孔星

（上海拓興生物科技有限公司，上海 200000）

20世紀(jì)80年代，Smith在絲狀噬菌體的pⅢ基因中插入了外源基因，使之可以與pⅢ基因融合，并展示在噬菌體表面，該系統(tǒng)最大的特點(diǎn)即把外源基因和噬菌體scFv聯(lián)系在一起，淘選到scFv也就等于淘選到了表達(dá)scFv的基因，因此可以利用此技術(shù)制備特異性抗體[1]。本文中應(yīng)用的是絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中的pⅢ展示系統(tǒng)，噬菌體scFv在M13KO7輔助下感染大腸桿菌，經(jīng)過多輪“結(jié)合—洗脫—擴(kuò)增”篩選，可富集到大量特異性的噬菌體抗體，經(jīng)過免疫學(xué)試驗(yàn)檢測，基因工程方法構(gòu)建至真核表達(dá)載體中，表達(dá)出完整的抗體IgG[2]。本文選取CDT1蛋白為研究靶點(diǎn)，CDT1蛋白為DNA復(fù)制過程中復(fù)制復(fù)合體，與其他蛋白一起調(diào)節(jié)DNA的再復(fù)制，因前期采用雜交瘤等技術(shù)沒有開發(fā)成功，此次選用噬菌體展示技術(shù)嘗試開發(fā)并對工藝流程進(jìn)行了優(yōu)化，具有優(yōu)化方案有以下兩點(diǎn)[3]。（1）優(yōu)化了兔源抗體基因序列的擴(kuò)增引物，通過優(yōu)化個別堿基以及加入保護(hù)堿基，保證了抗體基因庫的完整性和多樣性，以保障足夠的庫容量去淘選特異性抗體。（2）在最后一輪淘選后，噬菌體scFv分樣于96孔板中，并通過增加免疫印跡試驗(yàn)檢測，對scFv的特異性和親和性進(jìn)行深入篩選，以提高獲取完整抗體IgG的產(chǎn)率和準(zhǔn)確率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多肽，吉爾生化（上海）有限公司合成；引物，鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成；mRNA提取試劑盒，KR107，天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶，KT201，日本Takara公司；pCANTAB5E質(zhì)粒，上海拓興生物科技有限公司保存，來源于瑞典Amersham公司；2×YT培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；M13KO7輔助噬菌體，美國Thermo Fisher公司；氨芐青霉素和卡那霉素，生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠抗M13-g8p抗體，英國Abcam公司；FreeStyle?293表達(dá)系統(tǒng)，美國Thermo Fisher公司；MabSelect SuRe蛋白A層析填料，美國GE Healthcare公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EDC-810型PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司；X1R型離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司。

1.3 制備scFv基因庫

以CDT1蛋白（蛋白號：Q9H211）設(shè)計抗原序列（CHITARLAHQTRAEEGL）免疫兔子。5次免疫，確定抗體有效價后，血液及脾臟里的B淋巴細(xì)胞均作為模板提取mRNA。分子生物學(xué)操作技術(shù)均參照《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[4]。

本文對所使用的引物分兩次設(shè)計。首先根據(jù)已有的兔源抗體基因以及上傳至NCBI上的序列作序列比對，在恒定區(qū)域內(nèi)找出完全一致的序列區(qū)域，在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)截取了10段序列作引物作首次擴(kuò)增引物測試，滿足引物的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)，在PCR結(jié)果中選取最干凈最亮的作為備選引物，在這對引物的基礎(chǔ)之上，刪減或增加堿基以及添加保護(hù)堿基來增加引物擴(kuò)增效率。根據(jù)所設(shè)計的引物，重鏈引物名稱為HCF1、HCR1，輕鏈引物名稱為LCF1、LCR1，進(jìn)行首次擴(kuò)增，以上述DNA片段為模板再次設(shè)計引物。用100種已知序列的DNA序列作為模板，用第1次設(shè)計的引物擴(kuò)增，PCR結(jié)果送去測序，以此來驗(yàn)證引物擴(kuò)增效率。第2次分別擴(kuò)增出VH和VL（重鏈和輕鏈的可變區(qū)域），重鏈引物名稱為HCF2、HCR2；輕鏈引物名稱為LCF2、LCR2。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，60 s；40個循環(huán)，分別回收DNA片段。第3次PCR擴(kuò)增無需引物，以第2次擴(kuò)增獲得的VH和VL基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增程序與上述一致，擴(kuò)增出帶有SfiI和NotI酶切位點(diǎn)的VH-VL片段（中間含linker），隨后插入到準(zhǔn)備好的pCANTAB 5E載體中，成為scFv文庫。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 噬菌體表面展示文庫的構(gòu)建

為了最大化地擴(kuò)充庫容量，將上述構(gòu)建的scFv基因庫多次轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，次日用細(xì)胞刮刀刮下LB（Luria-Bertani Broth）固體瓊脂板上所有的菌落，接入含有氨芐青霉素的50 mL 2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h至對數(shù)期，此時可以表達(dá)F性鞭毛。加入M13KO7（1×1011pfu/mL），37 ℃培養(yǎng) 1 h，14 000 r/min離心10 min，重懸沉淀于200 mL 2×YT培養(yǎng)基中（含有氨芐青霉素和卡那霉素），37 ℃過夜培養(yǎng)。將過夜的培養(yǎng)液14 000 r/min離心15 min，200 mL的上清加入 50 mL PEG/NaCl（20%PEG-8 000，2.5 mol/L NaCl）溶液并放置于冰上1 h。14 000 r/min離心30 min，倒掉上清。用5 mL PBS懸浮沉淀，即得噬菌體scFv文庫。將所得文庫做梯度稀釋 1×10-4、1×10-6、1×10-8、1×10-10和1×10-12，測定噬菌體scFv文庫的滴度。

1.5 特異性scFv的篩選

將CDT1蛋白的抗原溶于PBS溶液里，包被在高親和力細(xì)胞培養(yǎng)皿中，為淘選到親和力高的scFv，后兩輪的包被抗原量逐漸降低。次日加牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）封閉，洗去封閉液后加入上述步驟的噬菌體scFv文庫，室溫孵育2 h，用含吐溫的PBS溶液洗掉未結(jié)合的噬菌體（每一輪漂洗20次），用100 mmol/L TAE（Tris-Acetic-EDTA）緩沖液洗脫結(jié)合在抗原上的噬菌體，溶于Tris-HCl緩沖液后再次感染處于對數(shù)生長期的TG1細(xì)胞，取小樣稀釋一定的梯度測定被洗脫出來噬菌體侵染的細(xì)菌個數(shù)（測定滴度）。對數(shù)生長期的TG1細(xì)胞培養(yǎng)3 h后，經(jīng)M13KO7超感染，次日離心回收上清，通過沉淀、吸附以及洗脫得到重組噬菌體抗體次級庫并測定其滴度（具體步驟同噬菌體表面展示文庫的構(gòu)建）。重復(fù)吸附-洗脫-擴(kuò)增過程3次,得到富含對CDT1蛋白有親和性的噬菌體scFv抗體四級庫。對每一輪篩選均測定文庫滴度以及富集率，作為特異性噬菌體scFv富集的指標(biāo)，富集率的計算公式如下：

1.6 特異性scFv的檢測

上述噬菌體scFv抗體四級庫，取50%低溫保存于甘油中，剩余的在M13KO7輔助感染下，產(chǎn)生五級庫。上清液稀釋在96孔高親和力酶標(biāo)板中，取少量上清液做酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測，上清加入到包被多肽的酶標(biāo)板中反應(yīng)1 h，PBST（PBS-Tween-20）洗滌3次,加入小鼠抗M13-g8p抗體和HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，經(jīng)底物TMB（四甲基聯(lián)苯胺）顯色后，于波長450 nm測定OD值，高于陰性值5倍的視為陽性。選擇293細(xì)胞作免疫印跡試驗(yàn)樣本，隨機(jī)挑選上述OD值最高的10孔檢測，加入小鼠抗M13-g8p抗體和HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h，經(jīng)ECL發(fā)光底物曝光，有主帶的視為陽性，記下陽性孔的編號。免疫學(xué)操作均參照《免疫學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用》[5]。

1.7 完整抗體的表達(dá)和檢測

上述步驟的陽性孔的噬菌體感染處于對數(shù)生長期的TG1細(xì)胞，鋪于瓊脂板上過夜，第二天挑取10個菌落，接種于2×TY培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，取2 μL作為模板，分別擴(kuò)增重鏈和輕鏈，回收DNA片段后插入到準(zhǔn)備好的真核表達(dá)載體中（包含抗體恒定區(qū)），酶切鑒定質(zhì)粒正確后轉(zhuǎn)入生產(chǎn)。抗體生產(chǎn)體系使用FreeStyle?系統(tǒng)。細(xì)胞上清液用Protein A親和純化抗體?？贵w保存于PBS緩沖液中，濃度定在1 mg/mL。選擇HeLa細(xì)胞作為免疫熒光試驗(yàn)樣本，使用帶有FITC的二抗，二抗稀釋比例參照使用說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 scFv基因庫的構(gòu)建

用已知的100種DNA序列作模板，通過PCR第一次擴(kuò)增，測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增準(zhǔn)確率為100%。兩次PCR擴(kuò)增出抗體的VH和VL，VH長度在370 bp，VL長度在380 bp，連接后的VH-linker-VL長度在750 bp，連入載體后，經(jīng)過酶切鑒定，條帶位置正確。

2.2 噬菌體表面展示文庫滴度測定

為了便于試驗(yàn)操作和計算，把每一輪的投入克隆數(shù)都調(diào)成8×1012。表2顯示每一輪的富集率是逐漸提高的，為了提高淘選的親和力，后兩輪的包被抗原量逐漸減少，洗脫下來的噬菌體scFv滴度明顯增加，第4輪富集率為第1輪富集率的80倍，表明在淘選過程中噬菌體scFv得到很大程度富集。

表2 滴度測定和富集率

2.3 特異性噬菌體scFv的鑒定

經(jīng)ELISA檢測后，有10孔以上的陽性孔，表明噬菌體scFv具有特異性和親和力。挑選OD值高的孔做免疫印跡試驗(yàn)。圖1為選取其中一孔的試驗(yàn)結(jié)果，箭頭處即為蛋白位置，與生物信息學(xué)預(yù)測相一致。圖中總體稀釋比偏低，且有雜帶，與單鏈抗體只有一個識別區(qū)域有關(guān)系，與完整抗體相比，scFv的特異性相差無幾，但是親和力不足，如果將此scFv轉(zhuǎn)換成完整抗體后，特異性不變，親和力增加，就可以證明scFv轉(zhuǎn)換成完整抗體是成功的。

圖1 scFv免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果

2.4 完整抗體免疫學(xué)試驗(yàn)

將上述scFv用PCR方法轉(zhuǎn)換成完整抗體后，經(jīng)酶切鑒定，插入片段大小正確。通過真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，親和純化后，ELISA檢測后確定有特異性完整抗體。用HeLa細(xì)胞作樣本，進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，圖2顯示蛋白定位于細(xì)胞核中，與生物信息學(xué)預(yù)測相一致；每個細(xì)胞均與抗體結(jié)合上，顏色較亮（DAPI染色HeLa細(xì)胞核顯藍(lán)色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗顯綠色），表明親和力較高，證明了此scFv轉(zhuǎn)換成完整抗體是成功的。

圖2 完整抗體免疫熒光試驗(yàn)

3 結(jié)論

本文概述了噬菌體展示技術(shù)篩選兔源抗體的工藝流程，其中包括兩方面優(yōu)化方案。優(yōu)化后的方案，首先在建文庫階段就最大化地囊括了抗體基因，讓篩選到特異性抗體的概率大大提高；其次在檢測階段加入了免疫印跡試驗(yàn)，相當(dāng)于進(jìn)一步地去篩選特異性抗體，讓scFv轉(zhuǎn)換成完整抗體后，抗體檢測時成功率更高。此方案繞過了雜交瘤等傳統(tǒng)方法，直接獲得抗體基因，但是想要擴(kuò)增出所有的抗體基因，還需要對引物持續(xù)優(yōu)化改造。

該方案成功運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)篩選到了具有特異性和親和力的兔源單克隆抗體，但同時存在不足不處，科研工作者可以從生物體內(nèi)淘選到特異性的scFv，因?yàn)楣ぷ餍枨筮€需將此scFv轉(zhuǎn)換成完整抗體IgG，但是從結(jié)構(gòu)和功能上來看，scFv與完整抗體IgG是有差異的，scFv不能等同于完整抗體。這就造成了淘選到的scFv最后轉(zhuǎn)換成完整抗體時，檢測結(jié)果與scFv階段不一樣，甚至特異性都發(fā)生了變化，造成轉(zhuǎn)換后的完整抗體IgG不能使用。出現(xiàn)這種情況，只能再次篩選保存起來的scFv文庫或者宣告試驗(yàn)失敗，增加了時間和試驗(yàn)成本。因此就目前來看，此方案暫時還不能做為單克隆抗體篩選的主要方式，可以作為備選方案。當(dāng)傳統(tǒng)方法沒有篩選到特異性的抗體，可以用備份的脾臟或血液嘗試噬菌體展示技術(shù)，篩選特異性抗體。