岳冬雪，杜孟盈，皮亞寧，徐賡鑫，邱念偉，王仁君

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東曲阜273165）

0 引言

浮萍是一類最簡單的單子葉水生漂浮植物，屬于天南星科（Araceae）浮萍亞科（Lemnoideae），全世界共5 屬，約36 種。各類浮萍植株均較?。s0.5~15 mm），結構簡單，根莖葉退化，僅由葉狀體和根系組成（或僅有葉狀體），葉狀體組織細胞內充滿空氣，使浮萍完全適應水面漂浮生活，廣泛分布于各類淡水水體中[1-2]。浮萍富含淀粉、蛋白質、維生素和礦質元素，是重要的潛在食品源、飼料、生物能源[1]，其中紫萍（Spirodela polyrhzia）和青萍（Lemna minor）還可入藥，具有宣散風熱、透疹止癢、利水消腫等藥理作用[3]。此外，浮萍還具有快速吸附轉移氮磷元素、有機污染物、重金屬等有害物質的能力，是毒理檢測和生態(tài)修復中常用的水生植物類群，具有很重要的生態(tài)價值[4]。

我國浮萍共有蕪萍屬（Wolffia）、紫萍屬（Spirodela）、青萍屬（Lemna）三個屬，其中蕪萍繁殖較快，但個體及其微小，不易實驗操作；紫萍生長較慢，生長環(huán)境要求高；青萍最為常見，分布于我國南北各省，生于水田、池沼及其他靜水水域，常與紫萍混生[5]。由于青萍繁殖較快，通常在浮萍群落中占絕對優(yōu)勢，最適于室內培養(yǎng)，因此科學研究中常把青萍作為研究水生植物的模式生物[6]。本文系統介紹了青萍的室內培養(yǎng)方法和經驗，為青萍相關研究提供參考。

1 青萍的生物學特征

青萍植株結構簡單，由葉狀體和根組成。快速生長時期的青萍，通常每株附著3~4 個葉狀體；葉狀體對稱，呈近圓形、倒卵形或橢圓形，全緣，長1.5~5 mm，寬2~3 mm；上表面呈綠色，稍凸起或沿中線隆起，葉脈不明顯；背面淺黃色或淺綠色或紫色，每個葉狀體垂生1 條絲狀根，根白色，最長3~4 cm。青萍主要通過出芽生殖進行無性繁殖，葉狀體背面兩側各具有一個向外開口的夾層囊（或僅一端具有開口）。成熟的葉狀體會在兩側的囊中分生出新的葉狀體，新葉狀體以極短的細柄與母體相連，成熟后脫落形成一個新的植物體。在冬季死亡之前，其夾囊內產生橢圓形的冬芽，冬芽脫離母體后沉入水底越冬，第二年春天冬芽浮出水面，長出新株[5，7]。鳥類傳播是浮萍（含青萍）傳播到新地點的重要方式，浮萍能夠附著在水鳥的羽毛或爪上，靠鳥類傳播到不同的淡水水域中[4]。

2 青萍的室內人工培養(yǎng)條件

2.1 培養(yǎng)溫度

青萍對溫度的適應性較強，其生長繁殖溫度范圍為10~40℃；氣溫低于10℃青萍就會停止生長[8]；當溫度低于5~7℃，青萍逐漸白化死亡[9]。陳俠樺等人[8]在不同溫度下人工培養(yǎng)青萍，發(fā)現在30℃條件下青萍生長速率最快，相對生長率和葉狀體直徑達到最大值。青萍屬的稀脈浮萍（Lemna aequinoctialis）則在25 ℃條件下表現出最大的相對生長速率[10]。因此建議青萍的人工室內培養(yǎng)溫度控制在25~30℃。

2.2 光照強度

青萍可在6 μmol/m2/s 弱光下存活，其生長速度隨著光照強度的增加而加快，直到達到光合飽和點；超過飽和點，生長速率不再增大，甚至會對青萍產生光抑制損傷，降低其生長速率[11]。青萍室內生長的最適光照強度為5 000~10 000 Lux（約100~200 μmol/m2/s）。5 000 Lux 下青萍的生長速率約為2 000 Lux 光強下的2.5 倍，但5 000 Lux 和10 000 Lux 光強下青萍的生長速率差別不大[12]；光強繼續(xù)增加會降低青萍的葉綠素含量和光合效率[11，13]。我們實驗過程中還發(fā)現，強光照射到培養(yǎng)溶液中，還會導致培養(yǎng)溶液內產生大量綠藻，附著于青萍根部，影響其生長。用黑色容器培養(yǎng)青萍可減少外部光源入射培養(yǎng)溶液，并能吸收透射入溶液中的光線，降低培養(yǎng)液中的光照強度，減少綠藻生長，有利于青萍生長。因此建議使用深色不透光容器培養(yǎng)青萍，或在透明容器外纏繞黑色膠帶，盡量減少培養(yǎng)溶液中的光照強度[14-16]。室內培養(yǎng)光照達到5 000 Lux 青萍即可快速生長，且可以避免強光引起培養(yǎng)溶液的溫度升高和綠藻繁殖，一般熒光燈或LED 光源均能達到此光照要求。

光周期也影響青萍生長，青萍在短日照條件下生長速率低于長日照[17]。通過不同光周期生長實驗發(fā)現，青萍生長最適光周期為16 h：8 h，該光周期條件下有利于青萍葉狀體中淀粉的積累，葉綠素含量最高；若繼續(xù)延長光期反而會抑制葉綠素的合成，降低氣孔導度，影響光合作用[18]。

2.3 培養(yǎng)溶液

2.3.1 營養(yǎng)液的篩選。浮萍喜氮、磷豐富的富養(yǎng)化水體，培養(yǎng)浮萍最常用的培養(yǎng)溶液有Hoagland 營養(yǎng)液和Hunter 營養(yǎng)液。錢曉晴等[14]以稀脈浮萍、紫萍、少根紫萍為研究對象，證明3 種浮萍在Hoagland 營養(yǎng)液中的長勢均優(yōu)于Hunter 營養(yǎng)液。Hoagland 營養(yǎng)液中的氮磷比約為Hunter 營養(yǎng)液中氮磷比的6.5 倍[16]，說明浮萍更喜歡高氮磷比的富養(yǎng)化水體。程曉瑞[19]則證明在氮磷摩爾濃度比為5：1 的營養(yǎng)液中，浮萍長勢最好。我們用完全Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)的青萍長勢稍好于1/2濃度的Hoagland 營養(yǎng)液，因此建議用Hoagland 完全營養(yǎng)液培養(yǎng)青萍。

2.3.2 營養(yǎng)液的pH。青萍對水體pH 值適應范圍較廣，可以在pH 為5~9 的范圍內正常生長，pH 低于5.0對青萍的生長有明顯的抑制作用[20]。謝靖等[10]發(fā)現青萍在pH 為5.5 時相對生長速率最大；Mclay 等人[21]實驗結果顯示青萍最佳生長范圍為4~6，這一結果不太可靠。因為我們測試結果顯示青萍生長最適pH 為5.5~6.0，低于5.0 青萍生長速率顯著下降。因此建議把營養(yǎng)液pH 值調整至5.5~6.0。

2.3.3 培養(yǎng)方法。孫源等[22]用盛有Hoagland 營養(yǎng)液六孔板、培養(yǎng)皿、燒杯等深度不同的三種容器培養(yǎng)青萍，發(fā)現溶液越深，青萍的長勢越好，燒杯培養(yǎng)的青萍長勢最快。我們用水體深度為25 cm 的黑色水桶（容積20 L）擴繁青萍（浮萍初始水面覆蓋度約10%），無需更換培養(yǎng)液，青萍可在一周左右長滿水面；水深太淺，水體會大量蒸發(fā)，若未能及時更換營養(yǎng)液，會顯著影響青萍生長。實驗處理時，為了節(jié)約營養(yǎng)液，節(jié)省實驗空間，增大實驗重復數，我們用水體深度為6 cm，表面積為65 cm2的圓柱形黑色塑料容器培養(yǎng)青萍，每3 天更換1 次營養(yǎng)液，保證營養(yǎng)液成分穩(wěn)定。因此建議擴繁青萍時使用水體深度為20 cm 以上的深色不透光容器，實驗處理時建議用水體深度為5 cm 以上（超過青萍根的長度，不影響青萍飄移和根系生長），表面積為1 dm2左右的黑色容器進行培養(yǎng)。另外，青萍喜靜水，耐缺氧能力較強，無需進行通氣培養(yǎng)或者攪拌，通氣或攪拌反而會抑制青萍生長[23]。

3 室內培養(yǎng)青萍的生長規(guī)律

前人在初始實驗時，每個培養(yǎng)容器中選用10 株青萍作為起始株數進行培養(yǎng)（該文獻把每個明顯伸出母體的葉狀體記為1 株，全部選用兩葉相連的青萍），培養(yǎng)一定時間后，統計每個培養(yǎng)容器的總株數，用總株數表示青萍的生長速率，發(fā)現起始株數為10 時誤差最小[24]。理論上講，起始株數越多，實驗誤差越小，上述實驗未設置對照，實驗結果不可靠。我們統計了室內培養(yǎng)條件下單葉青萍、兩葉青萍和三葉青萍的比例，發(fā)現三葉青萍比例最高。我們取6 個相同的黑色培養(yǎng)盆，以10 個大小一致的三葉青萍（30 個葉狀體）為起始生物量進行室內培養(yǎng)，保證培養(yǎng)盆的光照等環(huán)境條件完全一致，連續(xù)培養(yǎng)10 天，統計每天每個培養(yǎng)盆內青萍的葉狀體總數，可以得到數據穩(wěn)定可靠的青萍生長曲線數據，結果顯示青萍的生長規(guī)律是極顯著的指數生長曲線（圖1）；其他浮萍也具有類似生長規(guī)律[18]。超過一定的天數，由于生長和營養(yǎng)的限制，青萍的生長會逐漸受到抑制，生長曲線變成“S”形[22]，青萍處理時間建議不要超過10 天。生長曲線也可以用每個培養(yǎng)容器內青萍總鮮重繪制，不過稱量總鮮重時會對浮萍造成損傷，數據也不如葉狀體數穩(wěn)定。可以先求出總鮮重與總葉狀體數的比例關系：每100 株三葉青萍的鮮重（300 個葉狀體）大約0.60 g，然后將葉狀體數生長曲線換算成鮮重生長曲線，二者的規(guī)律基本一致[16]。對青萍進行逆境處理后，會抑制青萍生長，單葉青萍和兩葉青萍的比例大大增加，這時用株數繪制生長曲線是不合理的，這種情況用鮮重生長曲線最為合適。實驗者應根據浮萍生長情況選擇合適的生長曲線。

圖1 青萍室內培養(yǎng)的生長曲線

科學實驗中往往只需統計處理后每個培養(yǎng)容器內青萍的最終總生物量（葉狀體總數或總鮮重），統計葉狀體總數比較費力，總鮮重更為可行。具體方法是：用小網撈出所有青萍，控去水滴，然后平鋪在兩層吸水紙上，上面蓋一層吸水紙，自然吸水5 分鐘后（不要擠壓），用精密天平稱量青萍總重量[25]。在適宜的室內培養(yǎng)條件下，青萍約2~3 天繁殖一代[6]，繁殖6 代之后母體逐漸衰老死亡[2]。所以建議青萍的處理周期控制在10天左右，不要超過15 天，避免有大量衰亡的母體出現。大量擴繁或生產時，也要定期采收青萍，避免生長密度過高加快青萍的老化死亡，污染青萍產品。要注意的是，如果青萍采收過多，會導致青萍水體覆蓋度過低，水中藻類過量滋生，青萍的生長環(huán)境也會惡化，影響青萍的總產量與質量[23]。了解青萍的生長規(guī)律對于科學研究及生產都至關重要。

青萍生長狀況還可用自然分開的株數、總干重、根長、葉狀體直徑表示。青萍新生葉狀體與母體相連的細柄極易斷裂，很難數清自然分開的青萍株數，該指標的穩(wěn)定性較差。青萍的發(fā)育階段不同，其葉狀體大小及根的長短變化較大，因此也不宜用全部植株的平均大小或平均根長表示。測量每個培養(yǎng)容器內青萍的總鮮重是最簡單可靠的生長指標。若需準確測量葉狀體直徑，可在顯微鏡下用顯微標尺測量成熟葉狀體的直徑表示葉狀體大小。葉狀體面積則可用精度較高的葉面積儀掃描一定數量的成熟葉狀體總面積，然后計算每個成熟葉狀體的平均面積。如果環(huán)境對根系生長影響較為明顯，可以只測量成熟葉狀體的平均根長來量化青萍的生長狀況。

4 室內培養(yǎng)青萍的注意事項

野外采集的青萍需要用自來水輕輕沖洗幾遍，選擇生長狀態(tài)良好、葉片肥碩、干凈完整的青萍用上述方法進行擴繁。用擴繁后的已經適應了室內環(huán)境的青萍進行科研實驗。

實驗處理或者更換營養(yǎng)液時，撈取葉狀體需注意保護細根和葉狀體，建議用彎頭鑷子從青萍葉狀體下方挑起單個青萍，逐一進行移取，以免對青萍造成傷害。

在野外采集或室內培養(yǎng)時，若獲得優(yōu)異單株，可用此單株進行擴繁，然后進行科學實驗，保證遺傳背景一致，并為青萍的生產提供優(yōu)良種質。

為了保證科學研究數據的可靠性，除處理因素外，要確保每個培養(yǎng)容器的其他環(huán)境條件盡可能一致。為防止因位置造成光照不均，樣本設計可采用拉丁方設計，并每天進行前后、左右平移，減小因行效應或列效應導致的實驗誤差。

每隔3 天左右更換一次營養(yǎng)液，保證培養(yǎng)溶液營養(yǎng)成分穩(wěn)定?？蓪⑶嗥紦迫敫鼡Q了營養(yǎng)液的新容器內，原來的容器清洗后備用，以洗去滋生的綠藻。

稱量總鮮重時，用濾水小網將青萍從溶液中撈起，輕輕掂掉水滴，然后再用衛(wèi)生紙吸水5 分鐘。吸水后盡快用精密天平（≤0.001 g）稱量總鮮重，避免水分蒸發(fā)會使鮮重不斷下降。統計葉狀體數時最好由同一人進行統計，保證統計標準一致。