朱延焱，馮炎林，梅紫薇，胡國(guó)新，平麗，田偉強(qiáng)

(1.浙江省麗水市中心醫(yī)院藥學(xué)部，麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，溫州 325035；3.浙江大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，杭州 310058)

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey的根。現(xiàn)代藥理研究表明，人參具有廣泛藥理活性，包括抗腫瘤、抗高血壓、抗疲勞、增強(qiáng)免疫等作用[1]。含人參的中藥制劑臨床廣泛用于惡性腫瘤的輔助治療。有研究指出，含人參制劑可以減少化學(xué)治療(化療)所致不良反應(yīng)[2]，亦有觀點(diǎn)認(rèn)為人參可以提高化療療效。伊立替康(irinotecan，CPT-11)是半合成喜樹堿衍生物，屬選擇性DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑。2020年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)結(jié)腸癌[3]、直腸癌[4]指南推薦：CPT-11與氟尿嘧啶、亞葉酸鈣聯(lián)合(FOLFIRI方案)是復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的一線化療方案，療效確切。筆者在本實(shí)驗(yàn)觀察人參總皂苷與CPT-11合用后，CPT-11及其活性代謝產(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38)在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的變化，以期為臨床中西藥聯(lián)用提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器 超高液相色譜-XEVO TQD 三級(jí)四重桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters)，含有電噴霧離子源(electro-spray ionization，ESI)，色譜工作站：Masslynx 4.1；Beckman 22R臺(tái)式TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；XW-80A渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；XS105分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.01 mg)；Milli-Q A10 超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2試藥 注射用鹽酸伊立替康(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：每支40 mg，批號(hào)：180712AF)；SN-38(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，純度>98%，批號(hào)：A0816AS)；人參總皂苷(西安維奧生物科技有限公司，批號(hào)：171110，總皂苷含量≥80%)；卡馬西平片(江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1606161，規(guī)格：每片0.1 g)；甲酸(色譜級(jí)，Aladdin chemistry Co.，Ltd，批號(hào)：E2022005)；乙腈(色譜級(jí)，Tedia Company，批號(hào)：19085037)和甲醇(色譜級(jí)，Tedia Company，批號(hào)：19055136)；其余常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純(上?；瘜W(xué)試劑公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠12只，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，均購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(浙)2015-0009。所有SD大鼠飼養(yǎng)在溫度相對(duì)恒定和自然通風(fēng)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下[溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度(55±10)%，12 h光照和12 h黑暗交替，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水]，適應(yīng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相：A 0.1%甲酸-B乙腈 (77：23)，流速：0.4 mL·min-1，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量2 μL?？傔\(yùn)行時(shí)間為2.5 min。Masslynx 4.1版軟件(Waters Corp.)用于數(shù)據(jù)采集和儀器控制。

2.2質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式，正離子MRM方式檢測(cè)，駐留時(shí)間200 ms。掃描范圍m/z：100→1000。MRM模式下CPT-11、SN-38、卡馬西平離子躍遷分別為m/z587.3→167.2、m/z393.2→349.2、m/z237.1→194.2。ESI，電離電壓；3.5 kV，錐孔電壓：30 V，離子源溫度150 ℃；霧化溫度 498 ℃；霧化氣流速 800 L·h-1，錐孔氣流速50 L·h-1，碰撞氣流速0.15 mL·min-1。

2.3血漿樣品的處理 血漿樣品采用乙腈沉淀蛋白方法，取大鼠血漿100 μL，加入乙腈200 μL，100 ng·mL-1卡馬西平100 μL，渦旋2 min，13 000 r·min-1離心10 min (r=17 cm)，取上清液100 μL，加入超純水100 μL，混合后進(jìn)樣2 μL，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法分析，測(cè)定大鼠血漿CPT-11及SN-38含量。

2.4給藥方案與樣品采集 SD大鼠12只，體質(zhì)量220～250 g，雌雄各半，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組6只，禁食12 h后于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天上午給藥，實(shí)驗(yàn)組灌胃人參總皂苷400 mg·kg-1，0.5 h后尾靜脈注射CPT-11 20 mg·kg-1；對(duì)照組灌胃同體積0.9%氯化鈉溶液，0.5 h后尾靜脈注射CPT-11 20 mg·kg-1，分別于給藥后 0.083，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24 h經(jīng)尾靜脈取血約 0.2 mL，置含肝素的抗凝試管，13 000 r·min-1離心10 min(r=17 cm)，上清液即血漿，-20 ℃ 保存待處理。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1方法專屬性考察 取 SD大鼠空白血漿100 μL，置 1.5 mL EP管，其余按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法操作，在本實(shí)驗(yàn)UPLC-MS/MS條件下進(jìn)樣2 μL分析，獲得空白血漿色譜圖；將一定濃度CPT-11標(biāo)準(zhǔn)系列溶液加入空白血漿，同法操作，獲得相應(yīng)色譜圖，取靜脈注射CPT-11后 SD大鼠 30 min時(shí)間段血漿樣品，同法操作，得色譜圖。血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾樣品測(cè)定。同法測(cè)定大鼠血漿SN-38方法專屬性。CPT-11保留時(shí)間0.43 min，SN-38保留時(shí)間0.75 min，內(nèi)標(biāo)卡馬西平保留時(shí)間1.57 min，三者分離良好并在相應(yīng)離子通道中相不干擾，見(jiàn)圖1。

A.空白血漿；B.CPT-11；C.SN-38；D.卡馬西平；E.CPT-11+SN-38+卡馬西平。

2.5.2線性范圍與定量限考察 精密量取4 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)卡馬西平溶液70 μL，加入CPT-11系列濃度溶液20 μL，置1.5 mLEP管，離心濃縮系統(tǒng)揮干，加入大鼠空白血漿100 μL，配制成CPT-11血漿濃度分別為0.005，0.05，0.5，1，2，5，20 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)模擬血漿工作曲線，按“2.3”項(xiàng)方法處理。所得結(jié)果以CPT-11血漿濃度為橫坐標(biāo)，所得CPT-11及內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，以最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程：Y=9998X(r=0.999)在0.005～20 μg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，考察定量下限為0.001 μg·L-1。同法測(cè)得大鼠血漿SN-38回歸方程為：Y=9918X(r=0.999)在0.005～20 μg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，考察定量下限為0.001 μg·L-1。

2.5.3精密度實(shí)驗(yàn) 配制低、中、高濃度CPT-11血漿質(zhì)控樣本，按“2.3”項(xiàng)進(jìn)行處理，進(jìn)樣2 μL，UPLC-MS/MS法分析。每濃度樣品5個(gè)，連續(xù)測(cè)定 3 d，考察日內(nèi)及日間精密度。CPT-11日內(nèi)精密度與日間精密度RSD分別為5.71%～7.30%、5.71%～9.33%。同法測(cè)得大鼠血漿SN-38日內(nèi)及日間精密度，RSD分別為5.73%～7.68%、3.20%～9.35%。

2.5.4回收率實(shí)驗(yàn) 配制低、中、高濃度CPT-11血漿質(zhì)控樣本各6份，按“2.3”項(xiàng)操作，進(jìn)樣2 μL測(cè)定，記錄CPT-11峰面積(As)；另取空白血漿，按“2.3”項(xiàng)操作，得空白基質(zhì)，再加入用流動(dòng)相配制的CPT-11對(duì)照品溶液，制備含空白基質(zhì)的復(fù)合溶液，進(jìn)樣2 μL測(cè)定，記錄峰面積(Am)，按公式R=As/Am×100%，計(jì)算提取回收率。本實(shí)驗(yàn)條件下，血漿CPT-11提取回收率88.81%～97.81%；RSD 3.35%～13.34%。同法測(cè)得大鼠血漿SN-38提取回收率95.60%～106.29%；RSD 3.18%～12.55%。

2.5.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)得低、中、高濃度血漿CPT-11樣品，室溫放置24 h穩(wěn)定性，RSD 5.13%～7.18%；樣品置-20 ℃冰箱保存0，1，3 d穩(wěn)定性，RSD 8.09%～10.61%；樣品兩次解凍凍融穩(wěn)定性，RSD 7.43%～12.11%。同法測(cè)定大鼠血漿SN-38室溫放置24 h穩(wěn)定性，RSD 3.40%～9.35%；樣品置-20 ℃冰箱保存0，1，3 d穩(wěn)定性，RSD 5.47%～8.85%；樣品2次解凍凍融穩(wěn)定性，RSD7.63%～10.63%

2.6CPT-11及其代謝產(chǎn)物SN-38藥動(dòng)學(xué)特征 UPLC-MS/MS法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿CPT-11及SN-38濃度，DAS 3.1 版藥動(dòng)學(xué)軟件處理血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計(jì)矩方法求算相應(yīng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其中Cmax為實(shí)測(cè)值。采用SPSS21.0版軟件對(duì)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠血漿CPT-11與SN-38藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 兩組大鼠血漿CPT-11與SN-38藥-時(shí)曲線(n=6)

3 討論

CPT-11是晚期或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌一線化療藥物，化療會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)，如骨髓抑制、遲發(fā)性腹瀉、惡心嘔吐、肝腎功能損害等，因此化療期間臨床上常使用輔助藥物減輕化療不良反應(yīng)。人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效。有研究顯示，人參可以減輕化療所致不良反應(yīng)[2]。亦有觀點(diǎn)認(rèn)為，人參可以提高化療療效，增強(qiáng)化療藥物細(xì)胞毒作用。人參以及含人參的中藥制劑是臨床常用輔助藥物，如參麥注射液、生脈膠囊等。常見(jiàn)用法是化療當(dāng)天聯(lián)合應(yīng)用，于化療藥物使用前給藥。因此，本實(shí)驗(yàn)中大鼠給藥時(shí)，實(shí)驗(yàn)組單次灌胃人參總皂苷，0.5 h后尾靜脈注射給予CPT-11，以模擬臨床常見(jiàn)給藥方式。

臨床FOLFIRI方案中CPT-11劑量是180 mg·(m2)-1，按照體表面積1.7 m2、體質(zhì)量60 kg、根據(jù)人體與實(shí)驗(yàn)大鼠劑量換算，大鼠給藥劑量約33.15 mg·kg-1，但預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠死亡率較高，且狀態(tài)很差，活動(dòng)度嚴(yán)重下降，奄奄一息，提示給藥劑量偏大。給藥10 mg·kg-1，血藥濃度太低，檢測(cè)受限。筆者參考文獻(xiàn)[5]，給藥劑量定為20 mg·kg-1。CPT-11給藥20 mg·kg-1，濃度測(cè)定與大鼠狀態(tài)均較理想，因此本實(shí)驗(yàn)大鼠CPT-11給藥劑量定為20 mg·kg-1。

CPT-11療效與不良反應(yīng)與SN-38緊密相關(guān)，SN-38活性是CPT-11原藥1000倍，也是CPT-11劑量限制性毒性遲發(fā)型腹瀉的主要原因。本實(shí)驗(yàn)條件下，大鼠給予人參總皂苷以及尾靜脈注射CPT-11后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行雙尾配對(duì)t-檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CPT-11大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，人參總皂苷對(duì)CPT-11的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)明顯影響，但明顯延長(zhǎng)SN-38大鼠體內(nèi)半衰期(t1/2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CPT-11在體內(nèi)經(jīng)羧酸酯酶(存在組織、血清以及肝細(xì)胞內(nèi))作用下，轉(zhuǎn)化成具有活性的代謝產(chǎn)物SN-38，在體內(nèi)另一個(gè)代謝途徑經(jīng)細(xì)胞色素P450，其中主要為CYP3A4代謝生成7-乙基-10-[4-N-(5-氨基戊酸)-1-哌啶基]-羰基氧喜樹堿(7-ethyl-10-[4-N-(5-aminovaleric acid)-1-piperidyl]-carbonyloxycamp-tothecin，APC)和7-乙基-10-(4-氨基-1-哌啶基)-羰基氧喜樹堿[7-ethyl-10-(4-amino-1-piperidinyl)-carbonyloxycamptothecin，NPC][6]。而人參的主要活性成分人參皂苷化合物K(compound K)、原人參二醇(protopanaxadiol，PPD)、原人參三醇(Protopanaxatriol，PPT)對(duì) CYP3A4均有強(qiáng)抑制性[7]。本實(shí)驗(yàn)條件下，與人參總皂苷合用，SN-38在大鼠體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，但對(duì)CPT-11藥動(dòng)學(xué)參數(shù)影響不大，這可能與人參皂苷給藥方式有關(guān)。人參皂苷對(duì)CYP3A4酶的抑制作用單次給藥作用不明顯，需長(zhǎng)期給藥方可顯現(xiàn)。另外影響CPT-11體內(nèi)血藥濃度還有一個(gè)重要因素，即肝細(xì)胞微粒體內(nèi)將SN-38代謝成無(wú)活性的SN-38葡萄糖醛酸苷(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin glycuronide，SN-38G)酶，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UDP-glucuronosylt transferase 1A1，UGT)[8]，UGT1A1基因多態(tài)性對(duì)CPT-11體內(nèi)血藥濃度有影響。因此研究人參總皂苷對(duì)CPT-11血藥濃度的影響，可能需要進(jìn)一步消除UGT1A1酶對(duì)CPT-11及SN-38的干擾。

筆者在本實(shí)驗(yàn)研究條件下發(fā)現(xiàn)人參總皂苷可以延長(zhǎng)大鼠體內(nèi)CPT-11及其活性代謝產(chǎn)物SN-38半衰期，但人參總皂苷對(duì)CPT-11及SN-38影響的作用機(jī)制，以及如何進(jìn)一步消除其他因素影響，仍值得進(jìn)一步研究。