晁岳恩

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，河南鄭州 450002)

小麥?zhǔn)鞘澜缟蠌V泛種植的農(nóng)作物之一，可加工成多種多樣的食品。在成熟的小麥籽粒中，貯藏蛋白的含量約占籽粒干重的10%～15%[1]，其含量和類型影響著面筋的強(qiáng)度和粘彈性，決定了小麥面粉的最終加工用途[2-4]。

面筋蛋白主要由麥谷蛋白和醇溶蛋白組成，麥谷蛋白按分子量大小又可分成高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)、低分子量麥谷蛋白(LMW-GS)。通常認(rèn)為，HMW-GS約占小麥貯藏蛋白的10%左右，通過分子間或分子內(nèi)二硫鍵作用形成面筋骨架，決定著面團(tuán)的強(qiáng)度和延展性[5-7]。LMW-GS約占小麥貯藏蛋白三分之一，占麥谷蛋白的60%左右，由于其編碼基因拷貝數(shù)多、分子量小、且在電泳圖譜上與大量的醇溶蛋白重疊，因而有關(guān)LMW-GS及其編碼基因與品質(zhì)參數(shù)之間關(guān)系的報(bào)道相對較少[8]。有研究認(rèn)為，LMW-GS與面團(tuán)強(qiáng)度有密切關(guān)系[9-11]。

醇溶蛋白約占小麥貯藏蛋白的40%左右，在食品加工時，以單體蛋白形式通過非共價鍵作用結(jié)合到面筋中，主要影響面團(tuán)的粘性和延展性。也有研究認(rèn)為，醇溶蛋白也可以通過分子間二硫鍵結(jié)合到面筋中，進(jìn)而影響面團(tuán)的強(qiáng)度[12-14]。

小麥面粉蛋白類型復(fù)雜，由于缺乏簡單可行的蛋白質(zhì)量評價模型，不同蛋白類型對面粉品質(zhì)的貢獻(xiàn)難以量化比較。研究表明，面粉蛋白中的自由巰基和二硫鍵對面團(tuán)結(jié)構(gòu)及面團(tuán)穩(wěn)定性有重要影響[15-17]。當(dāng)面粉加水揉混時，面粉蛋白質(zhì)的自由巰基與分子內(nèi)或分子間其他巰基相互結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價二硫鍵，決定著面筋的結(jié)構(gòu)和特性[17-19]。因此，面團(tuán)的二硫鍵是決定面團(tuán)流變學(xué)特性及烘焙質(zhì)量的關(guān)鍵因素[20-22]。面粉蛋白的巰基含量與面粉質(zhì)量相關(guān)性是否顯著、可否利用巰基含量量化蛋白與面粉質(zhì)量的關(guān)系尚未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬分析面粉質(zhì)量與巰基集團(tuán)相關(guān)性，并構(gòu)建面粉不同蛋白類型對其質(zhì)量貢獻(xiàn)的量化評價模型，為小麥面粉蛋白的研究提供參考評價工具。

1 材料與方法

1.1 材 料

在2017-2018年度，11個不同品質(zhì)類型的小麥品種(鄭麥366、新麥26和西農(nóng)979為強(qiáng)筋品種；周麥32、鄭麥379、鄭麥119、鄭麥101和鄭麥158為中強(qiáng)筋品種；矮抗58、鄭麥369為中筋品種；鄭麥103為中筋品種但品質(zhì)接近弱筋)種植在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，管理同當(dāng)?shù)卮筇?，成熟、收獲后磨粉，測定品質(zhì)特性及巰基含量。

1.2 方 法

1.2.1 磨粉及面粉品質(zhì)指標(biāo)測定

制粉：參照AACC 26-20方法，用BUHLER實(shí)驗(yàn)?zāi)ツシ?，根?jù)籽粒的硬度確定潤麥加水量，硬麥為16.5%，中等類型為15.5%，軟質(zhì)麥為 14.0%，潤麥時間為16～18 h。面粉水分含量按AACC-4-15A測定。

面筋參數(shù)：用瑞典Perten公司的2200型面筋儀(Glutomatic)，按GB/T 14608-93測定小麥粉濕面筋含量及濕面筋指數(shù)。

粉質(zhì)參數(shù)：用德國Brabender公司的810104型粉質(zhì)儀(Farinograph)，按GB/T 14614-93測定吸水率、面團(tuán)形成時間、穩(wěn)定時間、弱化度等面團(tuán)流變學(xué)特性參數(shù)。

1.2.2 硫及巰基含量測定

硫含量檢測：稱取10 mg面粉，加入200 μL濃硝酸在95 ℃下消化30 min；115 ℃下消化90 min，冷卻至室溫后用超純水定容至1 mL。采用液相離子色譜儀(IC-2001; TOSOH,Japan)測定硫元素含量，陰離子標(biāo)準(zhǔn)液來自Wako Pure Chemicals(Japan),詳細(xì)操作采用Maruyama的優(yōu)化方法[23]。

總巰基和自由巰基含量及二硫鍵含量測定參考Wang等[24]的方法。三次重復(fù)。

1.3 蛋白評價模型建立及蛋白質(zhì)量再評價

根據(jù)面粉特性與巰基含量的相關(guān)性，建立基于自由巰基和二硫鍵含量的蛋白質(zhì)量評價模型。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載不同類型的面粉蛋白氨基酸序列(高、低分子量麥谷蛋白、醇溶蛋白、燕麥類似蛋白、硬度蛋白等)，巰基和二硫鍵含量預(yù)測使用在線程序(SCRATCH Protein Predictor：http://scratch.proteomics.ics.uci.edu)，利用評價模型對各面粉蛋白進(jìn)行評分。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 2.1對面粉質(zhì)量與巰基含量的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 面粉質(zhì)量分析

從表1可以看出，11個品種中，鄭麥158的粗蛋白含量較低(13.5%)，但面團(tuán)穩(wěn)定時間最長(16.5 min)，面筋指數(shù)達(dá)到第二高；周麥32的粗蛋白含量最高(19.8%)，面團(tuán)穩(wěn)定時間和面筋指數(shù)值處于中高位；鄭麥119含有第二高的粗蛋白含量和最高濕面筋含量，其面團(tuán)穩(wěn)定時間和面筋指數(shù)值并不高。推測在不同小麥品種中，相對于貯藏蛋白的含量而言，貯藏蛋白的類型對面粉質(zhì)量的影響更大。

2.2 巰基含量分析

由表2可知，在11個品種中，鄭麥103的總硫、自由巰基和總巰基含量最低；鄭麥119的硫含量最高，但自由巰基、總巰基和分子內(nèi)二硫鍵含量均處于最低水平，推測鄭麥119面粉中的半胱氨酸含量比例較低；新麥26的總巰基、分子內(nèi)二硫鍵的含量最高，但自由巰基含量卻不是最高，推測其蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)的半胱氨酸殘基相互結(jié)合成分子內(nèi)二硫鍵的比例較高。

2.3 巰基含量與面粉質(zhì)量的相關(guān)性分析

對面粉品質(zhì)和巰基含量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，硫含量與粗蛋白、濕面筋含量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，但與面團(tuán)強(qiáng)度參數(shù)(面筋指數(shù)、穩(wěn)定時間)之間無顯著相關(guān)性，因此，硫元素含量不適合作為衡量面粉品質(zhì)的參數(shù)。自由巰基含量與穩(wěn)定時間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，

表1 不同品種的面粉品質(zhì)特性Table 1 Processing quality of various wheat cultivars

表2 不同小麥品種面粉中的巰基含量Table 2 Sulfur and sulfhydryl group contents in various cultivars

與面筋指數(shù)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，所以自由巰基含量可以作為衡量面粉品質(zhì)的參數(shù)。二硫鍵含量與面團(tuán)強(qiáng)度重要參數(shù)穩(wěn)定時間之間沒有顯著相關(guān)性，建議作為補(bǔ)充參數(shù)使用。綜上所述，可以建立如下衡量小麥貯藏蛋白與面團(tuán)強(qiáng)度的關(guān)系模型：

分值=0.9x+0.3y

其中，x為某個蛋白質(zhì)的自由巰基數(shù)量，y為這個蛋白質(zhì)的分子內(nèi)二硫鍵數(shù)量；系數(shù)0.9取自自由巰基與面團(tuán)穩(wěn)定時間的相關(guān)系數(shù)近似值，0.3為分子內(nèi)二硫鍵與面團(tuán)穩(wěn)定時間的相關(guān)系數(shù)近 似值。

表3 小麥巰基集團(tuán)與面粉品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析Table 3 Correlations between flour processing quality parameters,sulfur content,and sulfhydryl group content in wheat

2.4 面粉不同蛋白類型的量化評價

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載89個不同類型的面粉蛋白和1個尚未提交數(shù)據(jù)庫的燕麥類似蛋白，利用在線軟件預(yù)測其分子內(nèi)二硫鍵以及自由巰基含量。根據(jù)軟件分析原理，分子內(nèi)二硫鍵和自由巰基分屬兩個獨(dú)立的預(yù)測。因此，當(dāng)一個蛋白預(yù)測無分子內(nèi)二硫鍵時，其半胱氨酸數(shù)量全部視為自由巰基數(shù)量；預(yù)測含有分子內(nèi)二硫鍵時，總半胱氨酸數(shù)量減去形成二硫鍵的半胱氨酸數(shù)量，剩余的半胱氨酸數(shù)量即為自由巰基數(shù)量。相關(guān)面粉蛋白的自由巰基、二硫鍵及評估分值見表4。

表4 基于在線巰基預(yù)測結(jié)果的面粉蛋白質(zhì)量評價Table 4 Predicted number of disulfide bonds in GSPs and evaluation scores calculated in this study

(續(xù)表4 Continued table 4)

(續(xù)表4 Continued table 4)

在被評估的24個高分子麥谷蛋白中，評分最高的是6.3分的1Dy10.1亞基，其次為Dx5和 1Dy3(4.5分)，11個亞基得到3.6的評分，另有7個亞基得分1.8分。從面團(tuán)強(qiáng)度貢獻(xiàn)方面分析，1Dy10.1、Dx5和1Dy3可以認(rèn)定為優(yōu)質(zhì)亞基，11個3.6分的屬中等類型亞基，7個得分僅1.8可以看做是劣質(zhì)亞基。

在36個低分子麥谷蛋白亞基中，Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)編碼的蛋白得分均達(dá)到7.2分，超過了得分最高的高分子麥谷蛋白1Dy10.1亞基，但Glu-A3的12個亞基里面，僅有3個亞基評分達(dá)到7.2分，其余評分均沒有超過3.6分。表明Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)的編碼蛋白對面團(tuán)強(qiáng)度貢獻(xiàn)較大。

在所評估的27個醇溶蛋白中，4個ω-醇溶蛋白由于缺乏半胱氨酸殘基，不能形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵，評分為0；6個γ-醇溶蛋白中，有3個評分達(dá)到7.2及以上；2個δ-醇溶蛋白中有一個評分也達(dá)到了7.2分；3個γ-黑麥類似的醇溶蛋白(gamma secalin)都在8分以上，表明這類型的醇溶蛋白對面團(tuán)強(qiáng)度有較大貢獻(xiàn)；12個被評估的α-或α/β-類醇溶蛋白中，有3個評分達(dá)到5.4分，超過了大多數(shù)高分子麥谷蛋白的分值。

除上述麥谷蛋白和醇溶蛋白外，重新評估了兩個燕麥類似(avenin-like)蛋白和兩個硬度相關(guān)蛋白(puroindoline)。在燕麥類似蛋白中，一個B型的蛋白得到了所有面粉蛋白的最高分(16.2分)，另一個A型的也獲得了與普通高分子麥谷蛋白相似的3.6分。

3 討 論

面團(tuán)穩(wěn)定時間和面筋指數(shù)是衡量面團(tuán)強(qiáng)度的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，自由巰基含量與面團(tuán)穩(wěn)定時間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，且自由巰基含量與面筋指數(shù)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(表3)；分子內(nèi)二硫鍵的含量與面團(tuán)穩(wěn)定時間存在正相關(guān)關(guān)系。很多研究已證實(shí)，自由巰基在面粉質(zhì)量中具有重要作用[15-19]。因此，依托這兩個系數(shù)構(gòu)建蛋白分析模型在理論上是可行的，但模型評估結(jié)果的正確性依賴于自由巰基預(yù)測的準(zhǔn)確性，以及該蛋白在總面粉蛋白含量中的比例。

在高分子麥谷蛋白類型中，相關(guān)研究已證實(shí)，Dx5、Dy10亞基屬于優(yōu)質(zhì)亞基，對面團(tuán)強(qiáng)度的貢獻(xiàn)較大[25]。而基于模型評價的分值也表明，1Dy10.1和Dx5亞基得分較高，可以認(rèn)定為優(yōu)質(zhì)亞基；另一個得分較高的亞基是1Dy3，分值和Dx5同為3.6分，可以認(rèn)定為優(yōu)質(zhì)亞基。高分子麥谷蛋白含量約占面粉蛋白總量的7%～15%，可以解釋45%～70%的面粉及終端應(yīng)用特性[6-7]，但從本模型的評分結(jié)果看，高分子麥谷蛋白難以達(dá)到45%～70%強(qiáng)度貢獻(xiàn)值。

低分子麥谷蛋白含量約占面粉總蛋白的33%、麥谷蛋白總量的60%[8]，并且在3個編碼位點(diǎn)中，Glu-B3、Glu-D3位點(diǎn)編碼蛋白得分均達(dá)到7.2分，Glu-A3位點(diǎn)也有少部分蛋白評分為7.2分。雖然傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，高分子麥谷蛋白對面團(tuán)強(qiáng)度的貢獻(xiàn)最大，但根據(jù)本研究的評估結(jié)果以及低分子麥谷蛋白占總蛋白含量的比例推測，低分子麥谷蛋白在面團(tuán)強(qiáng)度方面的貢獻(xiàn)可能更大。已有研究認(rèn)為，低分子量麥谷蛋白在面團(tuán)強(qiáng)度方面具有重要作用[9-11，26-27]。我們在品質(zhì)育種過程中也發(fā)現(xiàn)，高分子麥谷蛋白亞基組合完全相同的品種，其面團(tuán)強(qiáng)度指標(biāo)也會有很大差異，推測高分子麥谷蛋白并不是面團(tuán)強(qiáng)度的主要決定者。例如，本研究中的鄭麥369、鄭麥119和鄭麥158的親本之一都是鄭麥366，蛋白電泳顯示這四個品種的高分子麥谷蛋白亞基組合完全一樣，但面粉質(zhì)量有很大差異(表1)。

在線預(yù)測結(jié)果表明，醇溶蛋白并不像傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為的缺乏自由巰基，僅靠非共價鍵結(jié)合到面筋中，對面筋強(qiáng)度沒有貢獻(xiàn)；除ω-醇溶蛋白類型以外，在其他種類的醇溶蛋白中如γ類、α(α/β)類以及黑麥類似的醇溶蛋白，對于面團(tuán)強(qiáng)度也有貢獻(xiàn)，這也與傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為的、醇溶蛋白主要以非共價結(jié)合的方式填充到面筋骨架中不同。也有部分部分研究認(rèn)為，醇溶蛋白中含有半胱氨酸殘基，有可能以分子間二硫鍵的形式結(jié)合到面筋中[13-14，28-29]。

依據(jù)本模型評分結(jié)果，分值最高的蛋白為B型燕麥類似蛋白(16.2分)，證實(shí)了燕麥類似類蛋白與面粉品質(zhì)特性有密切關(guān)系[30]。我們利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合蛋白電泳研究發(fā)現(xiàn)，在鄭麥366、鄭麥369、鄭麥158和鄭麥119四個品種中，高分子麥谷蛋白亞基組合完全一致且基因表達(dá)水平無顯著差異，但燕麥類似蛋白及部分醇溶蛋白的基因表達(dá)有顯著差異，也暗示這兩類蛋白可能與面粉質(zhì)量有密切關(guān)系(結(jié)果待發(fā)表)。

因此，在今后的優(yōu)質(zhì)小麥育種中，除了要繼續(xù)重視高分子麥谷蛋白的作用外，還要進(jìn)一步加強(qiáng)對Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)編碼蛋白、燕麥類似蛋白及部分醇溶蛋白的研究，為優(yōu)質(zhì)小麥育種提供技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

建立的基于巰基含量的蛋白質(zhì)量評價模型，可用于小麥面粉蛋白品質(zhì)研究、優(yōu)質(zhì)小麥育種等工作。

低分子量麥谷蛋白、特別是Glu-B3和Glu-D3位點(diǎn)編碼蛋白，可能是面團(tuán)強(qiáng)度的主要來源。

燕麥類似蛋白可能對面團(tuán)強(qiáng)度具有較大 效應(yīng)。