朱錦福，黃瑞靈, ，董志強，毛曉寧，周華坤

1.青海師范大學(xué)，青海 西寧 810008；2.開封市祥符區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 開封 475199；3.中國科學(xué)院西北高原生物研究所/青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點實驗室，青海 西寧 810008

濕地作為一種特殊的生態(tài)系統(tǒng)，兼具水體和陸地兩者的特征，在維持生態(tài)平衡、保持生物多樣性、氣候調(diào)節(jié)和水源涵養(yǎng)等方面具有不可替代的作用（李甜甜等，2016）。土壤微生物作為濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分（Zhang et al.，2012），扮演著調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動的角色（Faulwetter et al.，2009；陳泓碩等，2020），是生物地球化學(xué)循環(huán)的“引擎”尤其在調(diào)節(jié)土壤肥力、植物生長和氣候變化等方面起著關(guān)鍵作用（邵穎等，2017；葛怡情等，2019）。

土壤微生物中對維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)揮著特殊作用（林春英等，2021）。濕地生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物多樣性，決定著土壤環(huán)境質(zhì)量和生態(tài)特征，能更靈敏和全面地反映濕地土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化（吳松芹等，2017；陳偉等，2019；楊陽等，2022），其區(qū)系組成及多樣性受土壤環(huán)境、植被類型、土壤水分等因素的影響。諸多研究表明，氮沉降影響土壤細菌的生長繁殖與活動能力，從而改變了土壤細菌多樣性，進而其群落組成和結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生改變（閆鐘清等，2017；韓其飛等，2021；徐潤宏等，2021；張世虎等，2022）。

氮素的添加會導(dǎo)致土壤有機質(zhì)增加，這將為土壤微生物提供生長和發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致土壤中微生物群落豐富度的改變，最終會使土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和物種豐富度發(fā)生變化，此結(jié)果已被研究所證實（張海芳等，2018）。大氣中的氮沉降也是影響土壤微生物群落多樣性的因素之一（Kuypers et al.，2018）。氮沉降會改變植物的生長環(huán)境和有機碳的輸入量和分解速率（劉永萬等，2020；李梓萌等，2021；楊陽等，2021）。氮沉降對土壤微生物的影響還存在一些不確定因素，對土壤微生物產(chǎn)生積極作用還是產(chǎn)生負效應(yīng)還存在爭論。Zeng et al.（2016）認為氮沉降對土壤細菌多樣性和群落組成也有明顯的控制作用。楊山等（2015）則認為隨著氮添加梯度的增加，土壤細菌豐度和多樣性指數(shù)沒有發(fā)生明顯改變。也有研究表明，氮添加量與土壤微生物豐富度和多樣性相關(guān)，微生物多樣性對氮添加存在閾值限制性（李成一等，2020）。

青海湖位于青藏高原東北部，在維持青藏高原以及中國西北部生態(tài)安全平衡等方面具有重要作用（Ma et al.，2016）。青藏高原獨特的地理環(huán)境，對于外界環(huán)境變化很敏感，諸多學(xué)者圍繞青海湖濕地生態(tài)環(huán)境演變、生物多樣性評價、生態(tài)功能等方面開展了大量研究（張明等，2017；張中華等，2018；王天慈等，2020），對青海湖濕地的生態(tài)價值方面有了更深入的了解（楊陽等，2021），但氮沉降對濕地土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生何種影響，我們的了解仍然有限。因此，通過研究青海湖高寒濕地土壤細菌群落對氮添加的響應(yīng)，探討氣候變化背景下青海高寒濕地的保育策略，繼而為高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)保護和修復(fù)提供數(shù)據(jù)支撐。通過分析土壤細菌群落對氮濃度梯度的響應(yīng)特征、土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，為青藏高原高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗樣地位于青海湖湖東 36°41′—36°42′N，100°45′—100°47′E，海拔 3200 m，屬典型的高原大陸性氣候，光照充足，雨量較少，降水主要集中于6—9月，年平均降水量370 mm、年蒸發(fā)量1454.4 mm（劉文玲等，2017）。土壤類型主要為水成性陰育性土壤，以沼澤土和草甸土為主（王記明等，2014），優(yōu)勢植物類型有華扁穗草（Blysmussinocompressus）、禾葉嵩草（Kobresiagraminifolia）、藏嵩草（Kobresiatibetica）、小嵩草（Kobresiahumilis）和苔草（Carexspp.）等（楊英等，2016）。

1.2 試驗設(shè)計

根據(jù)青藏高原大氣氮沉降動態(tài)變化特征的數(shù)據(jù)（張靜等，2019），年平均氮沉降量 8 kg·hm-2·a-1，在青海湖東岸設(shè)置12個2 m×1 m樣地，樣地間隔25 m，防止相互干擾。設(shè)置4個氮梯度處理，施氮水平分別為 0、2、5、10 g·m-2，分別用 N0、N2、N5、N10表示。樣方采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理設(shè)置 3次重復(fù)。氮肥形態(tài)為 NH4NO3，于 2019年5—9月，每月月初按照處理水平進行氮添加處理，將NH4NO3溶解于1000 mL水中，人工均勻噴施于濕地土壤表面，對照則噴施等量的水。2020年 10月初用直徑10 cm螺旋取土鉆按五點采樣法采集表層土壤（0—15 cm）和深層土壤（15—30 cm）土壤樣品，去除細根和石塊，放入無菌自封袋中，一部分保存在-80 ℃冰箱，用于提取土壤DNA和高通量測序，分析土壤微生物群落功能多樣性，另一部分土樣放在室內(nèi)自然風(fēng)干，磨碎后過100目篩，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.3 樣品測定

樣品DNA的提取、擴增和高通量測序等工作均由北京百邁客生物科技有限公司（https://international.biocloud.net/zh/dashboard）完成。采用MN NucleoSpin 96 Soi試劑盒進行DNA提取，具體提取方式參照說明書進行。對細菌16S rRNA 區(qū)域進行擴增，擴增引物為：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和 806R：5′GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3′；PCR 擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，接著95 ℃變性30 s，50 ℃變性30 s，72 ℃變性60 s，進行20+10 cycles；循環(huán)結(jié)束后進行72 ℃延伸5 min，4 ℃最終延伸∞。目標(biāo)區(qū)域PCR產(chǎn)物根據(jù)電泳定量（ImageJ 軟件）結(jié)果，按照質(zhì)量比1∶1進行混樣，混樣后，采用OMEGA DNA純化柱進行過柱純化，1.8%的瓊脂糖凝膠，120 V 40 min電泳后，切目的片段，并回收，采用Illumina HiSeq 2500測序儀完成序列分析。

土壤酸堿度用土壤酸堿度計測量；土壤含水量采用烘干法測定；土壤全碳、全氮采用意大利 NC Technologies公司Costech ESC 4024元素分析儀測定；土壤有機碳采用總有機碳分析儀（Elementa，Germany）測定；土壤氨態(tài)氮、硝態(tài)氮的測定采用全自動間斷化學(xué)分析儀（CleverChem）測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于高通量測序技術(shù)、生物信息分析技術(shù)和生物云計算技術(shù)（https://international.biocloud.net/zh/dashboard），對原始數(shù)據(jù)進行拼接（FLASH，version 1.2.11），將拼接得到的序列進行質(zhì)量過濾（Trimmomatic，version 0.33），并去除嵌合體（UCHIME，version 8.1），到高質(zhì)量的Tags序列。在相似性 97%的水平上對序列進行聚類（USEARCH，version 10.0），以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾OTU。對樣品進行97.0%的相似度水平下進行物種聚類分析，獲得 OTU數(shù)，進行Alpha、Beta多樣性分析和RDA分析，判斷氮添加對土壤不同深度細菌多樣性的影響。此外，用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對不同氮添加下土壤理化性質(zhì)和細菌門水平多樣性之間的相關(guān)性進行分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準偏差的形式列出。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮添加土壤基本理化性質(zhì)

由表1可知，土壤pH值在7.3—7.57之間，研究區(qū)濕地土壤環(huán)境呈弱堿性，N10添加后，雖pH值提高，但各處理間差異不顯著（P>0.05），氮沉降對土壤pH沒有顯著影響。不同處理間土壤水分存在差異，隨施氮量的增加土壤水分逐漸增加，且表層土壤水分顯著高于深層土壤水分（P<0.05）?？偺己侩S施氮量增加而增加，總體上表層土壤高于深層土壤，N5處理下表層和深層含量高于其他處理，但各處理間差異不顯著；在深層土壤中，N2處理下總碳含量最低為 9.73，與其他處理差異顯著（P<0.05）。在表層土壤中有機碳含量隨施氮量增加而增加，除N2外，其余處理均高于對照，在N10處理下含量最高，顯著高于其他處理（P<0.05）；深層土壤有機碳含量與N0對比均有所降低，各處理間差異不顯著，表層土壤有機碳較深層土壤對外源性擾動響應(yīng)更加敏感。氮素是植物生長的重要元素之一。不同土壤層全氮的含量均不相同。表層土壤全氮含量呈現(xiàn)遞減趨勢，深層土壤全氮含量呈先上升后下降趨勢，且N5、N10與N0、N2差異均顯著。土壤層氨態(tài)氮含量，N2處理顯著低于對照和其它處理，在表層土壤中氨態(tài)氮含量表現(xiàn)為減少，在深層土壤中表現(xiàn)為增多。土壤硝態(tài)氮含量均表現(xiàn)為表層高于深層，N2和N5處理均高于對照，深層土壤之間差異均不顯著。

表1 不同氮添加處理對土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effects of different nitrogen addition treatments on soil physical and chemical properties

2.2 土壤樣本測序結(jié)果

測序結(jié)果經(jīng)低質(zhì)量序列過濾后，表層土壤中，氮添加變化下平均有效序列分別為72926、75666、75691和76087；深層土壤中，平均有效序列分別為76835、76945、77097和76618（結(jié)果見表2）。根據(jù)97%的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，表層土壤樣品共獲得1714個OTU，深層土壤共獲得1704個OTU。利用測序獲得序列構(gòu)建稀釋性曲線（見圖 1），表層土壤和深層稀釋性曲線均趨于平緩，表層土壤細菌覆蓋率為99.61%，深層土壤細菌覆蓋率為99.71%，當(dāng)前測序樣本量足以反映土壤不同深度細菌群落的實際情況，測序結(jié)果合理。

圖1 土壤稀釋性曲線Figure 1 Dilution curve of soil

2.3 不同氮濃度處理下土壤細菌數(shù)量

細菌是土壤微生物中數(shù)量最多的一個類群。由表 2可見，表層土壤中細菌數(shù)量在 6.68×106—108.81×106cfu·g-1之間，變化趨勢呈“N”形，在 N2處理下達到最低值，在N5處理下達到最高值，且N5和N10處理下顯著高于N0和N2處理。深層土壤中細菌的數(shù)量在 3.13×106—104.65×106cfu·g-1之間，變化趨勢與表層土壤一致，均在N2處理下達到最低值，在N5處理下達到最高值，且N5和N10處理下細菌數(shù)量顯著增加，氮添加提高了高寒濕地土壤細菌數(shù)量。

2.4 不同氮濃度土壤細菌豐度及多樣性

不同氮添加處理對土壤細菌豐度和多樣性指數(shù)的影響存在差異（表2）。ACE和Chao1指數(shù)衡量細菌豐度即細菌數(shù)量的多少，Shannon與Simpson指數(shù)均用于衡量物種多樣性，指數(shù)越大，細菌多樣性越高。在表層土壤，隨著氮添加濃度的增加，土壤細菌ACE和Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為降低趨勢；而在深層土壤，土壤細菌ACE和Chao1指數(shù)與其表層的變化不一致，與N0相比，ACE和Chao1指數(shù)均有所上升，且在 N10處理中豐度指數(shù)最高，為1458.71、1496.97。不同氮添加濕地之間Simpson指數(shù)有所變化，與N0對比，表層土壤呈遞增趨勢，深層土壤均有所下降，但差異不大。Shannon指數(shù)在表層土壤中表現(xiàn)為逐漸增加，在 N10中最大，為8.81，深層土壤的Shannon指數(shù)較N0降低，氮添加增加了表層土壤細菌多樣性，降低了深層土壤細菌多樣性，氮添加對深層土壤細菌多樣性具有負影響。

表2 不同氮添加處理中土壤細菌豐度及多樣性指數(shù)Table 2 Soil bacterial abundance and diversity index under different nitrogen addition treatments

2.5 不同氮添加下土壤細菌群落組成分析

基于微生物多樣性分析平臺，檢測到濕地土壤細菌為26門71綱156目267科428屬452種，絕大多數(shù)為單屬單種。在青海湖高寒濕地土壤細菌門分類水平上，占表層土壤細菌群落主導(dǎo)的細菌門有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、己科河菌門（Rokubacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）等，占整個濕地細菌群落組成的96.7%以上，見圖2a。在表層土壤中，氮添加增加了放線菌門（Actinobacteria）的豐度，降低了己科河菌門（Rokubacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）菌門的豐度，變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）豐度變化幅度較小，在 42.56%—44.42%和 25.28%—25.26%間波動。

深層土壤細菌群落在門水平上占主導(dǎo)細菌門的有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、己科河菌門（Rokubacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae），占整個細菌群落組成的97.6%以上，見圖2b。在深層土壤中，氮添加增加了變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）的豐度，降低了己科河菌門（Rokubacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度。濕地主要優(yōu)勢菌門隨氮添加增加，其含量雖發(fā)生變化，但處于相似生境下，門水平分類下土壤細菌群落組成基本一致。另外，在表層土壤細菌中，放線菌門和厚壁菌門對氮添加響應(yīng)較大，N10顯著增加放線菌菌門豐度，而N5顯著增加厚壁菌門豐度。

圖2 門水平上土壤細菌群落組成Figure 2 Composition of soil bacterial community at phylum level

2.6 土壤理化性質(zhì)與細菌豐度及α多樣性指數(shù)相關(guān)分析

從表3可以看出，土壤理化因子與細菌多樣性指數(shù)的相關(guān)性。表層土壤中，全碳與ACE豐度指數(shù)呈顯著負相關(guān)（P<0.05）；硝態(tài)氮與Chao1指數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；氨態(tài)氮與Simpson多樣性指數(shù)呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），與Shannon多樣性指數(shù)呈顯著負相關(guān)（P<0.05）。在深層土壤中，土壤酸堿度與Simpson和Shannon多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；水分、有機碳和全氮與細菌ACE和Chao1豐度指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05），且水分貢獻最大，影響極顯著（P<0.01）；全碳與Simpson多樣性指數(shù)呈顯著負相關(guān)（P<0.01）；而硝態(tài)氮與 Shannon多樣性指數(shù)呈顯著負相關(guān)（P<0.05）。

表3 土壤細菌多樣性與土壤理化性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis between soil bacterial diversity and soil physical and chemical properties

2.7 土壤理化性質(zhì)對細菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析

基于門水平下土壤細菌群落分布與理化性質(zhì)的RDA分析（見圖3），從圖3a可以看出，有機碳、硝態(tài)氮、全氮、氨態(tài)氮射線較長，表明其對在表層土壤中細菌群落分布影響較大，反之則較小。同時還可以看出，N0土壤中硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、己科河菌門（Rokubacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）分布主要受硝態(tài)氮、全氮和水分的影響，且有正相關(guān)；N2土壤中擬桿菌門（Bacteroidetes）分布主要受pH影響，其它影響因子貢獻不大；N5土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）分布主要受pH和氨態(tài)氮影響，其中氨態(tài)氮貢獻最大且有正相關(guān)；N10土壤中放線菌門（Actinobacteria）分布主要受有機碳影響，且有正相關(guān)。圖3b可以看出，在深層土壤，N0細菌中綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和己科河菌門（Rokubacteria）基本不受土壤理化性質(zhì)的影響；N2土壤中細菌的達達菌門（Dadabacteria）和變形菌門（Proteobacteria）分布主要受全碳和硝態(tài)氮的影響，且呈正相關(guān)；N5土壤中變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）分布受全碳、水分、有機碳、全氮以及pH影響，其中全氮對幾個菌門分布影響最大；N10的變形菌門（Proteobacteria）分布受全碳因素影響，呈正相關(guān)，而綠彎菌門（Chloroflexi）則與全碳因素呈負相關(guān)。在深層土壤中，環(huán)境因子主要對達達菌門（Dadabacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）分布產(chǎn)生影響，且呈正相關(guān)；而綠彎菌門（Chloroflexi）則與全碳因素呈負相關(guān)，硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和己科河菌門（Rokubacteria）對土壤理化性質(zhì)的變化反應(yīng)遲鈍。

圖3 土壤細菌與理化因子的RDA分析Figure 3 RDA analysis of bacteria and physicochemical properties

3 討論

3.1 氮添加對土壤理化性質(zhì)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)不同氮添加處理下的青海湖濕地土壤基本理化性質(zhì)存在差異顯著。表層土壤和深層土壤pH雖有波動性變化，但各處理間差異并不顯著（P>0.05）；表層土壤水分隨著N添加而增加，在N10處達到最大值，深層土壤水分在N5處達到最大值，當(dāng)水分條件良好時，氮的添加會對土壤微生物量有著正向促進作用。高氮的輸入導(dǎo)致深層水分下降，這是因為高氮的添加導(dǎo)致土壤有效氮含量增加，有效氮被植物吸收后，促進了植物的根系生長和自身發(fā)育。表層土壤隨著氮濃度的不斷增加，有機碳的含量也在增加，在N10處達到最大；深層土壤有機碳的含量最大值在 N5。外加氮素滿足了土壤微生物對氮素的需求，從而促進了凋落物的分解。氮沉降增加使土壤中可溶性酚類物質(zhì)逐漸積累，從而增加了土壤有機碳的含量，但由于深層土壤微生物活性低，使表層土壤有機碳含量較深層土壤高。也有研究發(fā)現(xiàn)，氮的添加會通過降低礦化速率，抑制穩(wěn)定性碳的分解，減少土壤碳輸出來增加有機碳的積累（劉銀銀等，2013）。氮素是構(gòu)成一切生命體的重要營養(yǎng)元素，全氮在一定程度上能反映土壤氮素的供應(yīng)狀況。本研究中，表層土壤全氮含量呈遞減趨勢，深層土壤中的全氮含量較對照均有提高，且在N5達到顯著水平，二者所表現(xiàn)出來的響應(yīng)完全不同。這可能是氮沉降輸入到濕地中的氮大部分保留在表層土壤，當(dāng)濕地生態(tài)系統(tǒng)達到“飽和”時，進一步的氮輸入將導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)負氮，過剩的NH4+可能發(fā)生硝化作用，進而造成氮的淋溶損失，使得氮素含量下降。這與前人的研究不盡相同（葉彥輝等，2017），原因可能是本研究開展氮沉降時間較短。

3.2 氮添加對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

濕地土壤中的微生物在“能量平衡”特別是碳氮平衡中扮演重要角色，在元素循環(huán)、特別是N、C元素循環(huán)、能量流動等過程中有著重要作用（裴希超等，2009）。其生物量約占土壤總有機碳的1%—5%，盡管其庫容小，但周轉(zhuǎn)速度快，是土壤有機質(zhì)中最活躍的部分（聶秀青等，2021）。微生物中的固氮菌和根瘤菌都是可以把氮氣轉(zhuǎn)化為氮或者銨鹽，從而把氮素輸入到生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)中。氮添加可以迅速改變土壤基底營養(yǎng)狀況，引起土壤理化指標(biāo)發(fā)生變化，對土壤微生物產(chǎn)生影響（郭萍萍，2015），繼而改變微生物群落組成和多樣性（陳謙等，2010）。濕地是碳氮循環(huán)得重要發(fā)生場所，相關(guān)研究表明濕地土壤細菌群落組成在門分類水平上主要有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、己科河菌門（Rokubacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（Hollister et al.，2010；Xu et al.，2019）。其中，豐度超過10%的菌門有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria）、己科河菌門（Rokubacteria），為高寒濕地土壤細菌主要優(yōu)勢菌門，這與本文研究結(jié)果基本一致，說明雖然取樣地點不同，對于生活在相似生境的細菌群落組成比較接近。但是，氮添加改變了土壤細菌菌門豐度和多樣性。在表層土壤中，氮添加增加了變形菌門（Proteobacteria）物種分布，但對氮添加響應(yīng)不顯著，增幅不明顯；放線菌門（Actinobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）隨氮添加增加呈遞增趨勢，放線菌門（Actinobacteria）在N10增幅最高，為79.62%、綠彎菌門（Chloroflexi）在 N5增幅最高，為 30.61%；己科河菌門（Rokubacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）隨氮添加增加呈遞減趨勢，均在 N10降幅最為明顯，分別降低了 33.40%和 62.24%；酸桿菌門（Acidobacteria）隨氮添加增加呈先下降后上升趨勢，增幅較??；厚壁菌門（Firmicutes）常參與有機質(zhì)的分解和微生物固氮過程，其分布情況則與酸桿菌門（Acidobacteria）相反，隨氮添加增加呈先上升后下降趨勢，N5增幅最高，是N0的11.16倍，對氮添加響應(yīng)極顯著。在深層土壤中，氮添加對酸桿菌門（Acidobacteria）分布影響不大；己科河菌門（Rokubacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）隨氮添加增加呈下降趨勢，均在N2、N5降幅較大，己科河菌門（Rokubacteria）分布分別降低了 60.98%和62.21%、綠彎菌門（Chloroflexi）分布分別降低了35.69%和29.68；變形菌門（Proteobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）隨氮添加增加呈先上升后下降趨勢，均在N2增幅最高分布最廣，增幅分別為23.26%和12.24%；放線菌門（Actinobacteria）隨氮添加增加呈遞增趨勢，且在N5增幅最高，為24.56%；硝化螺旋菌門（Nitrospirae）則與放線菌門（Actinobacteria）相反，氮添加降低了硝化螺旋菌門分布情況。由此可以看出，氮添加提高了放線菌門（Actinobacteria）分布，卻降低了己科河菌門（Rokubacteria）分布，這一研究結(jié)果與Fierer et al.（2007）不一致，可能與高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性和敏感性相關(guān)。土壤細菌門水平Simpson和Shannon多樣性隨氮添加增加而升高，在N5、N10濃度處理下細菌多樣性均有所增加，Simpson最大值出現(xiàn)在N10表層土壤中、為0.9935，Shannon最大值出現(xiàn)在N5表層土壤中，為8.75，Simpson和Shannon指數(shù)越大，說明樣品的細菌多樣性越高。由此可以看出，氮添加影響濕地土壤細菌的多樣性，在門水平上表層土壤中細菌多樣性高于深層土壤。在本研究中，添加不同濃度的氮素，改變土壤微生物細菌群落的 OTU豐富度以及土壤細菌群落組成，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是因為氮素可以提高速效氮的累計，改變土壤理化性狀，引起土壤中微生物的生境發(fā)生改變，也改變了土壤地上和地下部分的微生境，從而導(dǎo)致土壤微生物多樣性增加。

3.3 氮添加背景下微生物量與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

氮添加引起土壤微生物數(shù)量的改變已是不爭的事實。隨著氮濃度的增加，土壤微生物數(shù)量也在增加，濕地土壤微生物數(shù)量受土壤營養(yǎng)限制較大，本試驗的施氮量可能還沒有達到土壤的氮限制水平，從而促進了土壤細菌的生長，并在較高水平的N5和N10處理下達到顯著水平。也有研究認為氮沉降給土壤微生物生物量帶來的是消極影響（王慶貴等，2021），本研究與此結(jié)果不相同，表明我們還需從沉降強度、生境類型等方面開展持續(xù)、深入的研究，才能使我們更好地了解氮沉降對生態(tài)系統(tǒng)中微生物的影響。氮添加對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，在門水平上，N的添加顯著降低了己科河菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度，顯著增加了厚壁菌門的相對豐度，而酸桿菌門相對豐度變化不明顯。酸桿菌門豐度變化不大，主要受土壤pH值影響，酸桿菌門適應(yīng)低pH條件，本研究結(jié)果中土壤呈弱堿性。據(jù)報道，厚壁菌門受土壤C、N的影響（Karimi et al.，2018），本研究中，N添加導(dǎo)致全N和全C含量升高，厚壁菌門的相對豐度顯著提高，說明N添加對厚壁菌門活性有顯著促進作用。硝化螺旋菌門的相對豐度非常低，N添加下其菌門降低，表明硝化活性下降，N添加對硝化螺旋菌門有抑制作用。土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的差異主要受土壤理化因子對土壤細菌多樣性有顯著影響。氮添加可以通過改變土壤理化因子直接影響土壤細菌豐度及多樣性，N添加對深層土壤的 ACE和Chao1指數(shù)的影響為正效應(yīng)，對Simpson和Shannon的影響為負效應(yīng)，說明N沉降增加了土壤細菌群落的相對豐度，而降低了土壤細菌多樣性。本研究中，有機碳和全氮對深層土壤細菌的相對豐度影響極顯著，氨態(tài)氮對表層土壤的多樣性影響極顯著。施加氮肥，提高土壤的含氮量，提高了地上植物的生產(chǎn)力，從而使植物凋落物含量增加，最終導(dǎo)致土壤有機碳的累計，有機碳含量高的土壤可以提高有效碳源，為土壤微生物提供生長發(fā)育所需要的能量來源，促使土壤中的微生物保持較高的活性。

4 結(jié)論

通過高通量測序技術(shù)研究青海湖高寒濕地土壤細菌群落豐度和結(jié)構(gòu)，揭示了環(huán)境因子與濕地土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)組成的內(nèi)在聯(lián)系。氮添加后，高寒濕地表層土壤全碳、有機碳含量明顯增加，而土壤pH的變化對N素添加響應(yīng)不明顯。氮添加影響土壤細菌豐度及多樣性，有機碳和全氮對深層土壤細菌的相對豐度影響極顯著，氨態(tài)氮對表層土壤的多樣性影響極顯著。本研究結(jié)果不僅使我們增加了對青海湖高寒濕地土壤微生物群落組成及其主要影響因素的了解，從而更好地進行濕地生態(tài)系統(tǒng)管理，也為研究全球氣候變化下微生物介導(dǎo)的元素循環(huán)提供了理論參考。