劉鑫陽，宋忠云，楊 晨，和秋菊，易傳輝，朱恩驕

(1.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，昆明 650224；2.云南省森林災害預警與控制重點實驗室，昆明 650224; 3.西南林業(yè)大學云南生物多樣性研究院，昆明 650224；4.云南林業(yè)職業(yè)技術學院，昆明 650224)

【研究意義】胡蜂通常稱為黃蜂或馬蜂，為膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)昆蟲的總稱，主要包括胡蜂亞科(Vespinae)、馬蜂亞科(Polistiinae)、蜾蠃亞科(Eumeninae)等6個亞科，全世界已記錄5445種(亞種)，其中中國記錄290種(亞種)，胡蜂屬昆蟲17種[1-4]。金環(huán)胡蜂(VespamandariniaSmith, 1852)屬膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)胡蜂屬(Vespa)中性情兇猛、體型最大的捕食性肉食昆蟲，俗稱“虎頭蜂”[5]，具有極高的食用、藥用、生態(tài)和保健價值[6-7]?！厩叭搜芯窟M展】近年來，由于市場對胡蜂蛹的需求急劇增加，促進了金環(huán)胡蜂人工養(yǎng)殖的快速興起，目前已遍布南方各地。但由于技術不成熟，許多關鍵養(yǎng)殖技術有待突破，僅能實現(xiàn)交配、人工越冬和初巢階段的人工養(yǎng)殖；同時，目前人工養(yǎng)殖存在其它嚴重問題，如對蜜蜂的危害，特別是對養(yǎng)殖蜜蜂的危害極其嚴重，部分地方造成胡蜂養(yǎng)殖農(nóng)戶和蜜蜂養(yǎng)殖農(nóng)戶的嚴重對立和沖突[8]。目前對金環(huán)胡蜂的研究主要集中在生物學特性等方面[9-10]，部分研究涉及危害防控等方面[11]，少數(shù)研究涉及遺傳多樣性與線粒體全基因組研究[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c】到目前為此，未見利用mtDNACOⅠ基因?qū)θ斯ゐB(yǎng)殖金環(huán)胡蜂遺傳多樣性相關研究。線粒體基因具有高度保守性、原始系遺傳、進化速度快等特點，被廣泛用于昆蟲分類、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳、物種起源和分化等領域研究[14]。【擬解決的關鍵問題】本研究選用線粒體COⅠ基因標記，對云南主要人工養(yǎng)殖區(qū)金環(huán)胡蜂遺傳多樣性進行研究，以期弄清養(yǎng)殖種群遺傳多樣性狀況，為該昆蟲科學養(yǎng)殖和對蜜蜂與其它生物多樣性的危害管理提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 COⅠ序列試驗樣品

供試金環(huán)胡蜂共237頭，收集時間為2017年11月至2019年10月，收集地為云南省人工養(yǎng)殖最主要的8個地級市(表1)。將收集到的金環(huán)胡蜂浸泡在45 mL無水乙醇離心管中，記錄采集的地理位置和時間，置于-20 ℃冰箱中備用。

表1 金環(huán)胡蜂樣品采集信息Table 1 Sample collection information of Vespa mandarinia

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 取金環(huán)胡蜂胸部肌肉10 mg，選用Magen公司的HiPureInsectDNAKit試劑盒，并參考其說明書步驟提取DNA。試驗后將DNA儲存于2～8 ℃冰箱中備用；若時間較長，則儲存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴增與測序 鑒定用COⅠ基因上游引物L1490為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，下游引物H2198為5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[15]。PCR反應體系為30 μL，其中DNA模板3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，LATaqPreMix15 μL，ddH2O10 μL。擴增反應在GmbH Power Cycler SL 96型PCR擴增儀上完成，反應程序為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性40 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增結(jié)果通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 首先使用Bioedit對獲得所有原始序列進行比對分析[16]，計算堿基組成；再利用DNAsp 5.0軟件分析序列多態(tài)性[17]，序列單倍型多樣性、核苷酸多樣性等。用Arlequin 3.5軟件進行分子方差分析(AMOVA)，并計算群體間的分化水平(Fst)[18]。用DNAsp 5.0軟件分析序列單倍型，并導出單倍型序列，利用Popart 1.7軟件繪制單倍型中介網(wǎng)絡圖[19]；利用MEGA軟件構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進化樹，并對其起源和系統(tǒng)發(fā)育進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列堿基組成及變異

截取比對后的600 bp編碼區(qū)序列進行分析。在金環(huán)胡蜂線粒體COⅠ基因中A、G、T、C 4種堿基的平均含量為29.62%，12.81%，38.44%，19.13%，A+T的含量為68.05%，C+G的含量為31.95%，A+T堿基含量(68.06%)明顯高于C+G含量(31.94%)，說明COⅠ基因具有A+T堿基偏向性。序列變異分析結(jié)果顯示共有保守位點563個，變異位點37個，占分析位點總數(shù)的6.16%。變異類型主要為堿基轉(zhuǎn)換和堿基顛換，未發(fā)現(xiàn)堿基插入和缺失。在這37個變異位點中，有30個轉(zhuǎn)換位點，7個顛換位點。

2.2 群體多樣性

由表2可知，單倍型分析共發(fā)現(xiàn)12個單倍型，其中，Hap_1、Hap_2、Hap_4、Hap_6、Hap_7、Hap_8為共有單倍型，其余6個為群體獨有單倍型。其中單倍型Hap_7出現(xiàn)次數(shù)最多，為主體單倍型。從養(yǎng)殖地區(qū)來看，楚雄地區(qū)單倍型較為豐富，有7種單倍型；其次為保山地區(qū)，有4種單倍型；昆明地區(qū)有3種，普洱、紅河地區(qū)有2種，曲靖、德宏和文山均僅有1種單倍型。

表2 線粒體DNA COⅠ序列單倍型分布情況Table 2 Haplotype distribution of COⅠ sequence in mitochondrial DNA

由表3可知，整體單倍型多樣性(Hd)為0.82958。各地理群體單倍型多樣性在0～0.74100，不同地理群體差異較大，其中，以楚雄最高(0.74100)，其次為保山(0.67308)；文山、德宏和曲靖最低(均為0)。整體核苷酸平均差異數(shù)(K)為15.18387，整體核苷酸多樣性(Pi)為0.02526。核苷酸平均差異數(shù)和核苷酸多樣性均以曲靖、德宏和文山最小(均為0)；平均核苷酸差異數(shù)以楚雄的最大(16.21254)，其次為昆明(16.04505)，核苷酸多樣性以昆明最大(0.02670)，其次為楚雄(0.02698)。

表3 云南省金環(huán)胡蜂樣本采集信息與多樣性指數(shù)Table 3 Sample information and diversity index of Vespa mandariniain Yunnan

由表4可知，本研究中使用核苷酸差異(Dxy)和核苷酸凈遺傳距離(Da)來表示群體之間的核苷酸多態(tài)性。各養(yǎng)殖地區(qū)核苷酸分歧度(Dxy)在0.00009～0.05191，其中，曲靖和德宏間最大(0.05191)，保山和曲靖間最小(0.00009)；核苷酸凈遺傳距離(Da)在-0.00024～0.05164，其中普洱和昆明間最小(-0.00024)，德宏和曲靖間最大(0.05164)。

表4 線粒體DNA核苷酸分歧度(Dxy)和凈遺傳距離(Da)Table 4 Mitochondrial DNA nucleotide divergence (Dxy) and net genetic distance (Da)

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化

由表5可知，各養(yǎng)殖種群金環(huán)胡蜂種群內(nèi)遺傳距離在0.00～0.0283。其中，楚雄種群內(nèi)遺傳距離最大(0.0283)；其次為昆明(0.0279)和保山(0.0263)，文山、曲靖和德宏3個地區(qū)種群最小(均為0)。

表5 種群內(nèi)平均遺傳距離Table 5 Average genetic distance within the group

由表6可知，各養(yǎng)殖種群間遺傳距離在0.0001～0.0544，其中以德宏與普洱地區(qū)種群的遺傳距離最大(0.0544)，其次為德宏與文山種群(0.0054)，曲靖和紅河種群的遺傳距離最小(0.0001)，這說明遺傳距離與地理距離沒有關系。

表6 種群間平均遺傳距離Table 6 Average genetic distance between groups

由表7可知，分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示，50.48%的變異來源種群間，種群內(nèi)部變異為49.52%，說明遺傳變異來源于種群外部，但與種群內(nèi)部遺傳變異比例相近，差異較?。换蚍只禂?shù)Fst=0.50482，差異較顯著(P<0.001)，表明種群間分化強烈，但不同地區(qū)養(yǎng)殖種群間存在一定交流。

表7 線粒體DNA COⅠ序列分子方差分析Table 7 Amova of mitochondrial DNA COⅠ sequence

2.4 系統(tǒng)進化樹與單倍型網(wǎng)絡中介圖

由圖1可知，利用鄰接法(NJ)對12個單倍型進行聚類分析，形成了2個較為明顯的分支。其中單倍型Hap_1，Hap_2，Hap_3，Hap_4，Hap_5與Hap_6形成一個分支，說明它們間的親緣關系較近，可能來源于同一原始種群。其余單倍型形成另一個分支，表明它們可能來源于另一原始種群。

圖1 鄰接法(NJ)構(gòu)建的COⅠ基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1 Phylogenetic tree of COⅠ gene haplotype constructed by neighborhood-joining method

由圖2可知，網(wǎng)絡中介圖顯示，單倍型有較明顯的分化，形成2個主要聚類簇。其中單倍型Hap_1、Hap_2、Hap_3、Hap_4、Hap_5與Hap_6為一個聚類簇，單倍型Hap_7、Hap_8、Hap_9、Hap_10、Hap_11、Hap_12為一個聚類簇，單倍型Hap_2和Hap_7出現(xiàn)的頻率最高，包含的地區(qū)最豐富。多數(shù)單倍型之間只有1個突變位點。

3 討 論

3.1 遺傳多樣性

研究結(jié)果顯示，金環(huán)胡蜂mtDNACOⅠ基因A+T的含量為68.05%，表明mtDNACOⅠ基因具有明顯的AT堿基偏向性，與典型的昆蟲線粒體堿基組成特點相符[20]；共發(fā)現(xiàn)12個單倍型，其中6個為共享單倍型，6個為各群體獨有，表明各養(yǎng)殖種群為適應環(huán)境發(fā)生了變異，或與當?shù)匾吧N群進行了基因交流；單倍型Hap_7出現(xiàn)次數(shù)最多，該單倍型為養(yǎng)殖種群中適應性較強并廣泛分布的原始單倍型，可能來源于同一原始種群。大多數(shù)群體中都出現(xiàn)了共享單倍型，這些單倍型在金環(huán)胡蜂進化過程中相對穩(wěn)定，更適合當前環(huán)境。群體內(nèi)的線粒體單倍型多樣性較為豐富，說明該群體具有較強的環(huán)境適應能力，在云南復雜多變的生境中具有較大的生存空間。單倍型多樣性和核苷酸多樣性常被作為評價物種遺傳多樣性的重要指標，兩者相對應的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)的值越大，物種遺傳多樣性越高[21]。金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖種群整體單倍型多樣性(Hd)較高，為0.82958，但核苷酸多樣性(Pi)較低，僅為0.02526，表明不同地區(qū)養(yǎng)殖種群可能來源于少數(shù)相同原始種群，經(jīng)歷了近似于自然種群“瓶頸效應”之后短時期內(nèi)的快速擴張，核苷酸變異積累不足[22]。

每個圓圈代表一種單倍型，其大小與該單倍型出現(xiàn)的頻率成正比Each circle represents a haplotype, and its size is directly proportional to the frequency of the haplotype圖2 金環(huán)胡蜂編碼區(qū)單倍型網(wǎng)絡中介圖(COⅠ)Fig.2 Haplotype network intermediary diagram of the coding area of Vespa mandarinia(COⅠ)

3.2 群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化

各地區(qū)金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖種群組內(nèi)遺傳距離在0～0.0283，基因分化系數(shù)大(Fst=0.50482)，表明不同種群間強烈分化，可能受德宏種群影響，該原始種群主要來源于緬甸。基因分化系數(shù)的值介于0～0.05表示種群間遺傳分化程度很弱，0.05～0.15為分化中等，0.15～0.25為分化程度較大，大于0.25為分化程度很大[23]。分子方差分析顯示，50.48%的變異來源種群間，種群內(nèi)部變異為49.52%，表明遺傳變異主要來源于種群外部，但與內(nèi)部變異相近，說明各種群間存在一定基因交流，同時與當?shù)匾吧N群或外地引入種群基因交流強烈。研究結(jié)果表明，云南不同地區(qū)養(yǎng)殖的金環(huán)胡蜂原始種源來源較復雜，可能來源于少數(shù)幾個原始種群，在養(yǎng)殖過程中與當?shù)匾吧N群和外來種群(主要是緬甸種群)進行了基因交流，造成了養(yǎng)殖胡蜂單倍型多樣性高，核苷酸多樣性低，遺傳結(jié)構(gòu)與分化復雜化格局。這與云南金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖情況一致。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南人工養(yǎng)殖金環(huán)胡蜂第一代原始種源多數(shù)來源于保山龍陵，在養(yǎng)殖過程中部分地區(qū)采用了當?shù)胤N源，或與當?shù)胤N源進行了雜交，并引入了外地種源(主要是緬甸種源)。

4 結(jié) 論

云南金環(huán)胡蜂養(yǎng)殖種群單倍型多樣性較高，但核苷酸多樣性較低；各種群間的分化系數(shù)Fst強烈，遺傳變異主要來源于種群外部，但與種群內(nèi)部變異相近。表明原始種群來源于少數(shù)母種群，在養(yǎng)殖過程中原始種群后代經(jīng)歷了與本地和外地(主要是緬甸)種群的雜交，種群經(jīng)歷了快速擴張過程。研究結(jié)果對指導胡蜂人工養(yǎng)殖和危害防控具有一定意義。