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牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

2022-08-11 11:55:52馬曉菁劉麗婭谷文喜易新萍
關(guān)鍵詞:布病布魯氏菌基因組

馬曉菁,葉 鋒,2,劉麗婭,谷文喜,鐘 旗,易新萍

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱(chēng)“布病”)是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病,該病主要造成家畜生殖系統(tǒng)損害。人可通過(guò)密切接觸患病動(dòng)物及動(dòng)物制品從而感染布病[1]。近十年來(lái),我國(guó)布病流行形勢(shì)較為嚴(yán)峻,畜間和人間布病感染率維持在較高水平,同時(shí)人間布病感染趨勢(shì)也由主要的職業(yè)接觸感染向非職業(yè)的食源性感染轉(zhuǎn)變[2]。因此,牛場(chǎng)布病凈化,是預(yù)防和控制布病的重要部分。

布病是動(dòng)物源性疾病,通過(guò)控制家畜布病從而降低人間布病是一種低成本、高效益的防控措施[3]。疫苗免疫是我國(guó)家畜布病防控的重要策略,布病流行區(qū)主要采取以疫苗接種為主、檢疫-撲殺為輔的防控策略。在布魯氏菌疫苗的使用中,牛種布魯氏菌A19疫苗最為有效且使用較為廣泛,主要用于牛的免疫[4]。A19疫苗株外膜的脂多糖(LPS)含有O-側(cè)鏈,可以持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體,從而使機(jī)體產(chǎn)生一定保護(hù)力。但疫苗免疫產(chǎn)生抗體和野毒感染產(chǎn)生抗體都是特異性抗體,無(wú)法通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)區(qū)分。易新萍等[6-7]應(yīng)用同源重組的方法敲除布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)中VirB12基因,獲得牛布魯氏菌A19缺失VirB12基因的突變株,即具有分子診斷標(biāo)記的A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株。該標(biāo)記疫苗株免疫保護(hù)力與親本株A19無(wú)顯著差異,但毒力弱于親本株A19,已于2021年正式上市推廣[8]。本研究以布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)VirB8基因設(shè)計(jì)引物鑒別布魯氏菌屬,并以牛布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗缺失的VirB12基因序列作為診斷標(biāo)記,建立了區(qū)分牛布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株與自然感染株的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法,為今后快速、準(zhǔn)確鑒別診斷分子標(biāo)記疫苗免疫牛與野毒感染牛提供了快速、可靠的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 菌種 實(shí)驗(yàn)中涉及的基因組DNA包括:牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株、牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株、豬種布魯氏菌S2疫苗株、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌,均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applide Biosystems QuantStudio 5),普通PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD T100TM Thermal Cycler)。熒光定量PCR試劑TaqProbe 2×qPCR Mix(寶生物工程(大連)有限公司);普通PCR Mix(北京莊盟國(guó)際生物基因有限公司);克隆載體pMD18-T(TaKaRa 公司);膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒(TaKaRa 公司)。

1.3 熒光定量PCR引物及探針 以布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)VirB8基因序列及VirB12基因序列,分別設(shè)計(jì)探針及引物(表1),引物及探針均委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物及探針序列Tab.1 Sequence of primers and probes of duplex fluorescence PCR

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)布魯氏菌VirB12基因序列(GenBank ID:LT671513.1)以及VirB8基因序列(GenBank ID: CP030752.1),應(yīng)用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物,分別擴(kuò)增VirB8基因片段,上游引物VirB8-F:ATGTTTGGACGCAAACAATCTCC,VirB8-R:TGCACAA CTCCCATTTCTGGAT;以及VirB12基因片段上游引物VirB12-F:GTCAGCTTCTC GCCAACACAAG,下游引物VirB12-R:CGTCGGAACCGCTCTATAGGTC。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和條件:25 μL體系,其中PCR Mix 12.5 μL,上、下游引物(1010μmol/L)各1 μL,牛種布魯氏菌A19疫苗株基因組DNA模板1 μL,ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,篩選陽(yáng)性克隆后提取質(zhì)粒測(cè)定濃度。

1.5 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 優(yōu)化PCR反應(yīng)體系中各引物與探針濃度,確定最佳擴(kuò)增條件。熒光定量PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件:20 μL體系,其中TaqProbe 2×qPCR Mix 10 μL,引物VirB8-RF(10 μmol/L)及VirB8-RR(10 μmol/L)各0.6 μL,VirB12-RF(10 μmol/L)以及VirB12-RR(10 μmol/L)各0.2 μL,探針VirB8-P (10 μmol/L)和VirB12-P(10 μmol/L)各0.2 μL,待檢DNA樣品2 μL(50~200 ng),ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃ 3 s,64 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。

1.6 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè) 分別以牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株、牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株以及豬種布魯氏菌S2疫苗株、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌基因組DNA為模板,進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增,評(píng)價(jià)該方法特異性。

1.7 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性檢測(cè) 分光光度儀測(cè)定布魯氏菌VirB8基因和VirB12基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒質(zhì)量濃度,質(zhì)粒濃度分別為338.6 ng/μL及240 ng/μL,載體片段與VirB8基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度共為5 888 bp,載體片段與VirB12基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度共為3 423 bp。利用公式(1),分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)??截悢?shù)。10倍系列稀釋VirB12基因和VirB8基因重組質(zhì)粒,分別以1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101以及100copies/mL為模板,進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增,每個(gè)梯度設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

拷貝數(shù)(copies/L)=[6.02×1023×質(zhì)粒質(zhì)量濃度(ng/mL)×10-9]/[DNA長(zhǎng)度(bp)× 660](1)

2 結(jié) 果

2.1 敏感性擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 布魯氏菌VirB8基因和VirB12基因重組質(zhì)粒濃度分別為1.24×1011copies/μL和3.78×1010copies/μL,將重組質(zhì)粒稀釋至1010~100copies/μL進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增,結(jié)果可見(jiàn)VirB8基因重組質(zhì)粒靈敏度為102copies/μL(圖1),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.809 3,截距為44.284,相關(guān)系數(shù)為R2=0.996(圖2),VirB12基因重組質(zhì)粒靈敏度為103copies/μL(圖3),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-4.346 3,截距為50.025 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.997(圖4),結(jié)果表明已建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法誤差較小。

圖1 不同拷貝數(shù)VirB8標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增圖Realtime-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Real-time PCR results of VirB8 standard plasmid with different copies

圖2 VirB8基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同拷貝數(shù)Realtime-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Realtime PCR amplification standard curve of VirB8 standard plasmid with different copies

圖3 VirB12基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同拷貝數(shù)Realtime-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Real-time PCR results of VirB12 Standard plasmid with different copies

圖4 VirB12基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒不同拷貝數(shù)Realtime-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Real-time PCR amplification standard curve of VirB12 standard plasmid with different copies

2.2 特異性擴(kuò)增結(jié)果 以牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株、牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株、豬種布魯氏菌S2疫苗株、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌基因組DNA為模板,滅菌水為空白對(duì)照,進(jìn)行布魯氏菌Realtime-PCR擴(kuò)增,結(jié)果可見(jiàn),牛種布魯氏菌A19疫苗株、羊種布魯氏菌M5疫苗株以及豬種布魯氏菌S2疫苗株基因組DNA出現(xiàn)VirB8基因及VirB12基因兩條擴(kuò)增曲線,并獲得相應(yīng)Ct值(表2),牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株基因組DNA僅VirB8基因擴(kuò)增獲得擴(kuò)增曲線,Ct值為29.831,大腸桿菌、沙門(mén)氏菌基因組DNA與滅菌水均無(wú)擴(kuò)增曲線,為陰性(圖5),結(jié)果表明雙重實(shí)時(shí)熒光PCR具有良好的特異性。

表2 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增Ct值Tab.2 Ct values of dual real-time PCR

1-2:羊種布魯氏菌M5疫苗株基因組DNA;3-4:牛種布魯氏菌A19疫苗株基因組DNA;5-6:豬種布魯氏菌S2疫苗株基因組DNA;7:牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株基因組DNA8:大腸桿菌基因組DNA;9:沙門(mén)氏菌基因組DNA;10:滅菌水 圖5 雙重?zé)晒舛縋CR特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Specific amplification results of duplex realtime-PCR

3 討 論

我國(guó)是畜牧業(yè)大國(guó),近年來(lái)布魯氏菌病流行形勢(shì)仍較為嚴(yán)峻,不僅對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展造成影響,同時(shí)危害公共衛(wèi)生安全。疫苗免疫在家畜布病防控和根除過(guò)程中具有重要的意義,尤其在布病流行較為嚴(yán)重的地區(qū)[9]。2016年我國(guó)出臺(tái)《布魯氏菌病防治計(jì)劃(2016-2020年)》,其中明確在全國(guó)范圍內(nèi),家畜布病防治實(shí)行區(qū)域化管理,采取以免疫接種、監(jiān)測(cè)凈化、風(fēng)險(xiǎn)防范等為主的防治策略[10]。

目前布病防控仍以布魯氏菌弱毒活疫苗為主[11]。我國(guó)生產(chǎn)的布魯氏菌弱毒活疫苗主要有豬種布魯氏菌S2、羊種布魯氏菌M5/M5-90株、牛種布魯氏菌A19株以及牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株[8],其中牛種布魯氏菌A19疫苗株是19世紀(jì)50年代從蘇聯(lián)引進(jìn)的S19株。S19疫苗自19世紀(jì)30年代起便在全球范圍內(nèi)廣泛用于奶牛布病的預(yù)防,是世界公認(rèn)的奶牛布病防控的最有效疫苗[12-13]。A19疫苗株為光滑型布氏菌,免疫后能夠持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,但由于疫苗免疫產(chǎn)生抗體與布氏菌野毒感染產(chǎn)生抗體均為特異性抗體,因此用現(xiàn)有的血清學(xué)診斷方法無(wú)法將疫苗免疫抗體與自然感染抗體區(qū)分,影響疫苗免疫地區(qū)布病的檢疫及凈化。牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株是以我國(guó)A19疫苗為親本株,應(yīng)用同源重組技術(shù)敲除布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)中VirB12基因而構(gòu)建的突變株,該突變株具有與親本株相同的保護(hù)力,但毒力卻低于親本株,同時(shí)獲得了診斷標(biāo)記[6-7]。

布氏菌VirB8蛋白是IV型分泌系統(tǒng)中必備組成成分,也是早期分泌蛋白[14-15]。鐘旗[16]等建立了VirB8-PCR方法用于布氏菌屬檢測(cè),具有良好的特異性。實(shí)時(shí)熒光PCR是通過(guò)加入特異性熒光探針,通過(guò)收集熒光信號(hào)進(jìn)行核酸實(shí)時(shí)檢測(cè)的技術(shù),可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中DNA含量,且無(wú)需進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè),既縮短了檢測(cè)時(shí)間,又避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染[17]。Winchell JM等[18]建立了區(qū)分羊種、牛種以及豬種布魯氏菌Realtime-PCR,將熒光定量PCR方法應(yīng)用于布魯氏菌檢測(cè),并具有良好的特異性及敏感性。本研究依據(jù)布魯氏菌VirB8基因片段可用于布魯氏菌屬鑒別,及牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株無(wú)法擴(kuò)增獲得VirB12基因片段的特點(diǎn),以布魯氏菌VirB8基因以及VirB12基因序列設(shè)計(jì)引物及探針建立鑒別牛種布魯氏菌A19-△VirB12疫苗株雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法,該方法具有良好的特異性及敏感性,對(duì)VirB8基因和VirB12基因擴(kuò)增靈敏度分別為102copies/μL、103copies/μL,相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.996,R2=0.997,結(jié)果表明該方法誤差較小。該方法僅用于鑒別區(qū)分牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗株與布魯氏菌野毒株,無(wú)法鑒別牛種布魯氏菌A19疫苗株與布魯氏菌野毒株。

綜上所述,本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有良好的特異性、敏感性,在判定檢測(cè)樣品為布魯氏菌的同時(shí)鑒別區(qū)分布魯氏菌自然感染與A19-△VirB12疫苗株免疫,為今后布病的防控提供技術(shù)支撐。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:馬曉菁,葉鋒,劉麗婭,等. 牛種布魯氏菌A19-△VirB12標(biāo)記疫苗雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(7):638-642. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.075

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