陳旭鵬，陳由強(qiáng)，朱錦懋，陳建楠*

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350117;2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院， 福建 福州 350117)

青錢柳CyclocaryaPaliurus是胡桃科Juglandaceae青錢柳屬Cyclocarya植物，為我國(guó)特有的植物種，主要分布于福建、浙江、江蘇、湖北等省份[1]。青錢柳主要含有萜類、黃酮、生物堿、多糖、有機(jī)酸等有益成分[2]，其中萜類物質(zhì)占有較大比例，具有優(yōu)良的藥用價(jià)值，F(xiàn)ANG等[3]研究表明青錢柳萜類物質(zhì)能夠顯著增加3T3-L1細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，并增加葡萄糖的攝取；周琴等[4]研究表明青錢柳三萜能夠保護(hù)STZ損傷的INS-1細(xì)胞，并促進(jìn)INS-1細(xì)胞分泌胰島素；LIU等[5]研究表明青錢柳三萜類化合物能夠顯著降低糖尿病小鼠的血脂水平。

萜類化合物是青錢柳重要的次生代謝物，它的積累與季節(jié)變化有著緊密的聯(lián)系，青錢柳萜類物質(zhì)的含量隨著月份的變化而產(chǎn)生顯著差異[6-7]，因此選擇適宜的采收月份對(duì)青錢柳藥材質(zhì)量具有重要影響。研究青錢柳總?cè)坪吭路輨?dòng)態(tài)變化及積累趨勢(shì)對(duì)科學(xué)采收青錢柳葉片具有重要意義。柏明娥等[8]研究表明浙江青錢柳4月至9月總?cè)坪砍噬仙厔?shì)，9月總?cè)品e累量高，最佳的采收月份為9月；夏和元等[9]研究表明湖北青錢柳6月、7月總?cè)坪扛?，此時(shí)青錢柳葉片提取液能顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性。前人研究表明，在總?cè)坪扛叩脑路莶墒涨噱X柳葉片具有顯著的降血糖活性，為了明確高總?cè)坪康那噱X柳葉片中降血糖成分，采用代謝組學(xué)的方法研究萜類的組成，為青錢柳藥理活性的深度開發(fā)提供重要理論參考[10-11]。谷海燕等[12]采用UPLC-MS/MS分析三七的萜類代謝組，發(fā)現(xiàn)多種具有生物活性的人參皂苷；傅俊等[13]采用UPLC-QTOF/MS分析牛膝的萜類成分，共發(fā)現(xiàn)40種三萜皂苷，其中齊墩果酸型三萜皂苷有38種。

青錢柳保健產(chǎn)品的市場(chǎng)需求不斷增加，目前福建省安溪縣青錢柳人工種植區(qū)多集中于育種、栽培等[14-15]，然而青錢柳總?cè)坪縿?dòng)態(tài)變化及適宜采收月份的萜類代謝組未見報(bào)道，因此本研究以福建省安溪縣4月至11月青錢柳葉片為試驗(yàn)材料，定量分析總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)，研究總?cè)坪縿?dòng)態(tài)變化，探究適宜的采收月份，并通過UPLC-MS/MS進(jìn)一步定性定量分析適宜采收月份的青錢柳萜類組成成分。本研究為探究適宜采收青錢柳葉片的月份和青錢柳葉片萜類化合物進(jìn)一步開發(fā)藥用價(jià)值及食品保健功能提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青錢柳樣品于2021年采自福建泉州安溪縣桃舟鄉(xiāng)(E117.45′42′，N25.22′ 48′)，選取的采摘時(shí)期為4月至11月。在樣地中隨機(jī)選取植株高度相似、樹冠大小相似、長(zhǎng)勢(shì)相似、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的青錢柳，采收成熟的青錢柳葉片，液氮速凍后存放于超低溫冰箱，樣品1式3份用于測(cè)定總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)和萜類代謝組分析。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1主要儀器 JXFSTPRP研磨儀(購(gòu)自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)、INFINITE M PLEX全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(購(gòu)自TECAN公司)、KQ-500E數(shù)控超聲波清洗儀(購(gòu)自昆山市超聲儀有限公司)、超速離心機(jī)(購(gòu)自Thermo SCIENTIFIC公司)、超高效液相色譜(SHIMADZU Nexera X2)、串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 4500 QTRAP)。

1.2.2主要試劑 冰醋酸、高氯酸、無水乙醇均為分析純；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品純度>99%(購(gòu)自阿拉丁公司)，香草醛分析純>99%(購(gòu)自麥克林公司)。

1.3 定量分析4月至11月青錢柳總?cè)?/h3>

精密吸取0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL具塞試管中，置于氮吹儀內(nèi)揮干溶劑，加入0.1 mL的5%香草醛-冰醋酸和0.8 mL高氯酸，混合均勻后60℃水浴酸解20 min顯色，取出冰水浴3～5 min，加入5 mL冰醋酸，室溫靜置10 min，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)吸光值，以齊墩果酸質(zhì)量為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)得到回歸方程y=337.29x-15.31，R2=0.994 8。

取200 g青錢柳樣品，真空冷凍干燥3 d后用研磨儀磨碎，過0.425 mm篩。稱取0.5 g樣品于250 mL錐形瓶中，加入95%乙醇50 mL超聲提取1 h，8 000 r·min-1離心10 min，過濾，取上清。將上清稀釋3倍后，取0.2 mL作為待測(cè)液于試管中，測(cè)定步驟參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，總?cè)坪坑?jì)算公式：

式中x：樣品總?cè)频暮浚籱1：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)液中總?cè)频馁|(zhì)量 (μg)；v1：提取時(shí)加入無水乙醇的體積(mL)；f：稀釋倍數(shù)；m2：樣品質(zhì)量 (g)；v2：測(cè)定時(shí)移取的溶液體積 (mL)。

1.4 UPLC-MS /MS檢測(cè)青錢柳萜類物質(zhì)

通過總?cè)贫糠治霭l(fā)現(xiàn)10月青錢柳總?cè)品e累量高，因此選取10月青錢柳葉片研磨成細(xì)膩粉末，用甲醇提取萜類物質(zhì)，按料液比1∶100，渦旋混勻，超聲提取5次，合并提取液后12 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀取上清，過0.22 μm濾膜，保存于超低溫冰箱以供上機(jī)分析。

采用超高效液相色譜(UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)檢測(cè)含有萜類化合物的青錢柳葉片提取液。液相條件：采用Agilent SB-C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)的色譜柱，柱溫箱溫度維持在40℃，A流動(dòng)相為超純水(0.1%的甲酸)，B流動(dòng)相為乙腈(0.1%的甲酸)，梯度洗脫0.00～9.00 min B (5%～95%)，9～10 min B (95%)，10～11 min B (95%～5%)，11～14 min B (95%)，流速0.35 mL·min-1，柱溫40℃，進(jìn)樣量4 μL。MS/MS質(zhì)譜條件：離子源溫度550℃，離子源噴霧電壓5500V(+)/4500V(-)，離子源氣體Ⅰ為50 psi，氣體Ⅱ?yàn)?0 psi，簾氣(CUR)為25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高，三重四級(jí)桿掃描使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用spss 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan多重比較、皮爾森相關(guān)系數(shù)分析。采用Excel繪制月份動(dòng)態(tài)變化的柱形圖，基于本地的代謝數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣本萜類代謝物進(jìn)行定性分析。使用三重四級(jí)桿質(zhì)譜，通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)對(duì)樣本萜類代謝物進(jìn)行定量分析。采用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用MultiaQuant軟件打開質(zhì)譜文件，積分色譜峰面積并校正，得到萜類代謝物的相對(duì)含量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳總?cè)坪吭路輨?dòng)態(tài)變化及其與月份相關(guān)性分析

2.1.1青錢柳總?cè)坪康脑路輨?dòng)態(tài)變化規(guī)律 對(duì)4月至11月青錢柳總?cè)贫糠治觯Y(jié)果(圖1)表明總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化范圍在3.96%～8.36%，呈“雙峰型”的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，單因素方差分析結(jié)果表明青錢柳總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)在不同月份之間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。6月(8.36%)、7月(7.63%)、10月(8.05%)總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)高，5月(4.49%)、9月(4.71%)、11月(3.96%)總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)低，方差分析結(jié)果表明6、7、10月總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著高于5、9、11月(P<0.01)。7月(7.63%)、8月(6.47%)、9月(4.71%)總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)為下降趨勢(shì)，方差分析結(jié)果表明7、8月總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，8、9月總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

注：圖中不同小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，不同大寫字母表示差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)

2.1.2青錢柳總?cè)坪颗c月份的相關(guān)性分析 一元線性回歸分析結(jié)果表明，青錢柳總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)與月份間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2)。青錢柳總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)與月份間的皮爾森相關(guān)性系數(shù)為-0.203，存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。4月至11月青錢柳總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)整體為下降的積累趨勢(shì)。

圖2 青錢柳總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)與月份的相關(guān)性

2.2 10月青錢柳葉片的萜類物質(zhì)成分分析

在青錢柳保健茶生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)者通常在秋季采收青錢柳葉片，秋季的青錢柳葉片已成為生產(chǎn)青錢柳保健茶的主要原料。本研究結(jié)果表明，10月總?cè)品e累量高，因此決定分析10月青錢柳葉片的萜類代謝組。通過UPLC-MS/MS對(duì)10月青錢柳葉片萜類化合物進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果表明10月青錢柳葉片共檢測(cè)到69種萜類化合物，其中三萜類化合物含量最高為83.02%，其次分別為三萜皂苷類為11.02%、二萜類為2.01%、倍萜類為1.40%、萜類為1.37%、倍半萜為1.18%(圖3)。

圖3 萜類代謝物的類別及占比

萜類物質(zhì)中相對(duì)含量排名前10的物質(zhì)為馬達(dá)積雪草酸、坡模酸、常春藤皂苷元、2α-羥基熊果酸、11-酮基-熊果酸、α-香樹脂酮、科羅索酸、山楂酸、青錢柳苷Ⅱ、Pterocaryoside B，其中大多數(shù)為三萜類化合物，少部分為三萜皂苷(表1)。本研究共檢測(cè)到10種青錢柳苷類化合物，均屬于三萜類，分別為青錢柳苷Ⅱ、青錢柳苷K、青錢柳苷F、青錢柳苷J(rèn)、青錢柳苷A、青錢柳苷C、青錢柳苷H、青錢柳苷Ⅰ、青錢柳苷E、青錢柳苷Ⅲ，其中青錢柳苷I、青錢柳苷A均屬于達(dá)瑪烷型三萜皂苷是青錢柳甜味的主要來源。

表1 萜類代謝物成分及相對(duì)含量

續(xù)表1

3 結(jié)論與討論

通過定量分析4月至11月青錢柳葉片總?cè)疲Y(jié)果表明6月、10月總?cè)品e累量高，因此6月、10月為適宜的采收月份；青錢柳總?cè)祁愇镔|(zhì)呈“雙峰型”動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，產(chǎn)生的原因可能是青錢柳內(nèi)在的生長(zhǎng)節(jié)律、基因表達(dá)動(dòng)態(tài)等[17-18]，外在的土壤肥力、光照、溫度、水分等[19-21]。4月至5月青錢柳剛結(jié)束休眠，次生代謝活動(dòng)較弱[22-23]；6月營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，總?cè)品e累量逐漸增加，SUN等[24]認(rèn)為中國(guó)東南部低山丘陵的青錢柳人工種植區(qū)和天然群落可能會(huì)形成獨(dú)有的小氣候，在青錢柳生長(zhǎng)期提供充足的水熱條件從而有利于萜類物質(zhì)的合成；7月至9月是夏季，青錢柳進(jìn)入繁殖階段，開花結(jié)果過程中可能逐漸消耗大量底物和中間體，只有少部分被用于萜類合成[25]；10月地上部分生物量高，然而氣溫逐漸下降，低溫等脅迫因子可能使總?cè)圃谌~片的積累逐漸增加[26-27]；11月進(jìn)入冬季葉片變黃脫落，總?cè)品e累量最低。今后可以通過青錢柳代謝組及轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，并結(jié)合環(huán)境因素進(jìn)一步揭示萜類物質(zhì)的積累變化規(guī)律[28-30]。

在青錢柳保健茶的生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)者通常在秋季采收青錢柳葉片，此時(shí)青錢柳地上部分生物量高，活性物質(zhì)積累多[31-32]，秋季的青錢柳葉片已成為生產(chǎn)青錢柳保健茶的主要原料，且本研究結(jié)果表明10月青錢柳總?cè)品e累量高，因此決定選取總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)高的10月進(jìn)一步研究萜類代謝組。本研究結(jié)果表明，10月青錢柳葉片共檢測(cè)到69種萜類化合物，其中三萜類最多，少部分以倍半萜、單萜等形式存在。在萜類中相對(duì)含量排名前10的物質(zhì)為馬達(dá)積雪草酸、坡模酸、常春藤皂苷元、2α-羥基熊果酸、11-酮基-熊果酸、α-香樹脂酮、科羅索酸、山楂酸、青錢柳苷Ⅱ、Pterocaryoside B。積雪草酸及其衍生物屬于烏蘇烷型三萜皂苷，在青錢柳萜類代謝組中含量最高，郭冰潔[33]研究表明積雪草酸能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；柳軍等[34]研究表明積雪草酸能夠增加肝細(xì)胞對(duì)外周葡萄糖的攝取，并改善糖代謝，因此在未來進(jìn)一步開發(fā)青錢柳積雪草酸及其衍生物，對(duì)治療糖尿病及癌癥等具有重要意義。坡模酸屬于烏蘇烷型三萜皂苷，其含量?jī)H次于積雪草酸，LEE等[35]研究表明坡模酸能夠顯著增加肌肉細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，在未來可以作為無毒副作用的胰島素增敏劑。在青錢柳萜類化合物中科羅索酸、山楂酸含量相對(duì)較高，研究表明科羅索酸、山楂酸具有顯著的抗糖尿病、抗氧化、抗炎癥的作用[36]。青錢柳苷屬于三萜類，本研究共檢測(cè)到10種青錢柳苷類化合物，目前有7種被分離純化[37-39]，青錢柳苷類化合物在提取、分離、鑒定方面雖有一定的基礎(chǔ)，但其化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)與降血糖活性之間的關(guān)系尚未明確，因此今后對(duì)青錢柳苷類化合物降血糖活性進(jìn)行深入的研究，對(duì)青錢柳藥理活性的深度開發(fā)具有重要意義。青錢柳在民間常被作為甜茶飲用，青錢柳茶獨(dú)特的甜味深受人們的歡迎，現(xiàn)代研究表明青錢柳三萜類物質(zhì)是甜味的主要來源，舒任庚等[40]從青錢柳提取液中分離得到青錢柳苷I，并證實(shí)其具有強(qiáng)甜味；楊大堅(jiān)等[41]從青錢柳提取液中分離得到青錢柳苷A，并證實(shí)其甜度超蔗糖的200倍。本研究檢測(cè)到青錢柳苷I、青錢柳苷A均屬于達(dá)瑪烷型三萜皂苷，可以進(jìn)一步開發(fā)這類天然的甜味物質(zhì)。綜上所述，青錢柳葉片中的萜類化合物在藥物方面具有良好的降血糖、抗氧化等功效，在食品方面具有獨(dú)特的風(fēng)味，因此青錢柳葉片萜類成分的開發(fā)為功能性保健食品的市場(chǎng)及天然藥物的研發(fā)提供廣闊的前景。