黃曉穎，黃啟友，謝竹夫，姚 菲，龍 輝，吳清明，，3△

武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院1感染免疫與腫瘤微環(huán)境研究所，2武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430065 3職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430081

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見(jiàn)的消化道上皮源性惡性腫瘤，發(fā)病率位于惡性腫瘤第3位，死亡率高居第2位；我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率在男性和女性中均呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)[1]。2型糖尿病(T2DM)是以胰島素分泌缺陷或生物功能受損引起的高血糖為特征的代謝性疾病，目前2型糖尿病的病理生理學(xué)機(jī)制被認(rèn)為是胰島素抵抗和β細(xì)胞功能缺陷。大量流行病學(xué)研究表明，與非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)更高[2-4]?！吨袊?guó)糖尿病防治指南2020版》中將生活方式管理和二甲雙胍(MET)作為2型糖尿病患者高血糖的一線治療方案[5]。目前包括基礎(chǔ)研究、臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)研究在內(nèi)的大量研究表明，二甲雙胍作為2型糖尿病的一線治療藥物，同時(shí)也可能是一種能夠降低結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)預(yù)防藥物，其可能的抑癌機(jī)制包括調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、免疫和腸道菌群等[6-8]。

因此本研究通過(guò)高脂高糖飲食聯(lián)合腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型[9]，在此基礎(chǔ)上使用二甲基肼(DMH)誘導(dǎo)大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生，以此構(gòu)建2型糖尿病結(jié)直腸癌大鼠模型，采用二甲雙胍灌胃和控制大鼠飲食攝入量的方法，模擬臨床2型糖尿病患者高血糖的治療方案進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)2型糖尿病大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生情況以及腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲雙胍、STZ、DMH均購(gòu)于美國(guó)Sigma。無(wú)水乙醇、二甲苯、中性樹(shù)膠購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。蘇木精-伊紅(HE)染液、分化液、返藍(lán)液購(gòu)于武漢佰仟度生物科技有限公司?？俁NA提取試劑Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen，Real-time PCR逆轉(zhuǎn)錄-聚合鏈酶反應(yīng)試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO，SYBR Green Supermix購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)入36只雄性SD大鼠，6周齡，體重180～230 g。SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，每日光照12 h，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建2型糖尿病結(jié)直腸癌大鼠模型 取24只SPF級(jí)SD大鼠以高脂高糖飼料(HFD)飼養(yǎng)6周后，采取腹部注射STZ(35 mg/kg)的方式進(jìn)行2型糖尿病造模。注射1周后，采用大鼠尾尖取血法用羅氏血糖儀和血糖試紙測(cè)量大鼠空腹血糖(FBG)，以FBG≥11.1 mmol/L為2型糖尿病模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)[10]。根據(jù)STZ說(shuō)明書(shū)，對(duì)未達(dá)標(biāo)的大鼠進(jìn)行STZ補(bǔ)注后，所有造模大鼠的FBG均大于11.1 mmol/L。2型糖尿病模型構(gòu)建成功后，將所有大鼠的飲食轉(zhuǎn)為普通飼料喂養(yǎng)，同時(shí)每只大鼠給予約為其體重5%的維持飼料，以模擬臨床上2型糖尿病患者高血糖一線治療方案中的生活方式管理。在2型糖尿病模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行DMH腹腔注射，注射濃度為30 mg/kg，每周1次，持續(xù)給藥32周。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將2型糖尿病結(jié)直腸癌模型大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control group)和實(shí)驗(yàn)組(MET group)，每組12只。在2型糖尿病模型構(gòu)建成功后DMH腹腔注射的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每天給予二甲雙胍灌胃，二甲雙胍濃度按200 mg/(kg·d)，灌胃量3 mL/kg[11]，對(duì)照組給予0.9%生理鹽水灌胃。另取12只SD大鼠為正常組，僅給予普通飼料，不作任何其他處理。

1.2.3 動(dòng)物取材與指標(biāo)觀察 大鼠飼養(yǎng)過(guò)程中，每4周記錄大鼠體重，測(cè)量空腹血糖，并觀察各組大鼠毛發(fā)、肛門(mén)、大便情況。在DMH注射32周末取材，取材前大鼠禁食24 h，解剖前記錄體重和FBG。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后解剖大鼠，觀察大鼠器官有無(wú)病變，取盲腸下端至肛門(mén)處分離結(jié)直腸，并縱向剖開(kāi)腸道，取出大鼠腸道內(nèi)糞便，-80℃凍存，用于腸道菌群16S rRNA測(cè)序；4℃預(yù)冷的0.9%生理鹽水清理結(jié)直腸，直尺測(cè)量長(zhǎng)度，觀察結(jié)直腸病變情況，并記錄腫瘤個(gè)數(shù)。取腫瘤病灶處左右各2 cm結(jié)直腸組織標(biāo)本，包括腫瘤組織與癌旁組織、未患癌的正常結(jié)直腸組織，從中截取兩份，一份完全浸泡于4%多氯甲醛溶液中，置于4℃冰箱中，用于HE染色實(shí)驗(yàn)，另一份加入1 mL Trizol置于-80℃冰箱中凍存，用于檢測(cè)正常腸組織和腫瘤組織中IL-17的表達(dá)。

1.2.4 HE染色與組織病理學(xué)觀察 石蠟切片脫蠟后，進(jìn)行HE染色，脫水封片，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 各組正常腸組織與癌組織中IL-17的表達(dá) 采用Trizol法提取各組大鼠正常腸組織或腫瘤組織中的總RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值，若該值在1.8～2.2范圍內(nèi)，則認(rèn)為RNA純度較高。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶連反應(yīng)(qRT-PCR)反應(yīng)。IL-17引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，上游引物：5′-TGCCTGATGCTGTTGCTGCTAC-3′，下游引物：5′-TTGGACACACTGAACTTTGAGGGATG-3′。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃反應(yīng)10 s，60 ℃持續(xù)30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 大鼠腸道菌群測(cè)序 通過(guò)CATB法提取大鼠糞便樣本中的DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行等濃度混養(yǎng)和純化，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重與血糖監(jiān)測(cè)

2.1.1 大鼠體重監(jiān)測(cè) 高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周后大鼠體重增長(zhǎng)更為明顯，但與普通飼料喂養(yǎng)的大鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在成功構(gòu)建2型糖尿病模型后，大鼠體重呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)；在DMH注射32周后，正常組的體重明顯高于另兩組(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組平均體重與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

A：實(shí)驗(yàn)處理流程示意圖；B：各組大鼠體重變化曲線，**P<0.01 圖1 實(shí)驗(yàn)流程及大鼠體重監(jiān)測(cè)Fig.1 Body weight monitoring of rats

2.1.2 大鼠血糖監(jiān)測(cè) 圖2顯示，高脂高糖飼料喂養(yǎng)期間對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的FBG明顯高于正常組，且對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組血糖無(wú)明顯差異(P>0.05)，造模成功(圖2時(shí)間點(diǎn)4)。隨后實(shí)驗(yàn)組接受MET灌胃治療。在圖2時(shí)間點(diǎn)6，實(shí)驗(yàn)組的FBG已經(jīng)呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比有極顯著差異(P<0.01)，而對(duì)照組的FBG一直處在約25 mmol/L的高血糖水平。在實(shí)驗(yàn)后期(圖2時(shí)間點(diǎn)11～14)實(shí)驗(yàn)組的血糖水平逐漸升高，但實(shí)驗(yàn)組的平均FBG水平依舊與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)，因此相較于對(duì)照組，二甲雙胍仍有效抑制實(shí)驗(yàn)組大鼠的血糖水平升高。

*P<0.05圖2 大鼠血糖監(jiān)測(cè)Fig.2 Blood glucose monitoring in rats

2.2 大鼠腫瘤生長(zhǎng)情況

DMH注射32周末，對(duì)照組死亡1只，剩余11只；實(shí)驗(yàn)組死亡2只，剩余10只。解剖發(fā)現(xiàn)對(duì)照組11只大鼠結(jié)直腸均發(fā)生病變，其中1只大鼠面頰部病變導(dǎo)致其無(wú)法正常進(jìn)食(圖3A)，1只大鼠肝臟發(fā)生明顯病變(圖3B)，可見(jiàn)明顯的腸脹氣現(xiàn)象(圖3C)；實(shí)驗(yàn)組有6只大鼠結(jié)直腸發(fā)生病變，4只未有肉眼可見(jiàn)病變；正常組大鼠結(jié)直腸均未有肉眼可見(jiàn)病變。正常組與實(shí)驗(yàn)組未患癌大鼠的結(jié)直腸剖面內(nèi)表面光滑，無(wú)肉眼可見(jiàn)病變(圖3D、3E)。實(shí)驗(yàn)組患癌大鼠與對(duì)照組患癌大鼠的腸道內(nèi)均有大小不一的息肉狀或乳頭狀瘤體(圖3F、3G)。實(shí)驗(yàn)組腫瘤發(fā)生率60%，對(duì)照組腫瘤發(fā)生率100%，因此在本研究中相較于對(duì)照組，二甲雙胍干預(yù)有效地降低了結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤數(shù)[(1.70±1.79)個(gè)/只]較對(duì)照組[(3.82±2.17)個(gè)/只]明顯減少(P<0.05)，表明二甲雙胍干預(yù)可以顯著降低DMH誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生率。

A：對(duì)照組大鼠面頰部病變圖；B：對(duì)照組大鼠肝臟病變圖；C：對(duì)照組大鼠腸脹氣圖；D：正常組大鼠結(jié)直腸；E：實(shí)驗(yàn)組大鼠未病變結(jié)直腸；F：實(shí)驗(yàn)組大鼠病變結(jié)直腸；G：對(duì)照組大鼠病變結(jié)直腸圖3 大鼠解剖圖Fig.3 Anatomy of rats

2.3 HE染色與組織病理學(xué)觀察

通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)大鼠結(jié)直腸組織以及腫瘤組織進(jìn)行觀察。正常組大鼠與實(shí)驗(yàn)組未患癌大鼠的結(jié)直腸組織黏膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯炎性浸潤(rùn)(圖4A、4B)。實(shí)驗(yàn)組大鼠低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的腺體具有明顯的異型性，癌前病變組織內(nèi)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4C)；印戒細(xì)胞癌中可見(jiàn)脈管癌栓，分化較差，腺體中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4D)。對(duì)照組大鼠絨毛管狀腺癌癌前病變組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4E)；腺癌(圖4F)和肝癌(圖4G)組織中可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

A：正常組大鼠結(jié)直腸組織；B：實(shí)驗(yàn)組未患癌大鼠結(jié)直腸組織；C：實(shí)驗(yàn)組大鼠低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；D：實(shí)驗(yàn)組大鼠印戒細(xì)胞癌；E：對(duì)照組大鼠絨毛管狀腺癌；F：對(duì)照組腺癌；G：對(duì)照組肝癌圖4 各組大鼠結(jié)直腸組織以及肝臟組織病理變化(蘇木精-伊紅染色)Fig.4 Pathological changes of colorectal and liver tissues of rats in each group(HE staining)

2.4 各組大鼠正常腸組織與腫瘤組織中IL-17的表達(dá)

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠正常腸組織與腫瘤組織中IL-17的表達(dá)。腫瘤組織中IL-17的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.05)(圖5A)。與正常組腸組織相比，實(shí)驗(yàn)組正常組織中IL-17的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，對(duì)照組正常組織中IL-17的表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖5B)。而實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤組織中IL-17的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖略)。

A：腫瘤組織與正常組織中IL-17的表達(dá)；B：三組大鼠正常腸組織中IL-17的表達(dá)；*P<0.05,**P<0.01 圖5 各組大鼠正常腸組織和腫瘤組織中IL-17的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of IL-17 in normal colorectal tissues and tumor tissues of rats in each group

2.5 腸道菌群16S rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)及分析

2.5.1 三組大鼠腸道菌群操作分類(lèi)單元(OTUs)數(shù)目比較 根據(jù)聚類(lèi)得到的OTUs結(jié)果繪制VENN圖。圖6A可見(jiàn)正常組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間共有OTUs個(gè)數(shù)為666個(gè)，其中正常組特有1369個(gè)OTUs、對(duì)照組特有648個(gè)OTUs、實(shí)驗(yàn)組特有641個(gè)OTUs。相對(duì)于正常組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組特有的OTUs個(gè)數(shù)都有明顯的下降(P<0.05)，但二甲雙胍干預(yù)并未減少特有OUTs的個(gè)數(shù)。

2.5.2 三組大鼠腸道菌群物種相對(duì)豐度 根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)分組在門(mén)水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形圖。通過(guò)圖6B可見(jiàn)Firmicutes厚壁菌門(mén)，Bacteroidota擬桿菌門(mén)，Verrucomicrobia疣微菌門(mén)，Proteobacteria變形菌門(mén)，Actinobacteria放線菌門(mén)在3組中均是相對(duì)豐度占絕大多數(shù)的門(mén)水平菌群，其中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)以及疣微菌門(mén)在3組中占比均最高。根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息及其所在組別，選取豐度排名前35的屬，進(jìn)而進(jìn)行聚類(lèi)，繪制成熱圖。通過(guò)圖6C可見(jiàn)3組大鼠在屬水平上的物種聚集有著明顯的差異，其中正常組Romboutsia、Chryseobacterium聚集較多；對(duì)照組Alistipes、Colidextribacter、Ciceribacter、Bacteroides聚集較多；實(shí)驗(yàn)組Turicibacter、NK4A214_group、Clostridium_sensu_stricto_1、Limosilactobacillus、Blautia、Bifidobacterium(雙歧桿菌)聚集較多。

NC:正常組;MET:實(shí)驗(yàn)組;Control:對(duì)照組；A：VENN圖；B：物種聚類(lèi)熱圖；C：物種相對(duì)豐度柱形圖圖6 腸道菌群測(cè)序數(shù)據(jù)以及物種分布情況Fig.6 Gut microbiota sequencing data and species distribution

2.5.3 三組大鼠糞便菌群Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析 圖7A可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組Shannon指數(shù)低于對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常組Shannon指數(shù)低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；圖7B可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組Simpson指數(shù)均低于對(duì)照組(P<0.05)。提示DMH誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠成瘤過(guò)程中，大鼠腸道菌群Alpha多樣性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而二甲雙胍干預(yù)可以在一定程度上使2型糖尿病結(jié)直腸癌大鼠的腸道菌群Alpha多樣性更趨近于正常大鼠。

2.5.4 稀釋曲線和物種累積箱形圖 稀釋曲線可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。圖7C可見(jiàn)隨著測(cè)序數(shù)量增加，OTUs數(shù)量快速增加并逐漸趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTUs。物種累積箱形圖結(jié)果反映了持續(xù)抽樣下OUTs出現(xiàn)的速率。圖7D可見(jiàn)物種數(shù)量上升趨勢(shì)隨著樣本量的增加趨于平緩，則表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣本量的增加而顯著增多，表明抽樣充分，可以進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.5.5 三組大鼠糞便菌群Beta多樣性指數(shù)組件差異分析 NMDS是基于Bray-Curtis距離來(lái)進(jìn)行分析的非線性模型，根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點(diǎn)的形式反映在二維平面上。其設(shè)計(jì)目的是為了克服線性模型(包括PCA、PCoA)的缺點(diǎn)，更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)。圖7E顯示，實(shí)驗(yàn)組與正常組菌群組成相差最多，與對(duì)照組接近。

2.5.6 三組大鼠糞便菌群在不同水平上差異物種分析 通過(guò)t檢驗(yàn)在門(mén)水平和屬水平上找出組間顯著差異物種(P<0.05)。在門(mén)水平上可見(jiàn)對(duì)照組的厚壁菌門(mén)豐度低于正常組(P<0.05)，擬桿菌門(mén)與脫硫菌門(mén)豐度高于正常組(P<0.05)；在門(mén)水平上，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異(圖8A)。在屬水平上可見(jiàn)正常組中Ligilactobacillus的豐度相較于對(duì)照組更高，而B(niǎo)acteroides、Clostridium_sensu_stricto_6、Alistipes、UCG-005的豐度都低于對(duì)照組(圖8B)。實(shí)驗(yàn)組中Ligilactobacillus、Ruminococcus、[Eubacterium]_siraeum_group、Prevotellaceae_NK3B31_group、Alistipes、[Eubacterium]_fissicatena_group、UCG-005的豐度均低于對(duì)照組(圖8C)。

NC:正常組;MET:實(shí)驗(yàn)組;Control:對(duì)照組；各圖中左側(cè)為組間差異物種豐度，右側(cè)為組間差異的95%置信度，最右端是對(duì)應(yīng)物種的組間顯著性檢驗(yàn)P值;A：門(mén)水平上的對(duì)照組與正常組的物種差異；B：屬水平上的對(duì)照組與正常組的物種差異；C：屬水平上的對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的物種差異圖8 組間物種差異分析圖Fig.8 Analysis of species difference between groups

3 討論

結(jié)直腸癌(CRC)是最常見(jiàn)的癌癥之一，對(duì)全球健康構(gòu)成重大負(fù)擔(dān)。2018年，在全球所有癌癥中，CRC發(fā)病率排名第3，死亡率排名第2。目前大量臨床流行病學(xué)、大隊(duì)列人群研究均顯示相較于正常人群，2型糖尿病患者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)更高。早在2006年就有研究表明，2型糖尿病大鼠相較于非糖尿病大鼠在接受DMH誘導(dǎo)后結(jié)直腸癌的發(fā)生率更高[12]。二甲雙胍作為2型糖尿病的一線治療藥物，在結(jié)直腸癌中的化學(xué)預(yù)防作用受到了廣泛關(guān)注，其抑癌機(jī)制包括對(duì)細(xì)胞代謝、免疫和腸道菌群的調(diào)控。已有研究證明二甲雙胍可以激活A(yù)MPK通路，而AMPK可通過(guò)抑制mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)而抑制Th17細(xì)胞的分化[13]，且對(duì)自發(fā)性腸道腫瘤發(fā)生小鼠模型的研究已證明Th17分泌的細(xì)胞因子IL-17可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[14]。此外，亦有文獻(xiàn)表明特異性敲除IL-17A的腸細(xì)胞可減少小鼠的腫瘤形成，這表明IL-17A在腸細(xì)胞中具有直接致瘤功能[15]。研究發(fā)現(xiàn)，與口服二甲雙胍相比，靜脈注射二甲雙胍?guī)缀醪荒芨纳蒲?，且腸道中的二甲雙胍水平比血清中的水平高出100到300倍，這就使得腸道成為人體二甲雙胍的主要儲(chǔ)存庫(kù)[16]。臨床研究表明，二甲雙胍的干預(yù)可以改善2型糖尿病患者已經(jīng)失調(diào)的腸道菌群[17-19]，而結(jié)直腸癌的進(jìn)展與腸道菌群之間的聯(lián)系密不可分。因此越來(lái)越多的學(xué)者提出二甲雙胍或許在腸黏膜界面與腸道菌群發(fā)生代謝結(jié)合，以此改變腸道菌群的組成，發(fā)揮其腸道抑癌特性[20]。

本研究借鑒已有的2型糖尿病結(jié)直腸癌大鼠模型建立方法[10]，但此模型在2型糖尿病造模成功后繼續(xù)給予大鼠高脂高糖飼料且自由飲食，其結(jié)果中二甲雙胍對(duì)降低2型糖尿病大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒于臨床2型糖尿病患者高血糖的一線治療方案包括生活方式管理和二甲雙胍，本研究在2型糖尿病大鼠造模成功后，將飼料更換為普通飼料，且控制每只大鼠每日進(jìn)食量約為其體重的5%，以模擬臨床2型糖尿病患者高血糖的治療方案，同時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠體重和血糖的動(dòng)態(tài)變化以及一般情況。

在DMH注射32周末，解剖全部大鼠，觀察到二甲雙胍有效降低由DMH誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生率。通過(guò)石蠟包埋和HE染色，對(duì)3組大鼠結(jié)直腸組織和腫瘤組織進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍干預(yù)減輕大鼠腸道正常組織和癌前病變組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。qRT-PCR結(jié)果顯示IL-17的確在大鼠腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，二甲雙胍干預(yù)可降低2型糖尿病結(jié)直腸癌大鼠正常腸組織中的IL-17表達(dá)，但無(wú)法抑制2型糖尿病結(jié)直腸癌大鼠腫瘤組織中IL-17的表達(dá)。

為了探索二甲雙胍干預(yù)對(duì)大鼠腸道菌群的影響，本研究將大鼠糞便送至武漢邁維代謝公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示對(duì)照組相對(duì)正常組的Alpha多樣性有明顯的升高趨勢(shì)，而二甲雙胍干預(yù)則顯著降低Alpha多樣性并與正常組保持在相似水平上。NMDS分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與正常組菌群結(jié)構(gòu)相差最多，與對(duì)照組相似。

物種分布顯示在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在3組中占比均最高，此結(jié)果與黃廷玉等[21]的研究結(jié)果一致；在屬水平上，可見(jiàn)3組聚集物種差異顯著，其中對(duì)照組Alistipes、Bacteroides(脆弱擬桿菌屬)聚集較多。Alistipes被認(rèn)為與人類(lèi)CRC的發(fā)生相關(guān)[22]，且已有研究表明Alistipes在結(jié)直腸癌患者中含量更高，對(duì)APCMin/+小鼠使用二甲雙胍治療后其含量降低[23]。Bacteroides被認(rèn)為是通過(guò)腸內(nèi)慢性炎癥誘發(fā)結(jié)直腸癌發(fā)生的主要菌種之一，其產(chǎn)生的毒素能夠誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子IL-18的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)慢性炎癥的發(fā)生，此外還可以清除E-鈣粘蛋白，破壞上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致腸上皮增生，并誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生[24]。實(shí)驗(yàn)組中Turicibacter、Limosilactobacillus、Blautia、Bifidobacterium(雙歧桿菌)聚集較多。臨床研究發(fā)現(xiàn)在治療2型糖尿病患者時(shí)可以明顯聚集腸道內(nèi)Akkermansia，且Akkermansia的豐度下降被認(rèn)為與CRC的發(fā)生相關(guān)，但目前已有研究提出Turicibacter似乎與Akkermansia為拮抗菌群[25]，且Turicibacter在AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠糞便中被檢出[26]，因此本研究中實(shí)驗(yàn)組Turicibacter的聚集可能是造成其結(jié)直腸癌發(fā)生的一個(gè)重要菌屬。但目前研究多認(rèn)為L(zhǎng)imosilactobacillus、Blautia、Bifidobacterium為有益菌：Limosilactobacillus中的CECT5716已成為最有前途的益生菌之一，并被描述為對(duì)炎癥過(guò)程和免疫改變具有潛在的有益作用[27]；Blautia的豐度被認(rèn)為與人類(lèi)CRC的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[28]；Bifidobacterium是放線菌門(mén)的一個(gè)屬，目前認(rèn)為其在維持腸道功能乃至人體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，在1997年，研究人員就證實(shí)長(zhǎng)雙歧桿菌和乳果糖復(fù)合物可以有效抑制AOM/DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸異常隱窩病灶(ACF)的發(fā)生，提示了雙歧桿菌對(duì)于結(jié)直腸癌的發(fā)生具有一定的預(yù)防作用[29]。

差異物種分析顯示在門(mén)水平上實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異，但在屬水平上對(duì)照組中的Ruminococcus(瘤胃球菌屬)、Alistipes都顯著高于實(shí)驗(yàn)組。有報(bào)告稱(chēng)瘤胃球菌在CRC患者的糞便樣本中有著較高的豐度，被認(rèn)為與CRC的發(fā)生有關(guān)[30]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可顯著降低DMH誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生率，抑制促炎細(xì)胞因子IL-17的分泌，并影響其腸道菌群。恢復(fù)腸道菌群Alpha多樣性，改變2型糖尿病結(jié)直腸癌大鼠腸道菌群構(gòu)成，為二甲雙胍成為臨床2型糖尿病患者結(jié)直腸癌預(yù)防藥物提供了新的理論支持與研究思路。