李瑩，陳建玲，吳佩蔚，黃亞哲，張帥，張丹

（1.南陽市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學科，河南南陽 473400；2.鄭州大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學部，河南鄭州 450000）

子宮內膜容受性指的是子宮內膜對胚胎的接受能力，即允許胚胎粘附其上種植的特定節(jié)段，受時空嚴格控制。人的生殖內分泌周期中，子宮內膜僅有一個允許胚胎植入的敏感時期，為排卵后6~10 d，即種植窗期，此時子宮內膜對胚胎的接受性最高。據(jù)Craciunas等[1]報道，體外受精-胚胎移植著床失敗的案例中大約有2/3是因子宮內膜容受性不佳。故改善種植窗期子宮內膜容受性是提高妊娠成功率的關鍵。近年來，中藥被用于改善個體種植窗期子宮內膜容受性及促進胚胎著床的研究增多，并取得一定進展，其中，菟絲子作為中醫(yī)治療不孕類疾病的常用藥，備受矚目[2-3]。菟絲子，為旋花科植物菟絲子Cuscuta chinensisLam.的種子，味辛、甘，性平，入肝、腎經，可補腎益精，養(yǎng)肝明目，安胎，主治腰膝酸痛、胎動不安、先兆流產等病癥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，菟絲子有改善機體分泌、抗氧化、調節(jié)免疫、增強性功能等作用[4]。菟絲子黃酮為菟絲子的主要有效成分之一，對雄性、雌性鼠生殖內分泌均有調節(jié)作用[5-6]。故本研究選用菟絲子黃酮作為實驗用藥，觀察其對子宮內膜容受性的作用及其可能機制，為研發(fā)不孕癥治療藥物提供科學依據(jù)，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級成年未孕雌性SD大鼠50只，6~7周齡，體質量220~220 g；SPF級健康成年雄性SD大鼠30只，6~7周齡，體質量260~220 g。大鼠均購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。將雄性、雌性大鼠分籠飼養(yǎng)，自然光照，室內溫度24~26℃，相對濕度40%~60%，自由攝食飲水。本實驗操作均符合一般動物實驗倫理學規(guī)定。

1.2 藥物、試劑與儀器菟絲子黃酮（純度＞98%），上海譜振生物科技有限公司生產，批號：171113134412；阿司匹林，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產，批號：國藥準字J20130078。兔抗大鼠CD34一抗（北京百奧萊博科技有限公司）；雌二醇（E2）、孕酮（P）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）；兔抗大鼠白血病抑制因子（LIF）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、GAPDH等一抗（北京博奧森生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（上海古朵生物科技有限公司）；STAT3抑制劑Stattic（純度99.9%，上海澤葉生物科技有限公司）。Bio-Rad680酶標儀（美國伯樂公司）。

1.3 造模、分組與給藥對50只雌性大鼠進行陰道涂片，觀察2個動情周期，取周期比較穩(wěn)定、正常且被判定為動情前期的雌性大鼠進行編號，在實驗當日下午6點以雌雄2∶1比例合籠過夜，次日上午8點檢查陰栓。取有陰栓的40只雌性大鼠建立胚胎著床障礙模型[7]，在其妊娠第1、2天按體質量皮下注射米非司酮溶液（米非司酮片溶于芝麻油，濃度為6.25 mg/mL）2.5 mg/kg，每日1次。剩余10只大鼠設為正常組，在妊娠第1、2天皮下注射芝麻油0.4 mL/kg，每日1次。造模成功標準[8]：①每日陰道脫落細胞涂片檢查顯示大鼠動情周期紊亂、延長甚至停滯；②抽查卵巢病理切片可見以原始卵泡、初級生長卵泡為主，刺激生長卵泡與成熟卵泡減少，提示排卵障礙；③大鼠出現(xiàn)拱背、蜷縮，活動減少，反應遲鈍，出現(xiàn)脫毛、便溏等腎虛癥狀。

造模成功后，將建模大鼠隨機分為模型組、Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組，每組各10只。在妊娠第1~5天灌胃給藥：Stattic+中藥組先后給予Stattic混懸液（用生理鹽水溶解）3.75 mg/kg、菟絲子黃酮混懸液（用生理鹽水溶解）530.1 mg/kg[9]灌胃；中藥組給予530.1 mg/kg菟絲子黃酮混懸液灌胃；陽性對照組給予阿司匹林混懸液（用羧甲基纖維素鈉溶解）4.8 mg/kg灌胃；正常組和模型組給予等體積生理鹽水（4 mL/kg）灌胃。每日1次。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 觀察大鼠種植窗期一般情況 在妊娠第5天，觀察大鼠一般情況，包括眼球神采、眼瞼、皮毛、體型、活動靈敏度、飲食及清潔度。

1.4.2 ELISA法檢測大鼠血清E2、P水平 戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈采血，-20℃冰箱內保存。取腹主動脈血5 mL，于4℃、3 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，取上清。具體操作步驟嚴格按照E2、P ELISA試劑盒說明書進行。用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度值，根據(jù)標準曲線計算血清E2、P濃度。

1.4.3 觀察大鼠胚泡著床情況 脫頸處死大鼠，取出雙側子宮，計數(shù)胚泡著床大鼠數(shù)、著床胚泡數(shù)目，計算胚泡著床率。公式：胚泡著床率=著床胚泡數(shù)目/胚泡著床大鼠數(shù)。

1.4.4 HE染色法觀察大鼠子宮內膜病理組織形態(tài) 摘取子宮清洗后刮取子宮內膜，4%多聚甲醛溶液固定24 h，取出逐級乙醇脫水，二甲苯透明40 min，在子宮中段同一切面垂直石蠟包埋，制成4μm厚的切片。梯度乙醇脫蠟至水，蘇木素染色5 min，1%鹽酸酒精分化3 s，伊紅染色3 min。再梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，室溫晾干后鏡下觀察。

1.4.5 免疫組織化學染色法計測大鼠子宮內膜微血管密度（MVD）取子宮內膜石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.3%H2O2去離子水37℃孵育20 min，PBS浸泡后進行抗原修復，血清封閉。滴加CD34一抗，4℃過夜。次日滴加二抗，室溫孵育0.5 h。DAB顯色，蘇木素染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用CD34抗體標記微血管，選取腺上皮細胞周圍血管密集區(qū)5個視野測量MVD，取平均值。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠子宮內膜STAT3信號通路相關蛋白表達 取右側子宮內膜，加入蛋白裂解液裂解，勻漿離心后取等量蛋白上清樣品，加等量上樣緩沖液混勻，冷卻后上樣，進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗大鼠LIF、STAT3、p-STAT3、GAPDH等一抗（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000稀釋），室溫反應2 h，洗膜，ECL發(fā)光顯影。應用ImageJ軟件掃描各蛋白灰度值，結果以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠種植窗期一般情況比較正常組大鼠眼球有神采，眼瞼正常，皮毛有光澤，體型壯實，動作靈活，反應靈敏，飲食正常，干凈度較高；模型組大鼠眼球無神采，眼瞼多半開，皮毛稀疏無光澤，體型瘦小，反應遲鈍，活動少，清潔度差；Stattic+中藥組大鼠眼球神采欠佳，個別眼瞼半開，皮毛光澤一般，反應比較靈活，活動度和清潔度尚可；陽性對照組大鼠眼球神采、眼瞼基本正常，皮毛有光澤，體型、活動靈敏度、飲食及清潔度接近正常組。

2.2 各組大鼠血清E2、P水平計較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清E2、P水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組血清E2、P水平升高（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組、陽性對照組血清E2、P水平升高（P＜0.05）；與中藥組比較，陽性對照組血清E2、P水平升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平比較Table 1 Comparison of serum E2 and P levels among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平比較Table 1 Comparison of serum E2 and P levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較；④P＜0.01，與中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組陽性對照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 E2/（pg·mL-1）50.74±1.82 16.28±0.58①25.42±1.45①②31.17±1.78①②③43.98±1.57①②③④850.151＜0.001 P/（ng·mL-1）0.67±0.04 0.31±0.03①0.40±0.06①②0.49±0.05①②③0.56±0.07①②③④71.963＜0.001

2.3 各組大鼠胚泡著床情況比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組胚泡著床數(shù)目較少（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組胚泡著床數(shù)目較多（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組、陽性對照組胚泡著床數(shù)目較多（P＜0.05）；與中藥組比較，陽性對照組胚泡著床數(shù)目較多（P＜0.05）。

表2 各組大鼠胚泡著床情況比較Table 2 Comparison of the blastocyst nidation among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠胚泡著床情況比較Table 2 Comparison of the blastocyst nidation among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較；④P＜0.01，與中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組陽性對照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10胚泡著床大鼠數(shù)/只9 4 5 7 8胚泡著床率/%90.00 40.00 50.00 70.00 80.00胚泡著床數(shù)目/個14.99±0.42 5.15±0.24①7.95±0.31①②10.14±0.29①②③12.48±0.35①②③④733.729＜0.001

2.4 各組大鼠子宮內膜病理組織形態(tài)比較圖1結果顯示：正常組大鼠子宮內膜間質略疏松、蛻膜化，血管豐富，未見炎性細胞浸潤；模型組子宮空腔擴張，間質細胞致密，無蛻膜化表現(xiàn)，炎性細胞浸潤嚴重；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組和陽性對照組大鼠子宮內膜間質相對疏松，有蛻膜化表現(xiàn)，血管相對豐富，炎性細胞浸潤明顯減少。

圖1 各組大鼠子宮內膜病理組織形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of endometrialpathologicalhistomorphology among various groups of rats（HE staining，×200）

2.5 各組大鼠子宮內膜MVD比較表3、圖2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮內膜MVD降低（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組、陽性對照組大鼠子宮內膜MVD升高（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組、陽性對照組大鼠子宮內膜MVD升高（P＜0.05）；與中藥組比較，陽性對照組大鼠子宮內膜MVD升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠子宮內膜CD34陽性表達情況（免疫組織化學染色，×200）Figure 2 Distribution of positive CD34 expression in the endometrium in each group of rats（Immunohistochemicalstaining，×200）

表3 各組大鼠子宮內膜MVD比較Table 3 Comparison of endometrialMVD among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠子宮內膜MVD比較Table 3 Comparison of endometrialMVD among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較；④P＜0.01，與中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組陽性對照組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 MVD/（條·mm-2）3.64±0.09 2.05±0.05①2.41±0.07①②2.89±0.05①②③3.31±0.06①②③④3 860.185＜0.001

2.6 各組大鼠子宮內膜STAT3信號通路相關蛋白表達比較表4、圖3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮內膜LIF、p-STAT3蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，Stattic+中藥組、中藥組LIF、p-STAT3蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與Stattic+中藥組比較，中藥組LIF、p-STAT3蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠子宮內膜LIF、STAT3、p-STAT3 Western Blot電泳條帶圖

表4 各組大鼠子宮內膜LIF、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較Table 4 Comparison of the relative protein expression levels of LIF，STAT3 and p-STAT3 in the endometrium among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠子宮內膜LIF、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量比較Table 4 Comparison of the relative protein expression levels of LIF，STAT3 and p-STAT3 in the endometrium among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與Stattic+中藥組比較

組別正常組模型組Stattic+中藥組中藥組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 LIF 0.91±0.09 0.12±0.02①0.33±0.06①②0.59±0.07①②③273.627＜0.001 STAT3 0.95±0.04 0.96±0.05 0.93±0.06 0.95±0.07 0.503 0.683 p-STAT3 0.36±0.05 0.04±0.01①0.15±0.02①②0.29±0.03①②③209.915＜0.001

3 討論

子宮內膜容受性不良是限制女性妊娠的主要原因之一，如何提高子宮內膜容受性也是現(xiàn)代生殖醫(yī)學界的研究熱點。

胚胎著床是成功妊娠的關鍵步驟，要求子宮內膜呈接受態(tài)，胚泡發(fā)育成熟并有侵入性，經歷漸進性局部組織血管重建過程，最終由發(fā)育正常的胚泡順利植入子宮內膜[10]。胚胎著床障礙是不孕癥發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié)，與時相“種植窗期”相吻合，因此本研究建立胚胎著床障礙大鼠模型，模擬不孕癥的病證變化，分析菟絲子黃酮對大鼠種植窗期子宮內膜容受性的作用及可能機制。本研究結果顯示，與模型組比較，中藥組大鼠種植窗期胚泡著床數(shù)目較多，提示菟絲子黃酮可改善子宮內膜容受性，解決種植窗期的胚胎著床障礙問題。子宮內膜在種植窗期的容受性最佳，此時上皮細胞、基質細胞均發(fā)揮重要作用，并在形態(tài)上發(fā)生了改變，如間質細胞蛻膜化、血管增生。蛻膜細胞的增殖、凋亡的動態(tài)平衡是子宮內膜容受性的主要標志之一。本研究采用HE染色法觀察大鼠子宮內膜形態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，中藥組子宮間質細胞的蛻膜化表現(xiàn)突出，血管相對豐富。進一步采取免疫組織化學染色法觀察子宮內膜MVD發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，中藥組大鼠子宮內膜MVD較多。上述實驗結果共同提示：菟絲子黃酮可改善胚胎著床障礙大鼠子宮內膜形態(tài)與功能，改善血液循環(huán)，為胚胎著床奠定物質基礎。

雌二醇（E2）、孕酮（P）均由卵巢及胎盤分泌，分別為女性體內雌激素、孕激素，共同維持正常生理過程[11]。E2水平穩(wěn)定延續(xù)至分泌中晚期，對種植窗期子宮內膜容受性有重要意義，若含量過低可影響內膜間質、上皮、腺體細胞發(fā)育，導致容受性降低；P在雌激素基礎上發(fā)揮作用，其主要功能是將子宮內膜轉為分泌期，方便胚胎著床，若分泌不足可延緩內膜成熟、間質蛻膜化進程。本研究結果顯示，與模型組比較，中藥組E2、P水平升高，提示菟絲子黃酮可調節(jié)胚胎著床障礙模型大鼠E2、P分泌狀態(tài)，從而調節(jié)子宮內膜容受性，便于胚胎著床。

在E2和P的協(xié)同作用下，子宮內膜組織多種因子呈時空特異性表達，共同影響胚胎著床這一復雜而精妙的過程，其中，LIF作用于STAT3信號通路，為胚胎著床機制發(fā)揮了關鍵調節(jié)作用[12]。LIF是一種生物學功能多樣化的分泌型糖蛋白，其受體廣泛分布于子宮內膜、蛻膜及胎盤等細胞膜上，其表達水平隨月經周期改變，增殖期呈低表達，分泌中、晚期呈瞬時性高表達，且分泌中期與種植窗期的時間一致，表明LIF可標記子宮內膜容受性[13]。STAT3為STATs蛋白家族中的亞型之一，可在多種細胞因子刺激下磷酸化，但在子宮內膜上皮，僅被LIF激活，且LIF在子宮內膜上僅激活STAT3，表明LIF與STAT3存在特異性[14]。本研究通過Western Blot實驗觀察了LIF、STAT3、p-STAT3等子宮內膜容受性標志物變化，結果顯示，與正常組比較，模型組、Stattic+中藥組、中藥組大鼠子宮內膜LIF、p-STAT3蛋白相對表達量降低，且模型組＜Stattic+中藥組＜中藥組，提示菟絲子黃酮可激活胚胎著床障礙模型大鼠LIF/STAT3信號通路。

綜上所述，菟絲子黃酮可能通過激活LIF/STAT3信號通路改善大鼠子宮內膜容受性。