們分離的菲律賓蛤仔糖胺聚糖F-1-1主要含有氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖等。同時(shí)，通過NMR檢測(cè)分析結(jié)果顯示菲律賓蛤仔GAG-1的單體為吡喃型，并以β-D-Glc（1→4）-為主要連接方式，與范秀萍等[34]等分離出的菲律賓蛤仔糖胺聚糖RG-1相吻合，RG-1主要由葡萄糖、氨基半乳糖和半乳糖通過1→6、1→4或1→4、6鍵連接構(gòu)成主鏈，在主鏈中還含有大量半乳糖醛酸。但是，本研究對(duì)于菲律賓蛤仔GAG-1的分離純化及結(jié)構(gòu)分析還不夠，紫外光譜顯示還存在著微量的核酸或蛋白質(zhì)雜質(zhì)，有待于今后結(jié)合凝膠色譜等其他手段進(jìn)一步純化，再采用二維核磁共振、高碘酸氧化、質(zhì)譜、Smith降解等方法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以便為糖胺聚糖構(gòu)效關(guān)系的研究提供參考依據(jù)。