盧 琪，薛淑靜，楊 德，王少華，李 露

（湖北省農業(yè)科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北武漢 430064）

羊肚菌又稱羊蘑、羊肚菜、羊肚蘑等，屬子囊菌門羊肚菌科[1]，是一種名貴的珍稀食用菌。羊肚菌因味道鮮美，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質、多肽、多糖、酚類、維生素和微量元素等，同時兼具營養(yǎng)和藥用價值而廣受人們的歡迎[2?4]。相關研究證明，羊肚菌具有多種功能活性，如抗氧化、調節(jié)免疫力、抗腫瘤、降血脂、降固醇、保肝健胃等[5?7]。此外，羊肚菌因富含氨基酸和呈味核苷酸，味道鮮美，具有風味產品加工潛力。

近年，我國羊肚菌菌種馴化已取得有效進展，種植技術日益成熟，使得國內羊肚菌種植面積日益增加，產量逐年大幅提升[8?9]。目前，國內羊肚菌主要以鮮品、凍品和干品形式在市場上流通，相關精深加工產品主要以羊肚菌輔與禽肉，制作成菌肉湯料包的形式[10?11]。羊肚菌菌湯清淡、細膩、鮮味十足，深受大眾喜愛，而羊肚菌菌湯的加工方式和風味成分尚無詳細研究。如何通過加工手段獲取優(yōu)質的羊肚菌菌湯是本文研究的關鍵。

加工手段對羊肚菌營養(yǎng)成分和呈味物質釋放的影響是羊肚菌菌湯提質升級的關鍵。熱處理是食用菌菌湯加工的常用手段。隨著加工手段的變革，非熱加工如超高壓、均質及超聲處理也常用于食品加工。目前，熱加工對羊肚菌菌湯成分影響的研究，僅限于溫度、料液比等因素的探討[9]，然而非熱加工對羊肚菌品質的影響尚有欠缺。

本文擬采用熱加工（70、90 ℃）和非熱加工（室溫、超聲、均質和超高壓），處理不同粒徑的羊肚菌，制備水提液。對比各水提液的鮮味及抗氧化性能，篩選出最優(yōu)處理工藝，以期為羊肚菌的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌（Morchella esculenta） 于2019 年12月采收于湖北武漢；呈味核苷酸（5’-CMP、5’-UMP、5’-XMP、5’-GMP、5’-IMP 和5’-AMP）、抗壞血酸、2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）、1,3,5-三（2-吡啶基）-2.4.6-三嗪（TPTZ） 源葉生物科技有限公司；游離氨基酸 Sigma-Aldrich 公司；ABTS 試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；甲醇 Fisher 公司。

Multiskan GO 酶標儀 美國Thermo Fisher 公司；LC-20AT HPLC 系統(tǒng) 日本Shimadzu 公司；L-8900 氨基酸分析儀 日本Hitachi 公司；XHF-DY高速均質機 寧波新芝生物科技有限公司；KQ5200DE 超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；HPP-650 超高壓設備 天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司；YR-6L 超微粉碎機 濟南銀潤包裝機械有限公司；winner 3003 激光粒度分析儀濟南微納科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同粒徑羊肚菌菌粉制備 新鮮羊肚菌經50 ℃熱風干燥后，粉碎，過80 目篩，再進行超微粉碎0、10 和30 min。三種處理對應的羊肚菌粉末粒徑D90分別為（180.79±2.05）、（35.52±1.08）和（6.28±0.17）μm，用P1、P2 和P3 代表上述粒徑的樣品。

1.2.2 羊肚菌水提液制備 采用熱加工和非熱加工制備羊肚菌水提液。菌粉（1.0 g）經蒸餾水（30 mL）浸泡0.5 h 后，進行下述處理：a.熱處理，上述混合物置于磁力攪拌器，70 和90 ℃條件下700 r/min 攪拌1 h。處理結束后樣品立即用冷水冷卻，抽濾；b.超聲處理（UT），上述混合物置于超聲清洗儀，40 kHz 下于室溫下提取1 h，冷卻，抽濾；c.均質（HG），上述混合物置于均質機，18000 r/min 條件下室溫處理3 min，間歇處理2 次，合并冷卻后抽濾；d.超高壓處理（HHP），上述混合物置于超高壓裝置內，500 MPa 室溫保持10 min；冷卻后抽濾；e.室溫（RT），上述混合物置于磁力攪拌器，700 r/min 攪拌1 h，抽濾，以該處理為對照。

1.2.3 5’-核苷酸分析 采用HPLC 檢測羊肚菌水提液中5’-核苷酸[12?13]。將上述上清液過0.22 μm 有機濾膜，進樣分析。流動相為A：20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH5.9）和B：100%甲醇，比例為97:3（A:B，v:v）。流速 0.5 mL/min，進樣量為10 μL，運行30 min，在254 nm 處進行紫外檢測。通過各成分的標準曲線進行定量分析，結果折算為每100 克菌粉中5’-核苷酸毫克數(shù)（mg/100 g DW）。

1.2.4 游離氨基酸（FAA）分析 采用氨基酸分析儀檢測羊肚菌水提液中FAA 含量[14]。將5.0 mL 上清液與相同體積的10%三氯乙酸混合，并在室溫下放置2 h，10000 r/min 離心5min，收集上清，調整pH 至2.2，過0.22 μm 濾膜，注入氨基酸分析儀進行分析。結果折算為每100 克菌粉中FAA 毫克數(shù)（mg/100 g DW）。

1.2.5 等鮮度EUC 計算 由鮮味氨基酸（Glu 或Asp）與5’-核苷酸之間的相互作用計算等鮮度EUC，根據(jù)以下方法計算，表示為每100 g 樣品中谷氨酸鈉的含量（g）[15?16]：

其中，ai是鮮味氨基酸（Glu 或Asp）的濃度（g/100 g）；aj是鮮味5’-核苷酸（5’-GMP、5’-AMP、5’-IMP 或5’-XMP）的濃度（g/100 g）；bi是鮮味氨基酸的鮮味相對濃度（Asp，0.077 和Glu，1）；bj是5'-核苷酸的相對鮮味濃度（5’-IMP，1；5’-GMP，2.3；5’-AMP，0.18；5’-XMP，0.61）；1218 是協(xié)同作用常數(shù)。

1.2.6 抗氧化能力分析 參考前人的研究，分別采用DPPH、FRAP 和ABTS 法，綜合評價羊肚菌水提液的抗氧化能力[17?19]。DPPH 自由基清除能力和FRAP 鐵離子還原能力均以每毫升水提液中抗壞血酸當量表示（μmol AAE/mL），ABTS 自由基清除能力以每毫升水提液中Trolox 當量表示（μmol TE/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)重復三次取平均值。采用Duncan 分析進行樣本差異性分析（IBM SPSS Statistics 20.0），P<0.05 為顯著性差異。采用HemI（Heatmap Illustrator,version 1.0）用于熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 各處理條件下羊肚菌水提液5’-核苷酸含量

通過HPLC 分析，羊肚菌水提液中主要包含5’-CMP、5’-UMP、5’-XMP、5’-GMP、5’-IMP 和5’-AMP 等6 種5’-核苷酸，這幾種成分標品的色譜圖如圖1 所示，水提液中各5’-核苷酸含量詳見表1。70 ℃-P1、P2 的水提液中5’-核苷酸總含量（1432.34、1473.88mg/100 g DM）要顯著（P<0.05）高于其它處理（682.53 mg/100 g DM～1221.00 mg/100 g DM）。5’-GMP 是食用菌呈鮮味物質的主要貢獻成分[20]，該成分在90 ℃熱處理條件下的含量（128.31 mg/100 g DM～194.36 mg/100 g DM）顯著（P<0.05）高于其它處理（7.50 mg/100 g DM～79.14 mg/100 g DM），推測高溫處理有利于5’-GMP 溶出至水提液。

表1 不同加工方式對羊肚菌水提液中5’-核苷酸含量的影響 （mg/100 g DM）Table 1 Effects of different processing methods on 5’-nucleotide content in Morchella esculenta water extract (mg/100 g DM)

圖1 5’-核苷酸標準品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 5’-nucleotide standards

70、90 ℃和HG 處理條件下，5’-核苷酸總含量隨著粒徑的減小呈現(xiàn)先增后減的趨勢，而UT 和HHP 處理中5’-核苷酸總含量隨著粒徑的減小而增加。推測過度粉碎的菌粉（P3）在70、90 ℃和HG處理下，可能導致5’-核苷酸的破壞，而相對溫和的非熱處理UT 和HHP，會進一步促進菌粉（P3）中5’-核苷酸的溶出。與未超微粉碎相比（P1），超微粉碎（P2 或P3）不同程度地提升羊肚菌水提液5’-核苷酸含量。5’-IMP 是除了5’-GMP 外的鮮味貢獻成分，5’-IMP 經過脫氨基作用生成5’-AMP，具有抑制苦味突出甜味的作用[21]。本研究中70 ℃-P2 中5’-IMP含量最高（541.54 mg/100 g DM），而HG-P2 中5’-AMP含量最高（469.36 mg/100 g DM），可能是由于HGP2 條件下5’-IMP 能更有效地轉化為5’-AMP。5’-CMP 和5’-UMP 對食用菌鮮味成分無貢獻，二者均在UT-P3 中含量豐富。5’-XMP 對食用菌鮮味的貢獻介于5’-IMP 和5’-AMP 之間，該成分占5’-核苷酸中含量較低，RT 和UT 處理中僅在超微粉P3 中微量檢測到，而70 ℃-P3 中5’-XMP 的含量最高，也僅占5’-核苷酸的5.50%，該結論與前人的研究結果一致[22]。

2.2 各處理條件下羊肚菌水提液離氨基酸（FAA）含量

游離氨基酸能為食用菌水提液提供鮮味成分和愉悅的口感。不同加工方式得到羊肚菌水提液中游離氨基酸含量如表2 所示。超高壓（HHP）是一種非熱處理技術，能保持食品的感官特性和營養(yǎng)價值，該技術能通過破壞細胞壁、提高細胞膜通透性來提高有效成分的溶出[23]。三種粒徑下，超高壓技術處理得到的羊肚菌水提液中總游離氨基酸的含量（4264.19 mg/100 g DM～5882.81 mg/100 g DM）要顯著高于其它處理（P<0.05），其中鮮味氨基酸（1513.28 mg/100 g DM～2191.22 mg/100 g DM）和甜味氨基酸含量（1075.68 mg/100 g DM～1684.18 mg/100 g DM）尤為豐富。本研究的水提液中尚未檢測到脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）和蛋氨酸（Met），而張楠等[9]在羊肚菌的菌柄中檢測到上述成分。范婷婷等[24]在人工栽培的羊肚菌中未發(fā)現(xiàn)脯氨酸（Pro）和色氨酸（Trp），但在野生羊肚菌中各類氨基酸均能檢測到。推測產生上述差異的原因可能與羊肚菌的檢測部位、提取方式、種植手段和種植環(huán)境有關。

表2 不同加工方式對羊肚菌水提液中游離氨基酸含量的影響 （mg/100 g DM）Table 2 Effects of different processing methods on FAA content in Morchella esculenta water extract (mg/100 g DM)

各處理條件下，超微粉碎均降低了游離氨基酸的總含量，尤其70 ℃、UT、HG 和HHP 處理中游離氨基酸的總含量隨著粒徑的減小而呈降低的趨勢，其中HHP-P1 中游離氨基酸總含量最高。P1 條件下各處理的總游離氨基酸含量最高，排序為：HHP>90 ℃>70 ℃>HG>UT>RT。水提液加熱過程中發(fā)生Strecker降解和Maillard 反應，降低水提液中FAA 含量，但同時也能通過加熱促進蛋白質水解，也可能增加水提液中FAA 含量[25]。本研究中除了HHP 外，各粒徑條件下，熱處理水提液中FAA 的含量要高于其它處理，推測是加熱過程中其蛋白質水解產生的氨基酸含量高于其氨基酸降解量，其中熱處理水提液中鮮味氨基酸Asp，甜味氨基酸Ser、Thr，苦味氨基酸Leu、Ile，無味氨基酸Lys、Try 含量豐富。前人對新鮮的羊肚菌進行熱處理制作菌湯研究，其中必需氨基酸中Thr 和Lys 含量豐富，與本研究結果一致[10]，而其他非熱處理獲取羊肚菌水提液成分的相關研究相對欠缺。

RT 和HHP 處理中，鮮味氨基酸分別占32.01%～38.11%，33.31%～37.25%，是FAA 中的主要成分，而其它處理中鮮味氨基酸僅占12.26%～27.21%。相對于非熱處理，熱處理（70、90 ℃）增加了水提液中苦味氨基酸的比例32.27%～57.33%。通過等鮮度EUC 的計算，各處理的EUC 值為48.96～493.97 g MSG/100 g，HHP 處理下，各粒徑菌粉的EUC 值（265.83～493.97 g MSG/100 g）要顯著高于（P<0.05）其它處理（48.96～287.25 g MSG/100 g），其中，RT 處理下EUC 值最低（48.96 g MSG/100 g）。除RT 外，超微粉碎雖然提升羊肚菌水提液5’-核苷酸含量，但降低了提取液中呈鮮味氨基酸和總游離氨基酸（FAA）含量，使得菌粉的EUC 值從106.58 g MSG/100 g～493.97 g MSG/100 g 降低至74.70 g MSG/100 g～364.35 g MSG/100 g，推測超微粉碎可能破壞了羊肚菌的鮮味。由此，P1 條件下羊肚菌EUC 最佳，排序為：HHP>90 ℃>70 ℃>HG>UT>RT，與總FAA 含量排序一致。鮮味氨基酸和5’-核苷酸能夠協(xié)同作用增強樣品鮮味[26]，本研究中Glu 含量豐富且鮮味相對濃度為1，是水提液中主要的鮮味貢獻成分，熱處理過程中此類成分大量游離，其含量遠高于其它處理（除HHP 外）。熱加工提升了水提液EUC 值，但仍顯著小于HHP 處理（P<0.05），HHP 處理豐富了水提液鮮味成分且HHP-P1 的EUC值最高（493.97 g MSG/100 g）。

2.3 羊肚菌水提液成分的熱圖分析

為了更直觀表述18 種處理方法中羊肚菌水提液中的氨基酸和核苷酸分布情況，采用熱圖分析法對結果進行分析。如圖2 所示，熱圖中越接近藍色表示成分含量越低，越接近紅色表示成分含量越高。由圖可見，各處理中超高壓處理HHP 中各氨基酸含量較為豐富，尤其鮮味氨基酸谷氨酸含量尤其顯著。為了進一步比較各加工手段對成分含量的影響，利用熱圖進行聚類分析。除超高壓處理外，其它加工手段可單獨聚為一簇，說明加工特性能直接影響羊肚菌水提液的成分分布。具體而言，超高壓處理HHP 單獨聚為一類，該處理中各成分含量豐富，鮮味突出。熱加工（70 和90 ℃）聚為一大類，鮮味次之。其它非熱處理（UT-P1 除外），聚為一類，鮮味較差。就處理方法對羊肚菌水提液鮮味成分影響的排序為：超高壓處理>熱處理>其它非熱處理。

圖2 羊肚菌水提液中氨基酸和核苷酸含量的熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of free amino acid and nucleotide content in the water extracts of Morchella esculenta

2.4 抗氧化能力分析

本研究通過DPPH、FRAP 和ABTS 三種手段，綜合評價各羊肚菌水提液的抗氧化能力，如表3所示。其中，DPPH 法代表了樣品清除自由基的能力，F(xiàn)RAP 法展現(xiàn)了體系的還原能力，而ABTS 法反映體系的總抗氧化能力[27]。本研究中除了熱處理外，其它非熱加工（RT、UT、HG 和HHP）水提液的DPPH、FRAP 和ABTS 值均隨著菌粉的粒徑減小而呈下降趨勢，可能是由于超微粉碎過程中的劇烈處理破壞了菌粉中的天然活性成分，如酚類、甾醇、氨基酸等。熱處理常被證明能破壞食品體系的抗氧化能力[28?29]，本研究熱處理同樣降低了水提液的抗氧化能力，同一粒徑下熱處理水提液的FRAP和ABTS 值均要低于其它處理。HHP 處理下，各粒徑水提液的抗氧化能力均要優(yōu)于其它處理，推測HHP處理更有利于抗氧化成分在水提液中溶出。HHPP1 具有最高的抗氧化能力，該處理下羊肚菌水提液的DPPH、FRAP 和ABTS 值要顯著（P<0.05）高于其它處理。

表3 不同處理條件下羊肚菌提取液抗氧化能力對比Table 3 The comparison of antioxidant abilities of Morchella esculenta extracts processed by different methods

3 結論

本文研究結果表明，超微粉碎處理組（P2 或P3）不同程度地提升了羊肚菌水提液中5’-核苷酸含量，但超微粉碎對羊肚菌水提液中FAA 總含量具有破壞性，未超微粉碎條件下（P1）各處理FAA 總含量最高，排序為:HHP>90 ℃>70 ℃>HG>UT>RT；90 ℃熱處理條件下，羊肚菌水提液中鮮味主要貢獻成分成分5’-GMP 的含量顯著（P<0.05）高于其它處理，而非熱處理HHP 顯著（P<0.05）提升了肚菌水提液中鮮味氨基酸含量，使得該處理條件下各組羊肚菌水提液均有最優(yōu)的EUC 值；熱處理整體降低了羊肚菌水提液抗氧化能力。最終研究結果發(fā)現(xiàn)，HHP-P1 具有最高EUC 值和抗氧化能力，適用于羊肚菌水提液加工。本研究為羊肚菌的精深加工提供參考。