谷 雨，趙亞然，姜 晶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/設(shè)施園藝省部共建教育部重點實驗室，沈陽 110161）

株高對于植物適應(yīng)不同的環(huán)境至關(guān)重要，是育種過程首要考慮性狀之一。在以矮化與半矮化谷類為基礎(chǔ)的“綠色革命”顯示了株高對于作物產(chǎn)量的重要影響。緊湊型植株可以提高農(nóng)作物的抗倒伏性、增加種植密度，更有效地利用土地資源，并提高產(chǎn)量。同樣，株高也是園藝作物的主要農(nóng)藝性狀之一，尤其在茄果類蔬菜育種中成為了重要的選擇性狀。培育適度矮化和緊湊的茄果類蔬菜新品種也是適應(yīng)城市栽培和輕簡化栽培的育種目標(biāo)。

株高是受多基因控制的數(shù)量性狀，同時受到多種激素，如生長素、油菜素內(nèi)酯、赤霉素和細胞分裂素的調(diào)控。其中，赤霉素(GA)是控制植物莖伸長的主要激素。GA 通過GA 信號通路調(diào)節(jié)細胞伸長，從而引起下胚軸長度或株高的變化。GA-GID1-DELLA 是一個被廣泛接受的信號模塊，可以通過它來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。水稻矮稈1號是赤霉素不敏感突變體，其赤霉素受體(GID1)失活，導(dǎo)致突變體的株高降低；而油菜半矮化突變體DS-3(編碼DELLA 蛋白)中的脯氨酸被替換為亮氨酸，導(dǎo)致DELLA 蛋白不受GA 調(diào)控，使油菜植株半矮化。赤霉素不但可以增加正常植株的節(jié)間長度，還可以促進矮生植株節(jié)間的伸長。日本研究所發(fā)現(xiàn)的水稻“綠色革命”基因SD1可以通過降低酶活來減少赤霉素合成，從而降低株高。水稻中功能缺失性SD1表現(xiàn)為典型的矮化植株，通過外源噴施植物激素等方法，激活其內(nèi)源赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加赤霉素合成能使矮化的植株節(jié)間伸長，株高增加。

番茄成株期的株高主要取決于節(jié)間的數(shù)量和長度。已報道了幾種與番茄株高相關(guān)的突變體，并克隆了一些與番茄表型相關(guān)的基因。其中

self-pruning

(

sp

)突變體,

semideterminate

(

sdt

) 突變體和

suppressor of sp

(

ssp

)突變體是影響節(jié)間數(shù)量，而

brachytic

(

br

)突變體,，

dwarf

(

d

)突變體,

Elongated Internode

(

EI

)突變體，赤霉素缺陷突變體

gib-1

，

gib-2

，

gib-3

，

procera

(pro)，short internode和

internode elongated-1

(

tie-1

)突變體均是影響番茄節(jié)間長度。此外，近年也鑒定出了幾個與株高相關(guān)的數(shù)量性狀位點?？刂品压?jié)間長度基因

qTPH1.1

通過控制細胞的伸長，來影響番茄植株的節(jié)間長度。對266份重測序的番茄核心種質(zhì)第3 穗果實所在節(jié)位的節(jié)間長度進行測定，定位了控制番茄節(jié)間長度的7 個QTL。當(dāng)前對番茄株高的研究多集中在成株期節(jié)間長度、節(jié)間數(shù)量基因的定位與挖掘上，而上、下胚軸長度作為影響株高的重要因素，也是番茄壯苗表型的重要指標(biāo)，但目前缺少對上胚軸長度相關(guān)的分子機制研究。本研究選擇了苗期株高差異顯著的番茄兩個高代自交系JZ34（長節(jié)間）和JZ18（短節(jié)間）作為試驗材料，同時在這兩種番茄上施用GA后，選取上胚軸進行轉(zhuǎn)錄組分析，通過差異基因篩選、GO 富集分析、KEGG 富集分析和關(guān)鍵基因的瞬時表達分析，解析番茄苗期株高形態(tài)建成的分子機制，挖掘番茄株型調(diào)控的新基因，對于解析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及為今后利用基因編輯技術(shù)選育理想株型的番茄種質(zhì)提供一定的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄高代自交系JZ18 和JZ34，JZ18 為短節(jié)間番茄品系，JZ34 為長節(jié)間番茄品系。將種子消毒后置于恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2～3d，出芽后播種于裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液的5×10的穴盤里置于光照培養(yǎng)箱中，晝夜溫差為26℃/20℃，光周期為16h/8h，光照強度為300μmol·m·S，相對空氣濕度60%～80%。

1.2 方法

1.2.1 植物激素處理 選擇長勢一致的JZ18和JZ34各100株分成五組，每組20株JZ18和20株JZ34，待長出第一片真葉時進行植物激素處理，以蒸餾水做對照，其他四組分別用濃度為5×10mol·L的GA(赤霉素)、PAC(多效唑)、BR(油菜素內(nèi)酯)和IAA(生長素)處理，待葉面滴水時停止噴施，連續(xù)噴施7d 后，停止噴施7d，從處理開始記為第1 天，共14d。經(jīng)過處理的JZ18和JZ34植株分別記作JZ18-T和JZ34-T。實驗設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 植物表型鑒定及統(tǒng)計分析 株高：從地面到植株生長最高點的長度，利用直尺測量了第3，5，7，9，11，13，15d 的株高。莖粗：利用游標(biāo)卡尺測量了第 3，5，7，9，11，13，15d 的距離子葉 1cm 處的上胚軸位置的莖粗。下胚軸長度：從地面到子葉的長度，利用游標(biāo)卡尺測量了7d和14d的長度。上胚軸的長度：從子葉到第一片真葉的長度，利用游標(biāo)卡尺測量了7d和14d的長度。去除異常值，計算平均值，利用Excel進行數(shù)據(jù)處理并作圖，用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

1.2.3 石蠟切片 取GA處理7d 和14d 的JZ18、JZ34、JZ18-T、JZ34-T 的上胚軸的莖組織，用甲醛、乙酸和乙醇(FAA)的混合物固定48h，然后轉(zhuǎn)移到乙醇中逐步脫水，制備石蠟切片。切片用甲苯胺藍染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，圖像用成像系統(tǒng)拍攝。并計算7d 和14d 的上胚軸莖組織的橫切細胞數(shù)目和縱切細胞長度。實驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 RNA提取和質(zhì)量檢測 利用 Trizol 分別提取 GA處理 14d 的 JZ18、JZ34、JZ18-T、JZ34-T 上胚軸的總RNA，通過Nanodrop2000進行RNA質(zhì)量和濃度檢測，瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測。

1.2.5 cDNA文庫構(gòu)建及測序 RNA-seq文庫分別由JZ18、JZ34、JZ18-T、JZ34-T各3株等量混勻而成，每份樣品均取3 次生物學(xué)重復(fù)。樣品質(zhì)量檢測合格后，使用Oligo(dT)磁珠富集mRNA。將得到的mRNA 中加入打斷試劑，將mRNA 片段化，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。修復(fù)雙鏈cDNA 未端，并在3′未端加上A 堿基，并對連接產(chǎn)物進行擴增。將連接產(chǎn)物變性為單鏈環(huán)形產(chǎn)物，消化掉未被環(huán)化的線性DNA 分子后，即得到最終的文庫。使用Agilent2100Bioanalyzer 檢測文庫的片段大小及濃度。通過聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（cPAS）進行測序，得到150 bp的測序讀長。

1.2.6 原始數(shù)據(jù)的組裝 對測序所得原始數(shù)據(jù)進過濾。過濾標(biāo)準(zhǔn)為：(1)去除帶接頭(adapter)的reads；(2)當(dāng)任一測序read中N含量超過該read堿基數(shù)的10%時，去除比paired reads；(3)當(dāng)任一測序read中含有的低質(zhì)量(Q≤20)堿基數(shù)超過該條read堿基數(shù)的50%時去除此paired reads。將過濾后數(shù)據(jù)與番茄參考基因組進行比對。

1.2.7 差異表達基因的篩選 利用DESeq2進行樣品組間的差異表達分析，獲得兩個生物學(xué)條件之間的差異表達基因集。差異分析之后，用Benjamini-Hochberg方法對假設(shè)檢驗概率(Pvalue)進行多重假設(shè)檢驗校正，得到錯誤發(fā)現(xiàn)率(FalseDiscoveryRate，F(xiàn)DR)。差異基因的篩選條件為|log2FoldChange|≥1，且FDR＜0.05。

1.2.8 差異表達基因功能注釋分析 將基因的FPKM 進行中心化和標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后做Kmeans 聚類分析。然后對篩選的差異基因進行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 和Gene Ontology (GO) 富集分析。根據(jù)實驗?zāi)康暮Y選差異基因后，富集分析研究差異基因在GeneOntology 中的分布狀況以期闡明實驗中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。GO-Term 顯著性富集分析以GO數(shù)據(jù)庫中GO-Term 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，在差異表達基因中顯著性富集的GO-Term。Pathway 顯著性富集分析以KEGG 數(shù)據(jù)庫中Pathway 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，在差異表達基因中顯著性富集的Pathway。

1.2.9 qRT-PCR驗證 挑選10個與GA3激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因，使用DNAMAN 軟件設(shè)計引物，

Actin

作為內(nèi)參基因，使用cDNA合成試劑盒對各樣品總RNA進行cDNA反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR實時熒光定量試劑盒在熒光定量 PCR 儀上進行 qRT-PCR 驗證，反應(yīng)程序為：（1）預(yù)變性：95℃，3min，循環(huán)1 次；（2）變性：95℃，30s；退火：55℃，30s；延伸：68℃，15s；循環(huán)40次。1.2.10 VIGS載體的構(gòu)建 將之前得到的RNA樣品用HIScriptⅡQRT SuperMix(諾唯贊生物科技有限公司，南京)試劑進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)番茄數(shù)據(jù)庫中

SAUR71

和

XTH23

的CDS 序列設(shè)計特異性引物，本文選取的

SlSAUR71

和

SlXTH23

基因特異性片段長度分別為300bp 和306bp，片段上下游分別加入酶切位點EcoR1 和Sac1。使用Phusion master Mix(2×)高保真酶對目的片段進行擴增后純化。將

SlSAUR71

和

SlXTH23

的擴增純化產(chǎn)物和pTRV2 載體，同時采用限制性內(nèi)切酶

EcoR1

和

Sac1

進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別純化，用T-DNA 連接酶在16℃下反應(yīng)2h 后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，PCR 篩選陽性單克隆進行測序驗證，序列正確的載體即為VIGS 所需的重組沉默載體pTRV2-

SlSAUR71

和pTRV2-

SlXTH23

。分別將含有pTRV1、pTRV2-

SlSAUR71

、pTRV2-

SlXTH23

的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)菌液PCR 驗證后，菌液與甘油1∶1 混合，放置-80℃冰箱備用。1.2.11 VIGS沉默接種方法 挑選飽滿的JZ18 和JZ34 番茄種子各100 粒，分別放入錐形瓶中，加入適量蒸餾水，28℃150r·min的搖床暗培養(yǎng)2～3d，觀察種子的萌發(fā)情況，芽長到0.5～1.0cm時是作為侵染材料的最佳時機。將含有pTRV1、pTRV2-

SlSAUR71

、pTRV2-

SlXTH23

載體的GV3101農(nóng)桿菌液，利用LB液體培養(yǎng)基(50μg·mL卡那霉素，50μg·mL利福平，10mmol·LMES，20μmol·LAS)，28℃，220rpm·min搖床中培養(yǎng)12h。5000r·min，離心5～6min，收集菌液，棄上清液。加入適量侵染液(10mmol·LMES，10mmol·LMgCl，200μmol·LAS，pH 值5.6)重懸菌體，調(diào)整OD值達到1.0。配置好的侵染液菌液在室溫下靜置3～4h 后，將含有pTRV1 載體和含有pTRV2-

SlSAUR71

、pTRV2-

SlXTH23

的農(nóng)桿菌，分別以1/1 比例混勻后即可進行侵染。對JZ18 進行pTRV1 與pTRV2-

SlSAUR71

的混合侵染,記為 JZ18-P，對 JZ34 進行 pTRV1 與 pTRV2-

SlXTH23

的混合侵染,記為 JZ34-P，JZ18和JZ34的對照只做pTRV1的侵染,分別記為CK1和CK2。將侵染液分裝在15mL離心管中，將萌發(fā)的幼芽放在侵染液中，確保芽整體浸泡在侵染液中。將帶有幼芽和侵染液的離心管放置在真空干燥器中并固定，真空泵上設(shè)置最大相對真空度在-80kPa 左右。抽真空并保持30 s，然后迅速拔去連接管釋放真空，完成侵染過程。將侵染芽定值于裝有1/2 Hoagland 營養(yǎng)液的5×10 的穴盤中放置于組培室，晝夜溫差為26℃/20℃，光周期為16h/8h(光/暗)，光照強度為300μmol·m·S，相對空氣濕度60%～80%。1.2.12 沉默效率檢測 在侵染苗待長出3葉1心時，選取表型顯著的JZ18和JZ34各10株，對照各3株，進行實時定量PCR 驗證。與對照CK1 相比，挑選JZ18-P 番茄植株中

SlSAUR71

的表達量小于0.5，即沉默效率大于50%，獲得

SlSAUR71

的沉默植株；與對照CK2相比，同樣挑選JZ34-P番茄植株中

SlXTH23

的表達量小于0.5，即沉默效率大于50%，獲得

SlXTH23

的沉默植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物激素處理對番茄苗期株高的影響

選取株高差異顯著的兩個高代自交系JZ18和JZ34作為試驗材料。JZ18的下胚軸和上胚軸的長度都較短，JZ34的下胚軸和上胚軸的長度都較長（圖1 A）。為了研究植物激素對節(jié)間長度的影響，待JZ18和JZ34長出第1片真葉時用濃度為5×10mol·L的赤霉素(GA)、多效唑(赤霉素抑制劑，PAC)、油菜素內(nèi)酯(BR)和生長素(IAA)進行了外源噴施，連續(xù)噴施一周后停止噴施一周。分別測量了JZ18和JZ34第14天的下胚軸、上胚軸和株高(圖1B、1C、1D)，經(jīng)過 GA、BR 和 IAA 處理后均變長，PAC 處理后均變短。不同的是，雖然這兩種番茄品系在 BR 和IAA處理后的表型均有差異，但仍表現(xiàn)出和對照的一致性，JZ34仍高于JZ18；而經(jīng)過GA和PAC處理后，兩者之間的上胚軸和株高無顯著差異。

由于GA處理后的JZ18和JZ34與其他激素處理后的JZ18和JZ34表現(xiàn)出差異性，所以重點測量了經(jīng)過GA處理后的JZ18和JZ34的3，5，7，9，11，13，15d的株高和莖粗，并繪制生長動態(tài)曲線。7d和14d作為重要的時間節(jié)點，分別測量了下胚軸和上胚軸的長度。GA處理7d 時，JZ18-T 和JZ34-T 的上胚軸和下胚軸相比于對照均變長，但仍表現(xiàn)出與對照的一致性，即 JZ34-T 比 JZ18-T 長(圖 2A，圖 2C)；14d 時，JZ34-T 的下胚軸比 JZ18-T 的長，但兩者之間的上胚軸已無顯著差異(圖2B，圖2D)。在苗期，隨著時間的遞增，JZ18-T和JZ34-T的生長速度明顯變快，從4d開始JZ18-T 的株高和JZ34-T 分別與對照JZ18和JZ34之間呈現(xiàn)出明顯差異，即JZ18-T 的株高始終高于JZ18，JZ34-T的株高始終高于JZ34；在14 d時，JZ18-T和JZ34-T兩者之間無顯著差異，但作為對照的JZ18 和 JZ34 之間仍存在顯著差異(圖 2E)；從 GA處理開始到 11d，無論是 JZ18-T 和 JZ34-T 還是 JZ18 和 JZ34 之間莖粗無明顯差異，11d 之后，JZ18 的莖粗比 JZ34 的粗，JZ18-T 和 JZ34-T 的莖粗變細，并在 15d 時 JZ18-T 和JZ34-T兩者之間莖粗無明顯差異(圖2F)。

2.2 莖部細胞形態(tài)學(xué)觀察

為了研究莖部節(jié)間差異的成因，對赤霉素處理7d和14d的上胚軸進行了縱切和橫切的薄片分析。研究發(fā)現(xiàn)，7d 時，JZ18-T 和 JZ34-T 的細胞數(shù)量相比于對照顯著減少，細胞長度顯著增長(圖 3C，圖 3D)；14d 時，JZ18-T相比于JZ18的細胞數(shù)量顯著增加，但JZ34-T 相比于JZ34的細胞數(shù)量顯著減少(圖3A，圖3C)，JZ18-T 和JZ34-T的細胞長度與對照相比顯著增長，并且JZ18-T和JZ34-T兩者之間的細胞長度無顯著差異(圖3B，圖3D)。這些結(jié)果表明，經(jīng)過GA處理后，JZ18-T和JZ34-T兩番茄品系節(jié)間增長是由于細胞伸長所導(dǎo)致的，并且兩者之間的細胞長度隨處理時間延長無顯著差異，導(dǎo)致了JZ18-T和JZ34-T的株高逐漸趨于一致。

圖3 莖部細胞形態(tài)學(xué)觀察Figure 3 Observation of stem cell morphology

2.3 測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量評估分析

構(gòu)建了JZ18、JZ34、JZ18-T、JZ34-T 上胚軸莖組織的轉(zhuǎn)錄組文庫。原始測序數(shù)據(jù)(Raw reads)平均值為51041714，原始數(shù)據(jù)過濾后，獲得的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)(Clean reads)平均值為46651698，樣品Q20 平均值為94.55%，樣品Q30 平均值88.28%,GC 含量平均值為42.87%，說明測序質(zhì)量較高且符合要求，可進行下一步數(shù)據(jù)分析(表 1)。

表1 樣品測序后Reads質(zhì)量分析
Table 1 Reads quality analysis after sample sequencing

樣品名Sample 18-1 18-2 18-3 18-T1 18-T2 18-T3 34-1 34-2 34-3 34-T1 34-T2 34-T3原始數(shù)據(jù)Reads數(shù)Raw Reads 52801588 52242978 54210110 60803154 49591738 54237020 49928284 47106934 47948048 50669672 43322262 49638784高質(zhì)量Reads數(shù)Clean Reads 48752336 48158436 49089702 52838006 45914858 49726354 45891392 43982232 43311718 46548868 40131292 45475182高質(zhì)量堿基Clean base(G)7.31 7.22 7.36 7.93 6.89 7.46 6.88 6.60 6.50 6.98 6.02 6.82錯誤率/%Error rate 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04值不低于20百分比Q20/%Qphred 94.34 94.31 94.42 94.52 94.55 94.65 94.94 94.10 94.70 94.64 94.79 94.61值不低于30百分比Q30/%Qphred 87.91 87.82 88.03 88.27 88.26 88.46 89.04 87.42 88.58 88.46 88.73 88.39 GC含量/%GC content 43.03 43.00 43.05 42.91 42.64 42.70 42.84 43.05 42.95 42.80 42.78 42.70

在12 個樣本中將得到的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)與參考基因組進行比對，比對到參考基因組reads 數(shù)占比率為91.88%～93.65%，在參考基因組上有唯一比對位置的reads數(shù)目為90.04%～91.70%，在參考基因組上有多重比對位置的reads 數(shù)目為1.84%～2.01%，比對上參考基因組正鏈的reads 數(shù)目為44.63%～45.55%，比對上參考基因組負鏈的reads數(shù)目為45.40%～46.15%，比對結(jié)果表明，12個樣本的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對效率較高，保證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的真實準(zhǔn)確性(表2)。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組比對效率統(tǒng)計
Table 2 Statistics of comparison efficiency between transcriptome data and reference genome

樣本名Sample總reads 數(shù)Total reads比對基因組正鏈reads 數(shù)′+′mapped比對基因組負鏈 reads 數(shù)′-′mapped JZ18-1 JZ18-2 JZ18-3 JZ18-T1 JZ18-T2 JZ18-T3 JZ34-1 JZ34-2 JZ34-3 JZ34-T1 JZ34-T2 JZ34-T3 48752336 48158436 49089702 52838006 45914858 49726354 45891392 43982232 43311718 46548868 40131292 45475182比對到參考基因組reads 數(shù)Reads mapped 44987789 44468431 45403096 48884222 42717170 46366032 42975185 40410407 40077699 43213017 37512458 42333187唯一比對上參考基因組的reads 數(shù)Unique mapped 44081047 43570616 44493048 47859271 41839565 45399377 42080918 39601423 39247420 42298270 36707348 41444956多重比對上參考基因組的reads 數(shù)Multi mapped 1302433 1284991 1315371 1480647 1259111 1404563 1293146 1143947 1197803 1350151 1195474 1319075 read1比對上的數(shù)目Read1 mapped 22994456 22649917 23108922 24829981 21592574 23403227 21616676 20720062 20210586 21830911 18853002 21392777 read2比對上的數(shù)目Read2 mapped 21086591 20920699 21384126 23029290 20246991 21996150 20464242 18881361 19036834 20467359 17854346 20052179 21860845 21602427 22065551 23734415 20763561 22532346 20901296 19631462 19480630 20997773 18227089 20570077 22220202 21968189 22427497 24124856 21076004 22867031 21179622 19969961 19766790 21300497 18480259 20874879

2.4 轉(zhuǎn)錄組qRT-PCR驗證

為了進一步驗證12組樣品的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇了10個與GA激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因進行了qRT-PCR 驗證試驗。通過qRT-PCR 對這10個基因的表達量進行了分析，可以看到其表達量趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果保持一致，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的真實可靠性（圖4）。

圖4 與GA3激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的qRT-PCR驗證Figure 4 qRT PCR verification of genes related to GA3 hormone signal transduction

2.5 差異基因篩選

首先將基因的FPKM 進行中心化和標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后做Kmeans 聚類分析。根據(jù)變化趨勢篩選出前3 組，從中可以看出，經(jīng)過GA3 處理后的，Sub Class1 中有640 個基因表達存在差異，Sub Class2 中有290 個基因表達存在差異，均表現(xiàn)為在JZ18-T 中下調(diào)，在JZ34-T 中上調(diào)；Sub Class3 中有487 個基因表達存在差異，表現(xiàn)為在JZ18-T 中上調(diào)，在JZ34-T 中下調(diào)(圖5)。結(jié)合韋恩圖，可以看到在4 組比較中均存在差異表達的基因有229 個(圖 6)。

圖5 Kmeans聚類分析Figure 5 Kmeans cluster analysis

圖6 各組差異表達基因韋恩圖Figure 6 Venn of DEGs in each group

2.6 差異表達基因GO富集分析

對各比較組間進行GO 富集分析，主要分為三大類：生物學(xué)過程、細胞組分和分子功能。本研究僅針對生物學(xué)過程做進一步的研究，發(fā)現(xiàn)在4個比較組中，在激素生物合成過程、激素代謝過程和細胞分裂過程都有顯著的功能富集(圖7)。這表明經(jīng)過GA處理后，會通過影響植物激素合成、代謝過程以及細胞分裂來調(diào)節(jié)節(jié)間伸長。

圖7 GO富集分析Figure 7 GO enrichment analysis

2.7 KEGG通路分析

生物體內(nèi)的不同基因產(chǎn)物通過相互作用行使生物學(xué)功能，對差異表達基因通路注釋分析有助于進一步解讀基因的功能。本研究通過對各比較組間的差異基因進行了KEGG pathway 功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：差異表達基因在JZ18 VS JZ18-T、JZ34 VS JZ34-T、JZ18 VS JZ34 和JZ18-T VS JZ34-T 比較組內(nèi)都顯著富集在了植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上(圖8)，這表明通過GA處理后的番茄節(jié)間伸長與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有著密切的關(guān)系。為了明確植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對番茄節(jié)間伸長過程的影響，通過4個比較組之間的對比發(fā)現(xiàn)差異基因主要集中在生長素通路和油菜素內(nèi)酯通路上，之后針對這兩類激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路內(nèi)的差異表達基因展開進一步的分析。

圖8 4個比較組中KEGG功能富集分析Figure 8 The main position of KEGG function enrichment in the four comparison groups

2.8 番茄節(jié)間長度相關(guān)基因的挖掘

通過4 個比較組之間的對比，發(fā)現(xiàn)差異基因主要存在于生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和油菜素內(nèi)酯信號通路上。在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，生長素通過生長素輸入載體AUX1 進入細胞后與E3 泛素連接酶TIR1 結(jié)合并使其活化，活化后的TIR1 與ARF-AUX/IAA 異源二聚體中的Aux/IAAs 結(jié)合，形成TIR1-AUX/IAA 復(fù)合體，進而引起AUX/IAA 蛋白的泛素化降解，使ARF 從異源二聚體中脫落下來，脫離AUX/IAA 的ARF 被活化，誘導(dǎo)下游基因SAUR 表達，從而促使細胞伸長和植株生長(圖9)。在4個比較組之間進行差異表達基因的分析，發(fā)現(xiàn)

SlSAUR71

在JZ18 VS JZ18-T中表達量下降，在JZ34 VS JZ34-T中表達量上調(diào)，在JZ18 VS JZ34中表達量下降，在JZ18-T VS JZ34-T中表達量上調(diào)，結(jié)果表明經(jīng)過GA3處理后的JZ18-T 和JZ34-T與未處理的表達量形成明顯差異。所以，篩選出SlSAUR71作為候選基因，其功能注釋見表3。

表3 節(jié)間長度相關(guān)基因篩選
Table 3 Screening of genes related to internode length

基因ID Gene ID JZ18 VS JZ18-T JZ34 VS JZ34-T JZ18 VS JZ34JZ18-T VS JZ34-T 功能Function SlSAUR71下調(diào)Down上調(diào)Up下調(diào)Down上調(diào)Up SlXTH23上調(diào)Up下調(diào)Down上調(diào)Up下調(diào)Down生長素上調(diào)RNA71(生長素信號途徑響應(yīng)因子)Auxin upregulates RNA71 (Auxin signaling pathway response factor)木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶23 (油菜素內(nèi)酯信號途徑響應(yīng)因子)Xyloglucan endoglycosidase/hydrolase 23(Brassinolactone signaling pathway response factor)

在油菜素內(nèi)酯信號通路中，BR 與受體BRI1 結(jié)合并激活BRI1，BAK1 作為BRI1 的共受體與激活后的BRI1互作并相互磷酸化，將BR 信號傳遞到細胞內(nèi)。BSU1 磷酸酶與BR 的負調(diào)控因子BIN2 結(jié)合，使BIN2 去磷酸化導(dǎo)致其降解，從而解除BIN2對BZR1的抑制作用，誘導(dǎo)下游基因TCH4表達(TCH4包括XTH23)，從而促使細胞伸長(圖9)。在4個比較組之間進行差異表達基因的分析，發(fā)現(xiàn)SlXTH23在JZ18 VS JZ18-T中表達量上調(diào)，在JZ34 VS JZ34-T 中表達量下降，在JZ18 VS JZ34 中表達量上調(diào)，在JZ18-T VS JZ34-T 中表達量下降，結(jié)果表明經(jīng)過GA3處理后的JZ18-T 和JZ34-T 與未處理的表達量形成明顯差異。所以，篩選出

SlXTH23

，其功能注釋見表3。

圖9 4個比較組的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Figure 9 Phytohormone signal transduction pathway in four comparison groups

2.9 候選基因表達分析

對候選基因

SlSAUR71

和

SlXTH23

進行了實時熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過GA處理后，

SlSAUR71

在JZ18-T中表達量下降，但在JZ34-T中表達量上升；

SlXTH23

在JZ18-T中表達量上升，但在JZ34-T中表達量下降。所以，推測

SlSAUR71

對節(jié)間伸長起到負向調(diào)控的作用，即

SlSAUR71

低表達或者不表達會促進莖的生長；

SlXTH23

對節(jié)間伸長起到促進作用，即

SlXTH23

高表達會促進莖的生長。為了驗證猜想的準(zhǔn)確性，選取

SlSAUR71

和

SlXTH23

的CDS 序列作為特異性片段，設(shè)計帶有酶切位點

EcoR1

和

Sac1

的特異性引物并擴增特異性片段。擴增的

SlSAUR71

片段長度為300bp，擴增的

SlXTH23

片段長度為306bp。將得到的擴增片段和VIGS 沉默載體pTRV2 經(jīng)

EcoR1

和

Sac1

酶切后連接在一起，得到目的片段。將所得目的片段轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α 后，進行PCR 驗證。選取與預(yù)期一致的單一條帶所對應(yīng)的菌液送測序，將測序結(jié)果與目的片段達到99%以上重合的菌液提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌GV3101 中，進行PCR 驗證，得到一條介于250～500bp 之間的單一條帶(圖11)，與預(yù)期相符，證明載體pTRV2-

SlSAUR71

和pTRV2-

SlXTH23

均構(gòu)建成功。

圖10 候選基因SlSAUR71和SlXTH23表達量分析Figure 10 Expression analysis of the candidate genes SlSAUR71 and SlXTH23 by qRT-PCR

圖11 重組載體pTRV2-SlSAUR71和pTRV2-SlXTH23的菌液PCR驗證Figure 11 PCR verification of recombinant vector pTRV2-SlSAUR71 and pTRV2-SlXTH23

在種子時期，對短節(jié)間材料JZ18 進行pTRV1 與pTRV2-

SlSAUR71

的混合侵染，對長節(jié)間材料JZ34進行pTRV1 與 pTRV2-

SlXTH23

的混合侵染，JZ18 和 JZ34 的對照只做pTRV1 的侵染。預(yù)計在JZ18 上沉默基因

Sl-

SAUR71 會表現(xiàn)出節(jié)間伸長，JZ34 上沉默基因

SlXTH23

會表現(xiàn)出節(jié)間變短。在待長出3 葉1 心時，選取表型顯著的 JZ18 和 JZ34 各 10 株，對照各 3 株，進行實時定量PCR 驗證。與對照相比，得到

SlSAUR71

和

SlXTH23

的相對表達量小于0.5，沉默效率大于50%的植株各3 株，成功獲得

SlSAUR71

和

SlXTH23

的沉默植株(圖 12 和圖13)。結(jié)果顯示，

SlSAUR71

和

SlXTH23

的沉默植株表型與預(yù)期一致，與對照短節(jié)間的JZ18 相比，沉默

Sl-SAUR71

基因會使其上胚軸變長；與對照長節(jié)間的JZ34相比，沉默

SlXTH23

基因會使其上胚軸變短。

圖12 沉默植株表型Figure 12 Phenotype of silencing plants

圖13 沉默植株中SlSAUR71和SlXTH23的相對表達量Figure 13 Relative expression levels of SlSAUR71 and SlXTH23 in silencing plants

3 討論與結(jié)論

本研究選取株高差異顯著的兩個高代自交系JZ18 和JZ34 作為試驗材料進行外源GA處理轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)四個比較組共有的DEGs 有229 個。并且這些DEGs 主要與生物過程相關(guān)，顯著富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，進一步篩選出了兩個與節(jié)間伸長有關(guān)的候選基因分別為生長素信號通路關(guān)鍵基因

SlSAUR71

和油菜素內(nèi)酯信號通路關(guān)鍵基因

SlXTH23

。在擬南芥中約70%的

SAUR

基因?qū)ιL素有反應(yīng)，可能受ARF-BZR-PIF 復(fù)合體的調(diào)控。核定位的SAUR32抑制細胞伸長，對生長素不敏感，可能與細胞分裂素等其他因素的誘導(dǎo)有關(guān)。SAUR51 在分生組織細胞中表達，也對生長素不敏感，但在細胞分裂素的作用下會上調(diào)。在擬南芥SAUR41亞家族(

SAUR41

、

SAUR40

、SAUR71和

SAUR72

)的研究中發(fā)現(xiàn)，

SAUR71

在幼根和下胚軸的中柱中表達，

SAUR41

亞家族基因的組織特異性和發(fā)育調(diào)控的表達模式暗示

SAUR

轉(zhuǎn)錄本或SAUR蛋白可能作為信號分子，以確保細胞增殖和細胞擴張的協(xié)調(diào)。本研究中，在JZ18中沉默

SlSAUR71

后，JZ18的下胚軸、上胚軸和株高明顯增長。所以

SlSAUR71

低表達可能會促進細胞擴張，從而使節(jié)間伸長。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)了外源GA 處理后油菜素內(nèi)酯信號通路的關(guān)鍵基因

SlXTH23

。已有報道，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶(XTHs)是一種細胞壁修飾酶，具有催化木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(XET)和木葡聚糖水解酶(XEH)的雙重功能。它能匹配到3～4 個不同的系統(tǒng)發(fā)育亞群中，一個亞家族的成員可能具有共同的生理功能或表達譜，在番茄和擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)

SlXTH23

、

SlXTH1

、

AtXTH10

等屬于同一亞家族基因。研究發(fā)現(xiàn)，在番茄中，SlXTH1在果實發(fā)育過程中的主要作用可能是在果實生長過程中的細胞擴張；在白化的番茄中

SlXTH1

在下胚軸伸長區(qū)表皮和外皮層細胞中表達，而且在生長素的作用下能夠促進該基因在胚軸部分的表達；擬南芥

AtXTH10

過表達則能促進根細胞的伸長。另外，隨著前人研究的深入，發(fā)現(xiàn)XTH 通過影響細胞壁松弛和伸展，從而促進植株細胞或組織伸長。研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素能誘導(dǎo)豌豆節(jié)間、生菜和黃瓜下胚軸以及大麥葉片伸長，同時XET活性也隨之增加；

AtXTH21

基因在GA處理下表達上調(diào)，

AtXTH21

缺失突變體表現(xiàn)出明顯的矮化表型；在白菜中

BcXTH1

，與擬南芥第1組基因中的

XTH9

同源性最高，

BcXTH1

基因在擬南芥中的過表達促進了莖的伸長，表明

BcXTH1

基因參與了細胞的擴張和伸長。本研究發(fā)現(xiàn)，在JZ34 中沉默

SlXTH23

后，JZ34的下胚軸、上胚軸和株高明顯變短。所以

SlXTH23

高表達會促進細胞伸長，從而使節(jié)間伸長。本試驗選用的番茄在外源GA的誘導(dǎo)下，通過對植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而使上胚軸節(jié)間伸長或變短。