黃婷,張宇欣,唐偉,游雄*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,江蘇 南京 210095)

λ 噬菌體是一種感染大腸桿菌的病毒。λ噬菌體感染宿主大腸桿菌細胞后,進入2個不同的生命周期:裂解周期或溶原周期。裂解生長(lysis)的噬菌體,通過感染宿主復(fù)制自身的DNA,并合成外殼蛋白,產(chǎn)生大量的子代噬菌體,通過宿主細胞的裂解釋放出來。溶原生長(lysogeny)的噬菌體,將自身的DNA熔合到宿主細胞的染色體中,通過細菌分裂實現(xiàn)復(fù)制。λ 噬菌體的基因組只有50 kb,包含50個基因,其中大部分編碼裂解蛋白、外殼蛋白、重組蛋白和參與DNA復(fù)制。在這2個不同的生命周期中,調(diào)控基因cI有不同的表達模式。λ 噬菌體的基因組調(diào)控機制相對簡單,成為應(yīng)用數(shù)學(xué)模型方法分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)的典型案例之一[1-2]。

阻抑物CI蛋白的負反饋自調(diào)控在λ噬菌體發(fā)育周期中起著重要作用[3]。Ptashne等[4]和 Johnson等[5]確定了λ 噬菌體lysis-lysogeny通路中基因調(diào)控表達機制。λ噬菌體基因表達調(diào)控的DNA序列包括 2個主要基因cI和cro,3個啟動子PR、PL(分別表示右向和左向啟動子)和PRM(CI蛋白維持啟動子)。cI基因編碼 λ 阻抑物CI蛋白。在λ噬菌體內(nèi),CI蛋白與早期轉(zhuǎn)錄啟動子PR和PL以分離或結(jié)合的動態(tài)平衡控制噬菌體的溶原或裂解途徑[6]。大多數(shù)噬菌體基因的轉(zhuǎn)錄直接或間接受到PR和PL的調(diào)控。PRM是維持阻抑物CI蛋白的啟動子,并且只轉(zhuǎn)錄cI基因。當(dāng)PRM處于關(guān)閉狀態(tài)且PR和PL處于開放狀態(tài)時,細菌處于裂解生長周期;當(dāng)PRM處于開放狀態(tài)且PR和PL處于關(guān)閉狀態(tài)時,細菌處于溶原生長周期。這些啟動子的活性受6個操縱子的調(diào)控[7],其中左右控制區(qū)各分3個位點,兩側(cè)無論是作用位點序列還是結(jié)合模式都相似。右側(cè)啟動子PR有3個操縱子位點OR1、OR2和OR3,其中OR1與PR重疊,OR3與PRM重疊[8-9]。

Hasty等[10]建立了一個λ 噬菌體阻抑物基因表達的確定性微分方程模型,對微分方程的分支分析結(jié)果解釋了被感染細菌的溶原生長和裂解生長。然而,由于轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后蛋白修飾過程所涉及的少數(shù)分子的離散特點,基因表達過程本質(zhì)上具有隨機性。這種隨機性可能引起生物發(fā)生表型變化[11],也是導(dǎo)致細胞分化和機體發(fā)育的機制之一[12]。

本文研究 λ 噬菌體cI基因隨機表達調(diào)控的動力學(xué)。按照阻抑物CI蛋白的線性降解和非線性降解 2種情形,分別建立化學(xué)主方程[13]。通過蒙特卡洛模擬[14-15],觀察不同降解率常數(shù)下基因調(diào)控的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu),探究 λ 噬菌體侵染的大腸桿菌不同生長狀態(tài)及其切換的機制。

1 模型與方法

1.1 λ 阻抑物自調(diào)控模型

本文考慮λ 噬菌體的一種不含位點OR1的突變體[16]?；騝I編碼阻抑物CI蛋白,阻抑物CI蛋白二聚化,然后結(jié)合到位點OR2或OR3上。當(dāng)二聚體結(jié)合到OR2上時,基因表達增強,并且屏蔽位點OR3的作用;當(dāng)OR3上有二聚體結(jié)合時,基因表達受到抑制(停止)。圖1為λ 噬菌體阻抑物CI 蛋白反應(yīng)通路模型。該通路的化學(xué)反應(yīng)包括4類。

圖1 λ 噬菌體cI基因自調(diào)控表達Fig.1 Self-regulated expression of the cI gene in λ phage表示啟動子上未結(jié)合二聚體;表示位點OR2上有二聚體結(jié)合;表示二聚體結(jié)合到位點OR3上;表示位點OR2和OR3上都有二聚體結(jié)合。當(dāng)二聚體結(jié)合到OR2上時,基因表達增強;當(dāng)OR3上有二聚體結(jié)合時,基因表達停止。OR1、OR2、OR3分別為啟動子PR的3個不同的操縱子位點。 indicates that the dimer is bound to the site indicates the sites OR2 and OR3 both have dimer binding. When only a dimer binds to OR2,gene expression is enhanced;when a dimer binds to OR3,gene expression stops. OR1,OR2 and OR3 are three operon sites of promoter PR,respectively.

1)阻抑物CI蛋白的二聚化和二聚體的分解

(1)

式中:Λ為蛋白單體二聚化的反應(yīng)速率常數(shù);θ為無量綱平衡解離常數(shù)。

2)操縱子狀態(tài)的轉(zhuǎn)換

(2)

(3)

(4)

式中:K1、K2、K3為二聚體與2個操縱子OR2、OR3結(jié)合的正向反應(yīng)速率常數(shù);β1、β2、β3分別是這3個反應(yīng)的無量綱解離常數(shù)。

3)cI基因表達(CI蛋白的生成)

(5)

(6)

式中:蛋白生成速率α0、α1依賴于操縱子的化學(xué)狀態(tài)。需要注意的是,這2個簡單的反應(yīng)式代表了大量的有效反應(yīng),包括cI基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA 到多肽的翻譯以及這些多肽向蛋白的折疊。

4)阻抑物 CI蛋白的降解

蛋白豐度的相對穩(wěn)定對于被λ噬菌體侵染的大腸桿菌的正常運行至關(guān)重要。細胞通過平衡合成和降解的過程,讓蛋白豐度維持在適當(dāng)水平,使λ噬菌體處于相應(yīng)的生長周期,同時通過打破這種平衡來實現(xiàn)不同生長周期的過渡。蛋白的降解是一個重要的調(diào)節(jié)機制。蛋白的降解速率對基因調(diào)控系統(tǒng)的動力學(xué)行為具有重要影響。蛋白的降解速率還與細胞的營養(yǎng)狀況和激素水平有關(guān)。例如,在營養(yǎng)缺乏的條件下,細胞加速蛋白的降解,以便為必不可少的代謝過程提供重要的營養(yǎng)。

真核生物中,蛋白的降解有兩種體系:一是由溶酶體負責(zé)的蛋白降解,二是依賴ATP的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)。2008年P(guān)earce 等[17]在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)了原核類泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)。Pup在輔助因子的作用下標記多種功能蛋白,并介導(dǎo)被標記蛋白通過蛋白酶體降解。研究表明,蛋白的降解速率與蛋白豐度存在依賴關(guān)系[18-19]。在數(shù)學(xué)模型中反映這種依賴性的方式有2種動力學(xué):質(zhì)量作用定律(線性降解)和Michaelis-Menten(MM)動力學(xué)(非線性降解)。MM動力學(xué)可以刻畫蛋白經(jīng)由“Pup-蛋白酶體”通路降解過程的復(fù)雜性。為簡單起見,假設(shè)二聚體不降解,也就是,只有蛋白的單體形式是不穩(wěn)定的。蛋白單體的線性降解的反應(yīng)表示為:

(7)

式中:δ為降解速率常數(shù);φ為蛋白的降解產(chǎn)物。

基于MM動力學(xué)的蛋白單體非線性降解的反應(yīng)表示為:

(8)

式中:M為蛋白單體的數(shù)量;KI為蛋白單體半數(shù)最大有效豐度,稱為MM常數(shù)。

阻抑物CI蛋白線性降解假設(shè)下的速率方程及其分支分析見文獻[10]。CI蛋白非線性降解情形的無量綱化方程為:

(9)

圖2 λ阻抑物基因反應(yīng)通路確定性模型的分支圖Fig.2 Bifurcation analysis of a deterministic model of the repressor in λ phage a λ inhibitor gene A. 函數(shù)f(x)、g(x)和x的雙縱坐標圖像;B. 系統(tǒng)平衡態(tài)x*與降解速率δ的關(guān)系(KI=50)。實線表示平衡點是穩(wěn)定的,虛線表示平衡點不穩(wěn)定,圓點“o”對應(yīng)鞍結(jié)點分支;C. δ-KI平面分支圖。其他參數(shù)取自文獻[10,20]。A. Bicoordinate diagram of functions f(x),g(x)against x;B. The relationship between the equilibrium x* of the system and the degradation rate δ(KI=50). The solid line indicates that the equilibrium is stable,the dotted line represents that the equilibrium is unstable,and the dot “o”corresponds to the bifurcation of the saddle node;C. Bifurcation diagram in the δ-KI plane. The other parameters are taken from references[10,20].

1.2 化學(xué)主方程

Hasty等[10]通過在方程(9)中引入加性噪聲,得到Langevin方程。利用Langevin方程研究外噪聲如何控制細菌的動力學(xué)行為。本文考慮基因的隨機表達,探討分子噪聲誘導(dǎo)細菌選擇生長周期。

1.2.1 阻抑物蛋白線性降解在任意給定時刻t,cI基因自調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)由單體蛋白的數(shù)量M(t)和啟動子的化學(xué)狀態(tài)S(t)確定。如果操縱子OR2和OR3未被占用,則S(t)=0;如果OR2與二聚體結(jié)合,則S(t)=1;如果OR3與二聚體結(jié)合,則S(t)=2;如果OR2和OR3都與二聚體結(jié)合,則S(t)=3。因此,系統(tǒng)的各種狀態(tài)取值可以寫成有序數(shù)對(m,s),其中m是非負整數(shù),s取0、1、2、3。

(10)

(11)

(12)

(13)

式(10)—(13)中每一個方程右端第1項表示由于單體蛋白生成使得系統(tǒng)狀態(tài)變?yōu)?n,d,s)時的凈概率流;第2項表示由于蛋白質(zhì)單體降解使得系統(tǒng)狀態(tài)變?yōu)?n,d,s)時的凈概率流;第3項表示單體生成二聚體使得系統(tǒng)狀態(tài)變?yōu)?n,d,s)時的凈概率流;第4項表示由于二聚體分解為單體使得系統(tǒng)狀態(tài)變?yōu)?(n,d,s)時的凈概率流。含有Ki的項表示由于二聚體與啟動子結(jié)合或解離使得系統(tǒng)狀態(tài)變?yōu)?n,d,s)的凈概率流。式(12)—(13)的右端沒有蛋白生成的概率流。所有參數(shù)均表示隨機反應(yīng)速率常數(shù)。

主方程(10)—(13)也可以寫成下列緊湊方程:

(14)

式中:n=0,1,…;d=0,1,…,[n/2]([n/2]表示n/2的整數(shù)部分);s=1,2,3,且當(dāng)s=2,3 時,αs=0。

1.2.2 阻抑物蛋白非線性降解如果蛋白的降解服從MM動力學(xué),那么cI基因網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)主方程為:

(15)

式中:n=0,1,…;d=0,1,…,[n/2]([n/2]表示n/2的整數(shù)部分);s=1,2,3,且當(dāng)s=2,3時αs=0。

2 結(jié)果與分析

在感染了噬菌體的細菌中,CI蛋白的數(shù)量作為細菌狀態(tài)的指示器。CI蛋白高表達,系統(tǒng)處于溶原生長周期;由于某種原因CI蛋白的拷貝數(shù)變得很少,則系統(tǒng)轉(zhuǎn)向裂解周期[7,20]。酶的活性會受到溫度、pH值以及細胞質(zhì)中其他小分子的影響,公式(7)—(8)中的常數(shù)δ、KI會在一定的范圍內(nèi)變化。我們借助參數(shù)δ、KI,通過蒙特卡洛模擬觀察CI蛋白的不同降解方式和降解速率對 λ 噬菌體基因調(diào)控系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的影響,探索系統(tǒng)對2種生長周期的選擇傾向性。

Cao等[20]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)CI蛋白的降解速率為0.000 7 s-1時,CI蛋白拷貝數(shù)高。當(dāng)CI蛋白的降解速率從0.000 7 s-1增加到0.002 s-1時,即λ噬菌體被誘導(dǎo)到裂解態(tài)前,處于溶原態(tài)和裂解態(tài)的過渡階段,CI蛋白數(shù)量呈現(xiàn)雙峰穩(wěn)態(tài)分布。當(dāng)CI以較快的速率(δ=0.003 6 s-1)降解時,CI拷貝數(shù)接近0,對應(yīng)于λ噬菌體的裂解態(tài)。

2.1 線性降解下λ噬菌體的狀態(tài)實現(xiàn)

我們首先對線性降解方程(14)應(yīng)用蒙特卡洛模擬。參照Cao等[20]研究結(jié)果,除了δ和KI外,其他參數(shù)取值為θ=2.364 6,Λ=0.422 9 s-1,α0=0.006 9 s-1,α1=0.066 s-1,K1=0.021 s-1,K2=0.021 s-1,K3=0.021 s-1,β1=0.08,β2=0.08,β3=5。

依次采取低降解速率δ=0.000 7 s-1,中等降解速率δ=0.002 s-1和高降解速率δ=0.003 6 s-1,對方程(14)應(yīng)用蒙特卡洛模擬。從圖3可知:對低降解速率δ=0.000 7 s-1,CI蛋白表達處于較高水平,呈單峰穩(wěn)態(tài)分布,與溶原態(tài)基本一致(圖3-A、B);對中等降解速率δ=0.002 s-1,CI蛋白數(shù)量在20～50無規(guī)則波動,沒有呈現(xiàn)雙峰分布,與試驗中觀察到的雙穩(wěn)態(tài)切換不符合(圖3-C、D);而在高降解速率下δ=0.003 6 s-1,CI處于穩(wěn)定的低表達狀態(tài),與裂解態(tài)基本一致(圖3-E、F)。上述結(jié)果表明,線性降解模型(14)不能正確表現(xiàn)λ噬菌體的溶原態(tài)和裂解態(tài)之間的雙穩(wěn)態(tài)切換機制。

圖3 線性降解下CI蛋白的樣本路徑和穩(wěn)態(tài)分布Fig.3 Sample paths and steady-state distributions for CI protein with linear degradation

2.2 非線性降解下λ噬菌體的狀態(tài)實現(xiàn)

除了δ和KI之外,其他參數(shù)與線性降解情況相同。為了實現(xiàn)λ噬菌體的溶原態(tài)、雙穩(wěn)態(tài)和裂解態(tài),對降解率δ的3個不同取值(0.000 7、0.002和0.003 6 s-1)根據(jù)圖2-C穩(wěn)態(tài)區(qū)域劃分,分別取半數(shù)最大有效豐度KI=20、50和200。從圖4可知:當(dāng)δ=0.000 7 s-1時,λ噬菌體內(nèi)阻抑物CI蛋白持續(xù)保持較高豐度(>100),呈現(xiàn)單峰穩(wěn)態(tài)分布,此時cI基因表達水平較高,細胞處于穩(wěn)定的溶原周期(圖4-A、B);當(dāng)δ增加至 0.002 s-1時,CI蛋白的豐度在2個穩(wěn)態(tài)水平上交替跳轉(zhuǎn),呈現(xiàn)雙峰分布,細胞在溶原態(tài)和裂解態(tài)之間反復(fù)切換(圖4-C、D);當(dāng)δ增加至 0.003 6 s-1時,CI蛋白豐度急劇下降至極低水平,呈單峰穩(wěn)態(tài)分布,細胞進入穩(wěn)定的裂解生長周期(圖4-E、F)。上述結(jié)果表明,非線性降解模型(15)完整正確地表現(xiàn)了λ噬菌體的隨機穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)。

進一步的模擬顯示,當(dāng)?shù)鞍捉到馑俾世^續(xù)增加(如δ>0.1),線性降解模型和非線性降解模擬的結(jié)果沒有明顯差別,CI蛋白數(shù)量非常穩(wěn)定地處在極低水平,細胞長期處于穩(wěn)定的裂解周期。這表明如果CI蛋白的降解速率超過一定的閾值,降解方式不影響系統(tǒng)狀態(tài)。

圖4 非線性降解下CI蛋白的樣本路徑和穩(wěn)態(tài)分布Fig.4 Sample paths and steady-state distributions for CI protein with nonlinear degradation

3 結(jié)論

本文研究 λ 噬菌體侵染大腸桿菌中自阻抑物CI蛋白的降解方式對基因表達穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,建立cI基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)主方程,其中考慮了蛋白線性降解和非線性降解兩種情況。蒙特卡洛模擬結(jié)果表明,與線性降解模型相比,非線性降解模型更為準確地刻畫λ噬菌體內(nèi)分子噪聲的隨機動力學(xué)。

本文發(fā)現(xiàn)噬菌體命運決定的一種新機制:阻抑物蛋白CI的降解率及降解方式。λ 噬菌體為了決定溶原/裂解態(tài),必須選擇與降解率δ相匹配的半數(shù)最大有效豐度KI。降解率較高時,CI蛋白傾向于線性降解,細菌更容易進入裂解周期;降解率較低或很低時,CI蛋白傾向于非線性降解。降解率δ越小,半數(shù)最大有效豐度KI值也越小,降解的非線性越強,細菌更容易進入溶原周期。

本文數(shù)學(xué)模型與隨機模擬方法也可以應(yīng)用于真核細胞中通過其他轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)-DNA相互作用調(diào)節(jié)基因表達的系統(tǒng)。