張國飛，胡大遷，覃吉超，李陽坤

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院胃腸外科，武漢 430030

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是人類消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，而且發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。盡管結(jié)直腸癌的早期診斷與聯(lián)合治療取得一定的進展，但其預(yù)后仍不理想[3]。因此深入探究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機制，對治療結(jié)直腸癌有極大幫助。Ras信號通路失調(diào)是癌癥常見表現(xiàn)[4]，Rab20蛋白是Ras蛋白家族(Ras，Rho/Rac/Cdc42，Ran，Sar/Arf，Rab)的成員之一，調(diào)控細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運，參與胞吞胞吐、核內(nèi)體形成、囊泡的形成和運輸?shù)冗^程[5-7]，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[8-9]，然而目前Rab20在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究分析了Rab20在結(jié)直腸腫瘤組織及正常組織的表達，探討Rab20對結(jié)直腸癌細胞增殖及干性的影響，并進一步揭示可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人結(jié)直腸癌細胞SW620細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫，人正常結(jié)直腸上皮細胞由正常結(jié)直腸原代組織分離，XhCRC細胞由人結(jié)直腸癌移植瘤模型分離[10]。DMEM、DMEM/F12細胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、細胞因子B27、牛血清蛋白(BSA)、人重組表皮生長因子(hEGF)購自美國Gibco公司，外源Wnt3a蛋白、CCK-8試劑購自美國MCE公司，psPAX2、pMD2G、pLKO.1-NC和pLKO.1-shRab20質(zhì)粒購自武漢奧科生物有限公司；ts045-VSVG-EGFP質(zhì)粒購自美國Addgene生物有限公司，Western blot試劑購自上海碧云天公司，BCA試劑盒及Turbofect轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司，抗體β-actin、GAPDH、Rab20購自武漢ABclonal生物有限公司，抗體β-catenin、Cyclin D1購自美國Cell Signaling Technology公司，抗體8G5F11購自美國Kerafast公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠抗體購自武漢啟動子生物有限公司。

1.2 病毒包裝與敲減細胞系的構(gòu)建

對數(shù)生長期的293T細胞接種于6孔板，達到70%～80%的細胞密度后，使用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑，將pLKO.1-NC/shRab20∶psPAX2∶pMD2G按2∶2∶1混合，每孔加5 μg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6孔板細胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，40 h后收集含有病毒的細胞上清。對數(shù)生長期的XhCRC細胞、SW620細胞接種于12孔板，達到30%～50%的細胞密度后，加入400～800 μL含病毒上清，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，40 h后加入2 μg/mL嘌呤霉素篩選成功轉(zhuǎn)染的細胞，并使用Western blot驗證。

1.3 結(jié)直腸癌細胞囊泡運輸檢測

使用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑，將2 μg的ts045-VSVG-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于6孔板內(nèi)對數(shù)生長期的XhCRC細胞、SW620細胞，8 h后更換新鮮培養(yǎng)液，并置于含5%CO2、40℃的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，使ts045-VSVG-EGFP在細胞中表達并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，隨后將細胞換至含5%CO2、32℃的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使ts045-VSVG-EGFP由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始向細胞膜運輸[11]，繼續(xù)培養(yǎng)45 min后，使用4%多聚甲醛固定，加入抗體8G5F11特異性識別細胞膜表面蛋白VSVG，使用熒光顯微鏡進行檢測。

1.4 結(jié)直腸癌細胞增殖能力檢測

對數(shù)生長期的實驗組和對照組細胞按照2×103個/100 μL標準接種96孔板，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h后，用酶標儀于450 nm波長下測定吸光度值，繪制細胞增殖曲線，縱坐標為相對吸光度，橫坐標為時間。

1.5 結(jié)直腸癌細胞球體形成能力檢測

對數(shù)生長期的XhCRC細胞、SW620細胞以5000個/孔接種于24孔超低吸附板中，加入干細胞培養(yǎng)液，于含5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，顯微鏡下觀察并記錄直徑≥50 μm的細胞球體個數(shù)，計算細胞球體形成率。

1.6 Western blot檢測

處理后的細胞，加入NP40裂解液充分裂解，提取蛋白質(zhì)，經(jīng)BCA試劑定量檢測，通過SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，先后加入相應(yīng)一抗于4℃孵育過夜、二抗于室溫孵育1 h后，曝光顯影。

1.7 基于生物信息學(xué)分析Rab20在結(jié)直腸癌組織的表達

使用TIMER2(http：//timer.cistrome.org/)和GEPIA2(http：//gepia2.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫分析Rab20在結(jié)直腸癌及正常組織的表達差異，設(shè)定閾值log2FC=1，P<0.01，納入數(shù)據(jù)庫中正常結(jié)直腸組織與結(jié)直腸癌組織數(shù)據(jù)即可得到基因表達圖。

1.8 Rab20相關(guān)基因富集分析

使用STRING(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫對Rab20蛋白進行分析，設(shè)定閾值最低交互分數(shù)為0.150，并選擇數(shù)據(jù)來源為已發(fā)表文獻，且得到經(jīng)實驗驗證的與Rab20相結(jié)合的蛋白。使用GEPIA2(http：//gepia2.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)基因檢測，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫腫瘤組織和正常組織的數(shù)據(jù)，獲得與Rab20表達相關(guān)的基因。結(jié)合兩組數(shù)據(jù)，使用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對Rab20相關(guān)基因進行京都基因與基因組百科全書信號途徑分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本體富集分析(the Gene Ontology，GO)。統(tǒng)計偏差的截止標準為P<0.05。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均獨立并重復(fù)進行3次。使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對各組所得的數(shù)據(jù)進行分析，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rab20在人結(jié)直腸腫瘤組織及細胞系中高表達

TIMER2和GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示結(jié)直腸腫瘤組織中Rab20含量高于鄰近正常組織(圖1A、1B)。Western blot檢測顯示結(jié)直腸癌細胞系SW620和XhCRC細胞中Rab20的表達水平顯著高于人正常腸上皮細胞(圖1C)。為進一步驗證Rab20蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，對XhCRC細胞和SW620細胞Rab20基因進行敲減，shRab20組細胞的Rab20表達量顯著低于對照shNC組細胞(圖1D)，提示敲減成功，可以進行后續(xù)實驗。

A：TIMER2分析Rab20在直腸癌(READ)中的表達，*P<0.05；B：GEPIA2分析Rab20在結(jié)腸癌(COAD)中的表達，**P<0.01；C：Western blot檢測Rab20的表達，Nor為人正常結(jié)直腸黏膜上皮細胞；D：Western blot驗證Rab20的敲減圖1 Rab20在人結(jié)直腸腫瘤組織及結(jié)直腸癌細胞系中的表達Fig.1 The expression of Rab20 in human colorectal tumor tissues and cell lines

2.2 Rab20相關(guān)基因的富集分析

為分析Rab20在結(jié)直腸癌中的相關(guān)作用，篩選出Rab20結(jié)合蛋白與Rab20表達相關(guān)基因進行富集分析?；赟TRING工具，獲得10個經(jīng)實驗驗證的Rab20結(jié)合蛋白(圖2A)。利用GEPIA2工具結(jié)合TCGA的腫瘤表達數(shù)據(jù)，得到了與Rab20基因表達相關(guān)的64個基因，分析顯示，在大多數(shù)癌癥類型中，Rab20基因的表達與FCGRT、FUCA1、MVP、PRR13和TNFSF13等基因呈正相關(guān)(圖2B)。結(jié)合這兩組數(shù)據(jù)進行KEGG(圖2C)和GO(圖2D)分析，表明Rab20與細胞抗原加工呈遞、移植物抗宿主反應(yīng)等通路有關(guān)，與細胞囊泡、細胞內(nèi)吞、物質(zhì)運輸?shù)壬飳W(xué)行為密切相關(guān)。

A：STRING數(shù)據(jù)庫分析Rab20結(jié)合蛋白；B：GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析Rab20相關(guān)基因，Rab20的表達與FCGRT、FUCA1、MVP、PRR13和TNFSF13基因呈正相關(guān)；C：Rab20相關(guān)基因的KEGG分析；D：Rab20相關(guān)基因的GO分析圖2 Rab20相關(guān)基因富集分析Fig.2 Gene set enrichment analysis of Rab20-related genes

2.3 Rab20調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的囊泡運輸

進一步驗證Rab20在結(jié)直腸癌細胞囊泡運輸中的作用，分別在XhCRC-shNC和XhCRC-shRab20細胞中轉(zhuǎn)染ts045-VSVG-EGFP質(zhì)粒，使用8G5F11抗體識別運輸至細胞膜表面的VSVG蛋白，通過追蹤VSVG熒光蛋白位置及細胞膜表面分布，示蹤囊泡運輸[11]。熒光顯微鏡觀察(圖3A)，并計算細胞膜表面VSVG/總VSVG比值(圖3B)。結(jié)果顯示，敲減Rab20顯著抑制XhCRC細胞的囊泡運輸功能。

A：免疫熒光檢測XhCRC-shNC和XhCRC-shRab20細胞的囊泡運輸能力(比例尺為50μm)；B：統(tǒng)計0 min和45 min時，細胞膜表面VSVG/總VSVG比值；與shNC組比較，**P<0.01圖3 Rab20敲減對XhCRC細胞囊泡運輸?shù)挠绊慒ig.3 Effect of Rab20 knockdown on the vesicle traffic of XhCRC cells

2.4 敲減Rab20抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖與干性

為探討Rab20與結(jié)直腸癌細胞增殖及干性表型的關(guān)系，分別在XhCRC-shNC和XhCRC-shRab20細胞中進行CCK-8實驗和細胞球體形成實驗。CCK-8實驗結(jié)果顯示在48 h和72 h后，shRab20組細胞增殖能力顯著低于shNC組(圖4A)。球體形成實驗表明，shRab20組細胞球體形成數(shù)量顯著低于shNC組，細胞球體形成率顯著降低(圖4B)。提示敲減Rab20能夠抑制結(jié)直腸癌細胞增殖與干性。

A：細胞增殖曲線；B：細胞球體形成實驗(比例尺為200 μm)；與shNC組比較，**P<0.01圖4 Rab20敲減對XhCRC細胞增殖和干性的影響Fig.4 Effect of Rab20 knockdown on proliferation and stemness of XhCRC cells

2.5 Rab20抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖與干性的機制

Western blot檢測結(jié)果顯示，Rab20敲減后，β-catenin、Cyclin D1的蛋白表達顯著降低，提示Rab20可能調(diào)控Wnt通路影響結(jié)直腸癌細胞；加入外源Wnt3a蛋白后，能夠明顯逆轉(zhuǎn)降低的β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(圖5)。

與shNC組比較，*P<0.05，**P<0.01；與shRab20組比較，##P<0.01圖5 Rab20敲減及外源性Wnt3a處理對XhCRC細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響Fig.5 Effect of Rab20 knockdown and Wnt3a on Wnt/β-catenin pathway in XhCRC cells

同時外源Wnt3a蛋白處理shRab20組細胞后，CCK-8實驗和細胞球體形成實驗結(jié)果顯示敲減Rab20抑制結(jié)直腸癌細胞增殖與干性的作用被顯著逆轉(zhuǎn)(圖6)。以上結(jié)果提示Rab20可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路，影響結(jié)直腸癌細胞的增殖與干性。

A：細胞增殖曲線；B：細胞球體形成實驗(比例尺為200 μm)；與shNC組比較，**P<0.01；與shRab20組比較，##P<0.01圖6 外源性Wnt3a處理對敲減Rab20后XhCRC細胞增殖和干性的影響Fig.6 Effect of Wnt3a on proliferation and stemness of Rab20-knockdown XhCRC cells

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床常見的腫瘤，在全世界范圍表現(xiàn)出較高的發(fā)病率與死亡率[12]。目前結(jié)直腸癌的診療逐步完善，然而仍有較大部分患者出現(xiàn)不良結(jié)局[2-3]。因此，測定結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的標志細胞因子，研究其可能的作用機制，對結(jié)直腸癌的診斷與治療極為重要。

Rab蛋白是高度保守的囊泡運輸調(diào)控因子，通過結(jié)合GFP與下游網(wǎng)格蛋白和細胞骨架相互作用，觸發(fā)細胞的物質(zhì)運輸[13]，并參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移、代謝和分泌等過程[14]。Rab20是Rab家族成員，在胰腺癌、陰莖鱗癌、膀胱癌等多種實體瘤中高表達，促進腫瘤細胞增殖[15-18]，在肝細胞癌中Rab20調(diào)控肝癌細胞外泌體分泌，調(diào)控肝癌發(fā)生[19]。Rab20基因在結(jié)直腸腺瘤中高度擴增，與結(jié)腸腺瘤復(fù)發(fā)和不良結(jié)局相關(guān)[8]。然而Rab20在結(jié)直腸癌中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)Rab20在結(jié)直腸癌組織與細胞中的表達顯著高于正常結(jié)直腸組織與上皮細胞?；蚋患治霭l(fā)現(xiàn)Rab20與胞吞胞吐、囊泡運輸和核內(nèi)體形成等生物過程密切相關(guān)。進一步敲減Rab20，實驗組XhCRC細胞的囊泡運輸能力明顯受損，表明Rab20具有促進結(jié)直腸癌細胞囊泡運輸?shù)淖饔谩?/p>

Wnt信號通路的異?；罨前┌Y常見表現(xiàn)[20]，其中Wnt配體通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用，激活Wnt/β-catenin通路，調(diào)控腫瘤干性、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[21]?；赗ab20在細胞囊泡運輸與分泌中的作用，我們的研究進一步探討了Rab20對Wnt信號通路的影響。敲減Rab20后，實驗組XhCRC細胞增殖能力和細胞球體形成能力顯著低于對照組細胞，提示Rab20具有增強結(jié)直腸癌細胞增殖及干性的作用。敲減Rab20組細胞β-catenin、Cyclin D1表達水平明顯降低，而加入外源Wnt3a處理能顯著抵消降低效果。外源Wnt3a處理敲減Rab20組細胞，能顯著逆轉(zhuǎn)敲減Rab20對結(jié)直腸癌細胞增殖及干性的抑制作用。上述結(jié)果表明，Rab20在結(jié)直腸癌中高表達，調(diào)控囊泡運輸功能，并可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路增強結(jié)直腸癌細胞的增殖和干性。