權學民，張 耀，張 強*，趙昌松，王 浩，趙汝崗，馬 睿

1.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院骨科，北京 100015

2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院骨科，北京 100050

后縱韌帶骨化癥（OPLL）的特征是異位骨形成替代韌帶組織［1-2］。OPLL在亞洲人中的發(fā)生率高于歐洲人和美國人，有報道［3］顯示，OPLL在日本的發(fā)生率為1.9% ~ 4.3%，在中國為0.44% ~ 8.92%。目前OPLL的發(fā)生機制仍未完全闡明，遺傳因素和環(huán)境因素在其發(fā)生過程中均起作用。既往研究［4-9］表明，遺傳因素是OPLL的主要因素，并且和環(huán)境因素相互作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是轉化生長因子-β（TGF-β）超家族的成員，BMP結合骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體 -ⅠA（BMPR-ⅠA）、BMPR-ⅠB 和 BMPR-Ⅱ，通過Smad信號轉導通路刺激成骨細胞分化［10-11］。BMPR-ⅠA是BMPR家族的一種亞型，在BMP信號轉導通路中起著重要調節(jié)作用［12-14］。既往研究［10］表明，BMPR-ⅠA在異位骨化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。本研究旨在探討B(tài)MPR-ⅠA在OPLL發(fā)展中的作用，評估其是否為OPLL的易感基因，現(xiàn)報告如下 。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DNA純化試劑盒（Promega公司，美國）；C3H10T1/2細胞（北京協(xié)和細胞庫，中國）；引物和pcDNA3.1-BMPR-ⅠA質粒（Invitrogen公司，美國）；ABI 3730XL POP7 DNA測序分析5.2系統(tǒng)（Applied Biosystems公司，美國）；Lipofectamine 2000轉染試劑盒、胎牛血清和培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國）；BMPR-ⅠA特異性單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；P-Smad1/5/8和Smad4多克隆抗體（CST公司，美國）；堿性磷酸酶（AKP/ALP）測試盒和骨鈣素（OST）測試盒（南京建成生物工程研究所，中國）。

1.2 材料獲取

選擇首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院和天壇醫(yī)院收治的292例OPLL患者和586名非OPLL者（表1）。OPLL的診斷主要基于影像學檢查，包括X線、CT和MRI。OPLL分型由側位X線片和CT確定。根據影像學和實驗室檢查，排除強直性脊柱炎和其他代謝性疾?。ㄈ绻擒浕Y、骨質疏松癥、彌散性特發(fā)性骨骼肥大癥或甲狀旁腺功能亢進癥）。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準（KY2011-005-01），所有參與者知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組患者一般資料

1.3 BMPR-ⅠA的單核苷酸多態(tài)性（SNP）擴增和基因分型

使用DNA純化試劑盒分離DNA，通過PCR擴增整個BMPR-ⅠA編碼序列，通過ABI 3730XL POP7 DNA測序分析5.2系統(tǒng)對PCR產物進行基因分型，相關引物見表2，排除雜合度未知且等位基因頻率低于5%的SNP位點。

表2 BMPR-ⅠA引物序列

1.4 細胞模型構建

取第10代C3H10T1/2細胞，按照1.5×104/孔的密度接種于6孔板內，待細胞生長至60% ~ 80%匯合時，使用Lipofectamine 2000通過pcDNA3.1-BMP2質粒進行轉染。隨機將細胞分為6組：正常組、空載體組、野生型組、rs34755052單突變組、rs11528010單突變組和雙突變組。

1.5 蛋白質印跡法檢測各組BMPR-ⅠA、P-Smad1/5/8和Smad4的表達

用PBS緩沖液清洗3次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿器勻漿、4℃下12 000×g離心10 min（g=9.806 65 m/s2），取上清測定蛋白濃度，取等量蛋白提取物通過SDS-PAGE進行分離，電泳轉移到硝酸纖維素膜上。將膜在5%脫脂牛奶的1×Tris緩沖鹽水和1×TBST中封閉1 h，然后與特異性單克隆抗體在室溫下孵育4 h，與二抗在室溫下孵育1 h，通過化學發(fā)光進行顯色，使用Kodak Image Station掃描并分析。

1.6 檢測ALP和OC活性

將細胞轉入50 mmol Tris（pH 7.40）中，并通過超聲裂解。采用酶聯(lián)免疫吸附法，37℃時以10 mmol對硝基苯基磷酸酯為底物的測定緩沖液（100 mmol Sigma221緩沖液含10 mmol MgCl2，pH 10.3）中測試細胞裂解物的ALP和OC活性。使用OD405的光密度讀取反應混合物，并使用對硝基苯酚的標準曲線（P-NP 500 nmol/ml，Sigma）作為參考。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，Hardy-Weinberg平衡以及基因型和等位基因分布采用χ2檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 2組BMPR-ⅠA的SNP位點基因型和等位基因分布

共鑒定12個既往報道過的BMPR-ⅠA的SNP位點，其中，rs34755052（C/T）和rs11528010（C/A）的頻率組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表3）。2個位點的基因型和等位基因分布比較，rs34755052（C/T）中“CC”“CT”和“TT”基因型差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表3），且OPLL組中“C”“T”等位基因的頻率低于非OPLL組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）。rs11528010（C/A）中的“CC”“CA”和“AA”基因型差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表3），且OPLL組中“C”“A”等位基因的頻率低于非OPLL組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表3）。

表3 2組rs34755052（C/T）和rs11528010（C/A）的基因型和等位基因分布

2.2 BMPR-ⅠA在各轉染組的表達

蛋白質印跡法檢測結果顯示，野生型組、rs34755052單突變組、rs11528010單突變組、雙突變組的BMPR-ⅠA蛋白表達明顯高于正常組和空載體組，且各突變組均高于野生型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖1）。

圖1 各轉染組細胞BMPR-ⅠA蛋白表達

2.3 P-Smad1/5/8和Smad4在各轉染組的表達

蛋白質印跡法檢測結果顯示，野生型組、rs34755052單突變組，rs11528010單突變組、雙突變組的P-Smad1/5/8蛋白表達明顯高于正常組和空載體組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，圖2）；且rs34755052單突變組和雙突變組明顯高于rs11528010單突變組和野生型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。各組P-Smad4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05，圖3）。

圖2 各轉染組細胞P-Smad1/5/8蛋白表達

圖3 各轉染組細胞P-Smad4蛋白表達

2.4 各轉染組的ALP和OC活性

野生型組、rs34755052單突變組、rs11528010單突變組和雙突變組的ALP活性明顯高于正常組和空載體組，rs34755052單突變組高于其他突變組和野生型組，野生型組高于rs11528010單突變組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05，表4）。

野生型組和rs34755052單突變組的OC活性明顯高于正常組和空載體組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表4）。

表4 各轉染組細胞ALP和OC活性

3 討 論

BMPR-ⅠA可能在OPLL發(fā)展的不同階段發(fā)揮重要作用。首先，病理學研究［15］發(fā)現(xiàn)，BMPR在OPLL患者的骨化韌帶組織中高表達；其次，免疫組織化學研究［16］表明，骨化基質中存在BMPR-ⅠA；此外，還有研究［17-18］表明，微調水平的BMPR-ⅠA介導的信號對于牙齒和顳下頜關節(jié)的發(fā)育至關重要。

本研究首先分析了BMPR-ⅠA整個編碼區(qū)內的遺傳變異是否與OPLL發(fā)生有關，共鑒定了12個SNP位點，發(fā)現(xiàn)OPLL患者和非OPLL者的rs34755052（C/T）和rs11528010（C/A）位點頻率不同。比較OPLL患者和非OPLL者2個SNP位點的基因型和等位基因的分布發(fā)現(xiàn)，rs34755052（C/T）中“CC”“CT”“TT”基因型有差異，rs11528010（C/A）中的“CC”“CA”“AA”基因型有差異，表明“CT”基因型和“CA”基因型與OPLL的發(fā)生有關。但是，鑒于rs34755052（C/T）位于BMPR-ⅠA基因的上游，而rs11528010（C/A）位于BMPR-ⅠA基因的第3外顯子，該SNP位點對OPLL遺傳易感性的影響尚不確定。既往研究［19］發(fā)現(xiàn)，BMPR-ⅠA基因上游有部分轉錄因子結合位點影響了BMPR-ⅠA的表達，并導致原本具有不良成骨活性的細胞發(fā)生鈣化。因此，本研究組進一步檢測這些SNP位點是否影響B(tài)MPR-ⅠA的基因表達和細胞內信號轉導。BMP信號通路主要通過Smad介導的信號轉導途徑發(fā)生，在BMP信號通路中，P-Smad1/5/8和Smad4是關鍵蛋白，而ALP和OC是成骨細胞特異性蛋白［13，20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，野生型組和各突變組表達的BMPR-ⅠA蛋白明顯高于正常組和空載體組，而各突變組又高于野生型組，表明野生型或突變型載體可以成功轉染到C3H10T 1/2細胞中并且可以穩(wěn)定表達。野生型組和各突變型組表達的P-Smad1/5/8蛋白明顯高于正常組和空載體組，其中rs34755052單突變組又高于其他突變組和野生型組，表明BMPR-ⅠA基因的rs34755052（C/T）位點與P-Smad1/5/8蛋白表達呈正相關。野生型組和各突變組ALP活性明顯高于正常組和空載體組，其中rs34755052單突變組又高于其他突變組和野生型組，野生型組又高于rs11528010單突變組，表明BMPR-ⅠA基因的rs34755052（C/T）位點與ALP活性呈正相關。野生型組和rs34755052單突變組OC活性明顯高于正常組和空載體組，表明BMPR-ⅠA基因的rs34755052（C/T）位點與OC活性呈正相關。綜上，rs34755052（C/T）位點通過影響B(tài)MPR-ⅠA空間構象的核苷酸變化進而導致蛋白質功能異常。

早期的OPLL可采用非手術治療，但大多數OPLL患者病情是進展性的，因此，常須手術治療。近年來問世的新靶點藥物或許能夠為其提供新的治療選擇。Smad介導的信號通路在BMPR-ⅠA基因的SNP位點誘導OPLL的病理過程中起著重要作用，因此成為OPLL治療的靶點之一，在以后的研究中，該領域還需要更進一步研究。有研究［23］發(fā)現(xiàn)，自然狀態(tài)下骨化灶軸向長度每年增長約2.0 mm，厚度每年增長約0.2 mm，連續(xù)型和/或混合型骨化灶為骨化進展的主要危險因素。與自然進程相比，后路椎板切除融合術、各種前路手術均能減緩OPLL進展，而無內固定的椎板切除術、椎板成形術則會加快骨化進展。本研究中連續(xù)型和混合型OPLL患者約占53.4%，須引起重視。但是，該差異是否有其相應的遺傳分子機制，尚須進一步研究。

本研究的局限性。首先，盡管C3H10T1/2細胞已被用作人類胚胎成纖維細胞的替代模型用來研究成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞分化的分子機制，但仍會出現(xiàn)不完全相同的表型導致偏差。其次，本研究組沒有檢測其他成骨基因的表達，例如Runt相關轉錄因子2（RUNX2）、Ⅰ型膠原蛋白alpha1（COL1A1）和骨橋蛋白（OPN），因此，無法了解其他易感基因及其致病性。此外，盡管BMPR-ⅠA基因中2個SNP位點與OPLL的發(fā)生有關，但其發(fā)生的詳細機制仍然不完全清楚，在后續(xù)研究中，需要進一步研究明確BMPR-ⅠA的特定功能。

綜上，BMPR-ⅠA是OPLL的易感基因之一。rs34755052（C/T）中的“CT”基因型和rs11528010（C/A）中的“CA”基因型與OPLL的發(fā)生有關。BMPR-ⅠA基因上游的rs34755052（C/T）位點與P-Smad1/5/8蛋白表達水平及ALP和OC活性呈正相關。Smad介導的信號通路在BMPR-ⅠA誘導OPLL的病理過程中起著重要作用。