李婉情，張 蕾

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

使用生物系統(tǒng)生產(chǎn)生物藥物這一理念于1982年提出［1］，幾十年來，大量生物藥物的出現(xiàn)改變了許多疾病的治療方法。在生物藥物中，70%以上的是糖蛋白，這顯示了生物表達(dá)系統(tǒng)對蛋白進(jìn)行糖基化修飾的重要性，常見的糖基化修飾類型有N-糖基化和O-糖基化。能夠進(jìn)行糖基化修飾的生物系統(tǒng)有酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。其中酵母表達(dá)系統(tǒng)中，常用的生產(chǎn)重組蛋白的菌株有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（Pi?chia pastoris），約有20%的生物藥物是由釀酒酵母生產(chǎn)的。

酵母作為一種真核單細(xì)胞微生物，其培養(yǎng)方式簡單、生長速度快，可在60 h 內(nèi)到達(dá)平臺期，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比，縮減了生產(chǎn)目的產(chǎn)品的時(shí)間和成本。1996、2009 年分別完成了釀酒酵母和畢赤酵母的基因組測序［2，3］。除作為第一個(gè)完成測序的真核生物之外，酵母也存在完整的單基因缺失文庫［4］，這進(jìn)一步推進(jìn)了對酵母基因功能的研究［5-7］，目前，已經(jīng)對約5 800 種蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有基礎(chǔ)的了解，約占總量的85%，這一比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他真核生物。在酵母中可使用多種基因編輯系統(tǒng)，如同源重組，釀酒酵母擁有極強(qiáng)的同源重組能力，40 bp 的同源序列即可完成重組，但該系統(tǒng)無法回收篩選標(biāo)記。Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)［8］和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在酵母中成功構(gòu)建并解決了這個(gè)問題，實(shí)現(xiàn)了篩選標(biāo)記的回收與利用。Dicarlo 等［9］首次在酵母中以90 bp 的雙鏈DNA 作為供體，使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行基因的破壞和插入，均可達(dá)到近100%的效率。為了進(jìn)一步提高基因編輯的效率，衍生出CRISPR/Cas9 多基因編輯系統(tǒng)，Shi 等［10］使用CRISPR/Cas9 開發(fā)了1個(gè)Di-CRISPR平臺，該平臺實(shí)現(xiàn)了總長為24 kb的（R，R）-2，3-丁二醇途徑的DNA 大片段的整合。這些高效的基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建也進(jìn)一步推動(dòng)了酵母工程菌株的研究進(jìn)程。

酵母能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾，如二硫鍵形成、亞基組裝、乙?；吞腔龋?1］，但對外源蛋白獨(dú)特的N-高甘露糖基化修飾方式可能會引起免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致血液中治療性蛋白質(zhì)被快速清除［12，13］等影響，限制了酵母系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。為了進(jìn)一步發(fā)揮酵母的應(yīng)用價(jià)值，需要在酵母中引入人源糖蛋白修飾途徑，改變糖蛋白的修飾類型。本研究介紹了酵母在蛋白生產(chǎn)方面的應(yīng)用、N-糖基化修飾過程以及人源化改造的研究進(jìn)展。

1 酵母在蛋白生產(chǎn)方面的應(yīng)用

許多細(xì)菌和真核細(xì)胞被用作生產(chǎn)藥物蛋白的平臺，其中原核生物大腸桿菌是最常用的系統(tǒng)之一，1982 年使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的第一個(gè)重組胰島素的批準(zhǔn)［1］開啟生物藥物研究的大門，目前使用該系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白占總產(chǎn)量的30%以上［14］。但由于原核系統(tǒng)無翻譯后修飾進(jìn)程，不能正確形成二硫鍵的局限性，使其只能生產(chǎn)無需修飾的小型重組蛋白。而真核表達(dá)系統(tǒng)可以突破這種限制，常用的真核系統(tǒng)包括倉鼠卵巢細(xì)胞［15］、昆蟲細(xì)胞［16］和酵母［17］等。與其他的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母系統(tǒng)不僅培養(yǎng)成本低，而且酵母細(xì)胞壁的存在也增加了細(xì)胞的耐受性，使其不容易受到溫度、pH 以及環(huán)境中其他物質(zhì)的影響。除此之外，酵母中各種成熟高效基因編輯系統(tǒng)的使用，簡化了基因編輯的過程，縮減了工程化酵母構(gòu)建的時(shí)間，例如Horwitz 等［18］運(yùn)用酵母天然的間隙修復(fù)能力［19］，將具有同源序列的gRNA 片段在菌體內(nèi)修復(fù)成完整質(zhì)粒，進(jìn)行正常CRISPR/Cas9 基因編輯進(jìn)程，敲除3 個(gè)基因，效率可達(dá)到64%，且省去了體外構(gòu)建gRNA 質(zhì)粒的時(shí)間。這一系列優(yōu)勢使酵母成為熱門的細(xì)胞工廠。

1987 年釀酒酵母生產(chǎn)的重組胰島素被正式批準(zhǔn)［1］，此后以酵母為表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的一系列藥物蛋白陸續(xù)投入使用。如表1 所示，使用酵母系統(tǒng)產(chǎn)生的藥物蛋白主要包括激素（如胰島素類似物和生長激素）、疫苗（如人乳頭瘤病毒疫苗和乙肝疫苗）以及血液相關(guān)因子物質(zhì)等［20］。然而，由于釀酒酵母本身特有的對蛋白的N-高甘露糖基化修飾［21］可能會減弱糖蛋白的活性、改變免疫原性并減少其半衰期。與釀酒酵母相比，畢赤酵母糖基化修飾程度和糖基化位點(diǎn)占有率有所減少，通常釀酒酵母中產(chǎn)生約50個(gè)甘露糖殘基，而畢赤酵母中產(chǎn)生約30 個(gè)甘露糖殘基。并且畢赤酵母可以進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)的特性能夠進(jìn)一步提高產(chǎn)品產(chǎn)量。為了減少酵母的甘露糖基化修飾程度，敲除酵母中α-1，6 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因OCH1，負(fù)責(zé)添加α-1，6 甘露糖主鏈的的第一個(gè)α-1，6-Man，起始甘露糖主鏈的形成［22］（圖1）。在釀酒酵母中OCH1和MNN9基因的敲除使其細(xì)胞壁的完整性遭到破壞，進(jìn)而造成缺失株嚴(yán)重的生長缺陷［23］。但將畢赤酵母中OCH1基因敲除之后，缺失株的生長狀況沒受到顯著影響［24］，并且在該菌株中引入哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶基因，成功產(chǎn)生復(fù)雜的唾液酸化糖蛋白［25，26］，這使其在生產(chǎn)生物藥物方面擁有更加廣闊的前景。

表1 使用釀酒酵母和畢赤酵母生產(chǎn)的蛋白產(chǎn)品

2 酵母的N-糖基化過程

在酵母中，蛋白的糖基化修飾分為2 種類型：N-糖基化和O-糖基化，其中N-糖基化修飾對蛋白活性的維持，促進(jìn)蛋白分泌以及維持蛋白熱穩(wěn)定性具有重要作用［26，27］。如圖1 所示，釀酒酵母的N-糖基化修飾進(jìn)程可以分為2 部分，前半部分進(jìn)程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，以磷酸多萜醇（Dol-P）為載體，在糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖苷酶和寡糖基轉(zhuǎn)移酶等的作用下，最終形成結(jié)構(gòu)為Man8GlcNAc2寡糖鏈，并連接在蛋白質(zhì)的天冬氨酸殘基上，這一進(jìn)程在真核生物中較為保守［21］。之后該寡糖肽進(jìn)入高爾基體中，在糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等的作用下形成高甘露糖基化的糖鏈。這一進(jìn)程與哺乳動(dòng)物相比，產(chǎn)生了明顯的差異。在哺乳動(dòng)物中，該寡糖肽經(jīng)過甘露糖苷酶修飾，形成糖鏈結(jié)構(gòu)為Man5GlcNAc2寡糖肽，之后在巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶等酶作用下，形成雜合性或者復(fù)雜型聚糖結(jié)構(gòu)［28，29］。

圖1 酵母與人源化畢赤酵母的N-糖基化途徑

2.1 酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中寡糖結(jié)構(gòu)的組裝

在Alg7 的作用下，將GlcNAc-1-P 轉(zhuǎn)移Dol-P 載體 上 形 成Dol-PP-GlcNAc［30］；在Alg13/Alg14、Alg1的作用下依次添加β-1，4-GlcNAc、β-1，4-Man 形成Dol-PP-GlcNAc2Man5；在Alg2 2 次連續(xù)作用下添加α-1，3-Man、α-1，6-Man，之后在Alg11 的作用下添加α-1，3-Man 形成Dol-PP-GlcNAc2Man5，完成寡糖鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞質(zhì)一側(cè)的組裝。在翻轉(zhuǎn)酶的作用下將與磷酸多萜醇連接的寡糖翻轉(zhuǎn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)部［31］，按照Alg3、Alg9、Alg12、Alg9、Alg6、Alg8、Alg10的順序在寡糖上依次添加α-1，3-Man、α-1，2-Man、

α-1，6-Man、α-1，6-Man、α-1，3-Glc、α-1，3-Glc、α-1，2 -Glc，形成Dol-PP-Man9GlcNAc2Glc3。之后磷酸多萜醇上的寡糖鏈在寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的作用下（Oligosaccharyltransferase Complex，OST）與蛋白質(zhì)上特定的天冬氨酸殘基連接形成寡糖肽［32］。接下來，在葡糖苷酶（Gls2、Gls2/Gtb1）、甘露糖苷酶（Mns1）作用下依次去除3 個(gè)α-Glc 和1 個(gè)α-1，2-Man，形成糖鏈結(jié)構(gòu)為Man8GlcNAc2的寡糖肽，并轉(zhuǎn)移到高爾基體中［33］。

2.2 酵母高爾基體中寡糖結(jié)構(gòu)的組裝

寡糖肽進(jìn)入高爾基體之后，甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（Och1）將α-1，6-Man 添加到寡糖的α-1，3-Man 上，啟動(dòng)甘露糖外鏈的延伸進(jìn)程［21］。OCH1基因的敲除會導(dǎo)致酵母細(xì)胞壁的完整性被破壞，生長速度降低，代謝進(jìn)程異常等影響［34］。寡糖肽在蛋白復(fù)合物Man-Pol I 和Man-Pol II 的依次作用下，在釀酒酵母中將糖鏈延伸至50 個(gè)甘露糖左右，在畢赤酵母中延伸至約30 個(gè)甘露糖殘基形成甘露糖主鏈；由Mnn2添加主鏈上第一層α-1，2-Man 側(cè)鏈，Mnn5 添加第二層α-1，2-Man，Mnn4 負(fù)責(zé)Mnn-P 結(jié)構(gòu)的添加，最后Mnn1 可以在寡糖鏈的Mnn-P 上添加α-1，3-Man［35］。敲除MNN1未對酵母生長產(chǎn)生顯著影響，也未顯著降低蛋白的糖基化修飾程度［36］。

3 酵母糖基化修飾的人源化改造

酵母的糖基化修飾可以幫助蛋白折疊，但是酵母中這種獨(dú)特的N-糖基化對蛋白具有負(fù)面影響，比如抑制蛋白酶的活性或改變蛋白免疫原性等［37］，因此希望構(gòu)建能夠去除酵母糖特異性糖基化修飾并生成復(fù)合型糖基化的工程酵母菌株。近些年來，在酵母中進(jìn)行人源糖基化改造，基本遵循2 種主要策略，一種是消除酵母糖基轉(zhuǎn)移酶，另一種是干擾脂連接寡糖（Lipid-linked oligosaccharide，LLO）的組裝降低蛋白的糖基化修飾程度，之后引入哺乳動(dòng)物中的糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)人源化糖鏈的合成。

近些年對酵母進(jìn)行改造及產(chǎn)生的糖鏈類型見表2。在酵母中進(jìn)行人源化改造的第一步，需要通過敲除酵母中在N-高甘露糖鏈合成中的關(guān)鍵基因，來降低酵母中的糖基化修飾程度，如圖1 所示，酵母中OCH1基因編碼α-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，是甘露糖外鏈形成的關(guān)鍵基因。在釀酒酵母中敲除OCH1基因 后，可 以 檢 測 到 糖 鏈 結(jié) 構(gòu)Man9-10GlcNAc2［36］。Mnn4 和Mnn1 分別負(fù)責(zé)Mnn-P 和最后1 個(gè)α-1，3-Man 的添加。在三重缺失釀酒酵母菌株Δoch1 Δmnn1 Δmnn4中引入來自海棗曲霉的α-1，3-甘露糖苷酶后，酵母中檢測到更接近哺乳動(dòng)物的糖鏈結(jié)構(gòu)Man5GlcNAc2［38］。但是，由于酵母細(xì)胞壁中甘露糖殘基約占細(xì)胞壁的10%~20%，該工程酵母菌株中甘露糖外鏈的缺失，導(dǎo)致酵母細(xì)胞壁完整性缺失，造成嚴(yán)重的生長缺陷。研究發(fā)現(xiàn)，酵母中BEM4和BEM4下游基因RHO1過表達(dá)可以在一定程度上恢復(fù)Δoch1缺失株的生長缺陷［39］。其中Bem4 蛋白可能與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，Rho1 蛋白調(diào)節(jié)蛋白激酶C（Pkc1p）和細(xì)胞壁合成酶（β-1，3-葡聚糖合酶）。推測由于BEM4和RHO1的過表達(dá)增加了β-葡聚糖的合成，修復(fù)OCH1缺失造成的細(xì)胞壁合成缺陷。因此，通過表達(dá)酵母中細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因或與β-1，3-葡聚糖合成的相關(guān)基因，在一定程度上能夠彌補(bǔ)菌株由于OCH1缺失造成的甘露糖鏈合成缺陷的問題。在畢赤酵母中破壞OCH1表達(dá)后，檢測到酵母細(xì)胞中主要糖鏈類型為Man8-12GlcNAc2，并且該基因的敲除未對酵母生長產(chǎn)生顯著影響［40］。造成這一差異的主要原因有2 點(diǎn)，一是由于與釀酒酵母相比，畢赤酵母中N-糖基化修飾位點(diǎn)減少，糖基化程度減弱，細(xì)胞壁中甘露糖含量低［11］，所以糖蛋白中甘露糖含量的減少對畢赤酵母細(xì)胞壁完整性的影響較小，二是由于在Δoch1缺失菌株中檢測到截短的Och1 蛋白活性，或許該蛋白的存在維持了缺失菌株正常生命活動(dòng)［41］。之后，在該菌株中引入哺乳動(dòng)物糖基轉(zhuǎn)移酶基因，成功產(chǎn)生了復(fù)雜的唾液酸化糖蛋白［25］，這使畢赤酵母菌株在生產(chǎn)生物藥物方面擁有更大的潛力。

表2 有關(guān)酵母改造及產(chǎn)生的糖鏈類型

另外，也可以通過干擾LLO 的組裝來影響高甘露糖鏈的形成，LLO 的組裝在ER 中完成。如圖1 所示，ALG3基因編碼α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在Dol-PP-GlcNAc2Man5的支鏈上添加1個(gè)α-1，3-Man，在酵母中該基因的敲除可以阻止PP-GlcNAc2Man6的合成，進(jìn)而影響糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的識別。在Δoch1缺失菌株中敲除ALG3基因后，在雙缺菌株中檢測到Man5GlcNAc2糖鏈結(jié)構(gòu)［42］。另外在多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）中，同樣ALG11和ALG3敲除后檢測到糖鏈結(jié)構(gòu)主要為Man3GlcNAc2。這說明通過干擾LLO 組裝的方法實(shí)現(xiàn)去糖基化具有可行性。

4 展望

1982 年，生物藥物這一概念被正式提出［1］，之后大量生物藥物的出現(xiàn)改變了許多疾病的治療方法。在眾多原核和真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，由于對酵母的基因組有深入的了解，酵母中簡便高效的基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建［8］以及酵母可修飾蛋白質(zhì)等優(yōu)勢的存在，促使工程化酵母研究進(jìn)程加速前進(jìn)。為了消除酵母對蛋白獨(dú)特的N-高甘露糖修飾途徑，引入人源化的N-糖基化修飾途徑，已有學(xué)者展開了相關(guān)研究。目前，在畢赤酵母中已經(jīng)可以表達(dá)唾液酸化的糖蛋白［48］，這一成果使在酵母表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生人源化蛋白成為了現(xiàn)實(shí)。但是，在酵母中實(shí)現(xiàn)人源化類型的糖基化修飾仍然面臨著許多問題：①酵母中糖蛋白也參與細(xì)胞壁的合成和酵母生長代謝進(jìn)程，酵母中糖基轉(zhuǎn)移酶的敲除破壞酵母細(xì)胞壁的完整性，影響酵母本身的正常生長發(fā)育，即難以平衡酵母生長狀況和人源糖基化修飾之間的關(guān)系；②工程酵母中改變糖鏈結(jié)構(gòu)，造成后續(xù)糖基轉(zhuǎn)移酶、翻轉(zhuǎn)酶或糖苷酶等對底物識別能力降低，造成目的糖蛋白產(chǎn)生效率低下；③釀酒酵母作為最常用的一種酵母，仍然不能產(chǎn)生含有半乳糖或者唾液酸殘基的糖蛋白，限制了酵母表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展。對酵母糖基化修飾進(jìn)行人源化改造，使其產(chǎn)生更接近哺乳動(dòng)物糖基化修飾結(jié)構(gòu)，有望進(jìn)一步提高酵母表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)治療蛋白方面的價(jià)值，拓展酵母作為細(xì)胞工廠的應(yīng)用范圍。