張曉春，魯春華

醴腸化學(xué)成分及其抗沙門菌T3SS的活性成分研究

張曉春，魯春華*

山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，山東大學(xué)藥學(xué)院 天然藥物化學(xué)研究所，山東 濟(jì)南 250012

研究醴腸的化學(xué)成分及其抗沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）活性。綜合運(yùn)用Sephadex LH-20凝膠、正相硅膠、HPLC、中壓反相等柱色譜方法進(jìn)行分離純化，MS、NMR、UV、IR等技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，采用SDS-PAGE法檢測(cè)化合物1～18抗沙門菌T3SS毒力蛋白分泌活性。從醴腸全草提取物中分離到18個(gè)化合物，分別鑒定為香豌豆酚（1）、3′--甲基香豌豆酚（2）、蟛蜞菊內(nèi)酯（3）、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯（4）、木犀草素（5）、5′-(4-羥基-1-丁炔-1-基)[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-醛（6）、α-三聯(lián)噻吩（7）、α-三聯(lián)噻吩甲醛（8）、α-三聯(lián)噻吩甲醇（9）、5-甲氧亞甲基-2,2′:5′,2′′-三聯(lián)噻吩（10）、5-羥甲基-(2,2′:5′,2′′)-三聯(lián)噻吩乙酯（11）、[2,2′:5′,2′′-三聯(lián)噻吩]-5-基甲基-2-甲基丁酯（12）、5-羥甲基-(2,2′:5′,2′′)-噻吩當(dāng)歸酸酯（13）、5-羥甲基-(2,2′:5′,2′′)-噻吩巴豆酸酯（14）、()-[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯（15）、()-5′-(3-丁烯-1-炔基)-[2,2′-噻吩]-5-甲醇-2-甲基巴豆酸酯（16）、5′-(3-丁烯-1-炔-1-基)-[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-甲醇-5-乙酯（17）和5′-羥甲基-5-(3-丁烯-1-炔基)-2,2′-聯(lián)噻吩（18）?；衔?、15、16首次從植物醴腸中分離得到?；衔?具有較強(qiáng)的沙門菌T3SS毒力蛋白分泌抑制活性，化合物1、3、4具有一定的抗T3SS活性，為醴腸民間用作排膿、止血、治熱痢以及抗菌抗感染藥物提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

醴腸；抗沙門菌T3SS活性；抗毒力藥物；噻吩；黃酮；5′-(4-羥基-1-丁炔-1-基)[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-醛；()-[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯；木犀草素

抗毒力療法是治療感染的一種新策略，在不影響細(xì)菌生長的情況下，干擾并抑制病原菌的毒力因子，降低其致病性。這些毒力因子主要參與細(xì)菌定殖、黏附，突破機(jī)體防御屏障，在宿主細(xì)胞內(nèi)生存、增殖、擴(kuò)散。當(dāng)前抗毒力藥物研究方向主要包括阻止細(xì)菌生物被膜形成，阻止細(xì)菌黏附，抑制分泌系統(tǒng)合成、組裝等[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)9種細(xì)菌分泌系統(tǒng)，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）是包括沙門菌在內(nèi)的許多革蘭陰性致病菌最重要的毒力系統(tǒng)，成為抗毒力藥物重要的靶標(biāo)[3]。因此，T3SS抑制劑的發(fā)現(xiàn)已成為治療感染的一種新途徑，在耐藥性方面具有比傳統(tǒng)抗生素更大的優(yōu)勢(shì)[4]。藥用植物具備來源廣、化學(xué)成分多樣、方便易得等多種優(yōu)勢(shì)，為抗毒力藥物的發(fā)現(xiàn)提供了天然寶庫，是T3SS抑制劑的重要來源[5]。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)唇形科植物百里香中分離得到的百里香酚能夠抑制沙門菌對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲，保護(hù)小鼠免受沙門菌感染，是一種潛在的T3SS抑制劑；Vikram等[7]對(duì)柑橘中的柚皮素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)能夠抑制沙門菌毒力島SPI-1，顯著降低沙門菌毒力和致病性。從藥用植物中篩選抗沙門菌T3SS活性成分，已被證實(shí)是一種有效的治療感染、對(duì)抗細(xì)菌耐藥的方法。

本課題組前期對(duì)50種緬甸蔬菜進(jìn)行了抗毒力活性篩選，發(fā)現(xiàn)醴腸全草提取物能夠顯著地抑制沙門菌T3SS毒力蛋白的分泌，是抗毒力藥物發(fā)現(xiàn)的潛在資源，值得深入研究。醴腸L.是菊科醴腸屬植物，一年生草本，又名墨旱蓮。分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國廣泛分布，是一種常見中草藥[8]。已有研究表明，醴腸提取物及化合物具有排膿、止血、治熱痢以及抗菌抗感染等功效[9-11]。為深入研究醴腸中通過抗毒力而抗感染抗菌的活性成分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)醴腸全草提取物進(jìn)行了成分的分離，共得到18個(gè)化合物，分別鑒定為香豌豆酚（orobol，1）、3′--甲基香豌豆酚（3′--methyl orobol，2）、蟛蜞菊內(nèi)酯（wedelolactone，3）、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯（isodemethyl wedelolactone，4）、木犀草素（luteolin，5）、5′-(4-羥基-1-丁炔-1-基)[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-醛（5′-(4-hydroxy-1-butyn-1-yl)[2,2′- bithiophene]-5-carboxaldehyde，6）、α-三聯(lián)噻吩（α-terthienyl，7）、α-三聯(lián)噻吩甲醛（α-formyl- terthienyl，8）、α-三聯(lián)噻吩甲醇（α-terthienyl methanol，9）、5-甲氧亞甲基-2,2′:5′,2′′-三聯(lián)噻吩 [5- (methoxymethyl)-(2,2′:5′,2′′)-terthiophene，10]、5-羥甲基-(2,2′:5′,2′′)-三聯(lián)噻吩乙酯 [5-hydroxymethyl- (2,2′:5′,2′′)-terthienyl acetate，11]、[(2,2′:5′,2′′)-三聯(lián)噻吩]-5-基甲基-2-甲基丁酯（[(2,2′:5′,2′′)-terthiophen]- 5-ylmethyl 2-methylbutanoate，12）、5-羥甲基- (2,2′:5′,2′′)-噻吩當(dāng)歸酸酯[5-hydroxymethyl- (2,2′:5′,2′′)-terthienyl angelate，13]、5-羥甲基- (2,2′:5′,2′′)-噻吩巴豆酸酯[5-hydroxymethyl- (2,2′:5′,2′′)-terthienyl tiglate，14]、()-[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯（(Z)-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol- 2-methylcrotonate，15）、()-5′-(3-丁烯-1-炔基)-[2,2′-噻吩-5-甲醇-2-甲基巴豆酸酯（()-5′-(3-buten-1- ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-2-methylcrotonate，16）、5′-(3-丁烯-1-炔-1-基)-[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-甲醇-5-乙酯（5′-(3-buten-1-yn-1-yl)-[2,2′-bithiophene]-5- methanol-5-acetate，17）和5′-羥甲基-5-(3-丁烯-1-炔基)-2,2′-聯(lián)噻吩[5′-hydroxymethyl-5-(3-buten-1- ynyl)-2,2′-bithiophene，18]，其中化合物6、15、16首次從植物醴腸中分離得到；抗毒力活性篩選發(fā)現(xiàn)化合物1、3、4和5具有抑制沙門菌T3SS毒力蛋白分泌的活性，其中化合物5表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗毒力活性。

1 儀器與材料

400 MHz、600 MHz核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；分析型高效液相色譜儀（美國Agilent科技公司）；制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；中壓液相色譜儀（瑞士 BUCHI公司）；BSA-2245W型電子天平（德國Sartorius公司）；TU-1810型紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；氘代試劑（上海新鉑化學(xué)有限公司）；色譜級(jí)乙腈、甲醇（廣州艾欣科技有限公司）；薄層色譜硅膠板（煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）；葡聚糖凝膠（GE Healthcare公司）；三氯乙酸（TCA，Aladdin公司）；cytosporone B（CsnB，上海畢得醫(yī)藥公司，CAS 321661-62-5；產(chǎn)品編碼 BP4078）；反相硅膠（德國Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用分析純?nèi)軇ㄌ旖蚋挥钤噭┕荆?；ESI-MS質(zhì)譜儀（美國Finnigan公司）。

供試菌株：減毒鼠傷寒沙門菌（UK-1χ8956）由美國亞利桑那州立大學(xué)惠贈(zèng)，?80 ℃保存于本實(shí)驗(yàn)室。

藥材采集自山東省鄆城縣城南，由中國科學(xué)院昆明植物研究所楊雪飛研究員鑒定為醴腸L. 全草。

2 方法

2.1 提取與分離

取干燥醴腸全草1.0 kg，粉碎后用95%乙醇水提取液浸泡，提取3次，合并提取液，35 ℃減壓濃縮至干得到乙醇粗提物。用95%甲醇水溶液200 mL溶解粗提物后，加入100 mL石油醚進(jìn)行萃取，共萃取4～5次，合并萃取液，35 ℃減壓濃縮至干，得到石油醚萃取物和甲醇萃取物。甲醇萃取物用醋酸乙酯-水（1∶1）萃取3～4次，35 ℃減壓濃縮至干得到醋酸乙酯萃取物和水萃取物。

醋酸乙酯萃取物（13.5 g）經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜分離，甲醇洗脫，合并洗脫液得Fr. A～D。Fr. B（2.65 g）先后經(jīng)正相硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜分離共得到7個(gè)組分Fr. B1～B7。Fr. B5（100.7 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜以石油醚-醋酸乙酯（20∶1→0∶1）進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜（TLC）檢測(cè)結(jié)果，合并洗脫液得到化合物4（4.5 mg）。Fr. B6（38.4 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→10∶1）梯度洗脫，得到化合物6（1.9 mg）；Fr. B7（11.5 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（50∶1→5∶1）分離得到化合物3（4.5 mg）。

組分Fr. D（2.25 g）再次進(jìn)行葡聚糖凝膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（1∶2）洗脫，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果得到Fr. D1～D3。Fr. D1（559.3 mg）經(jīng)中壓反相柱（RP-18）色譜分離，以10%～100%乙腈梯度洗脫共得到3個(gè)組分Fr. D1-1～D1-3。Fr. D1-2（56.8 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜以石油醚-醋酸乙酯（20∶1→0∶1）進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)TLC檢測(cè)合并相同組分，得到化合物1（4.7 mg）、5（12.4 mg）。Fr. D3（112.6 mg）經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜（甲醇）分離，合并相同流分共得到3個(gè)組分Fr. D3-1～D3-3，F(xiàn)r. D3-2（28.5 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（10∶1）梯度洗脫，得到化合物2（3.6 mg）。

取石油醚萃取物（8.8 g）經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（1∶2）洗脫，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果，合并為Fr. 1～3。Fr. 2（3.0 g）經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲烷（1∶2）洗脫，合并為Fr. 2A～2E。Fr. 2C（67.7 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜以石油醚-丙酮（100∶1→10∶1）梯度洗脫，得到Fr. 2C1～2C4 共4個(gè)組分。Fr. 2C3（60.3 mg）經(jīng)半制備型HPLC [乙腈-水（85∶15），4 mL/min] 分離，得到化合物13（3.3 mg，R= 13.2 min）、14（4.5 mg，R= 12.7 min）、18（2.3 mg，R= 15.1 min）、11（3.2 mg，R= 8.1 min）和10（1.5 mg，R= 8.8 min）。Fr. 2D（278.4 mg）經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶2）洗脫，得9個(gè)組分，即Fr. 2D1～2D9。Fr. 2D7（23.5 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜以石油醚-醋酸乙酯（1∶0→10∶1）洗脫，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果，得到化合物8（2.3 mg）。Fr. 2D8（32.3 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜以石油醚-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）洗脫，合并得化合物7（4.6 mg）和9（3.5 mg）。

Fr. 3（556.9 mg）經(jīng)正相硅膠柱色譜以石油醚-醋酸乙酯（100∶1→10∶1）梯度洗脫，得Fr. 3A～3C。Fr. 3B經(jīng)半制備型HPLC [乙腈-水（80∶20），4 mL/min] 分離，得化合物17（3.3 mg，R= 6.1 min）、15（3.2 mg，R= 12.3 min）、16（1.9 mg，R= 13.5 min）和12（2.2 mg，R= 15.6 min）。

2.2 活性篩選[12]

利用溫度變化誘導(dǎo)鼠傷寒沙門菌T3SS毒力蛋白SipA、B、C、D分泌，以TCA-丙酮（?20 ℃保存）沉淀毒力蛋白，將蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，篩選能夠抑制毒力蛋白分泌的化合物。具體方法：將28 ℃過夜培養(yǎng)的UK-1χ8956用添加-阿拉伯糖（0.2%）的LB培養(yǎng)基稀釋100倍，加入樣品（終濃度為100 μmol/L）后，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)5～6 h，以加入DMSO組作為對(duì)照組，加入CsnB的作為陽性對(duì)照組。在4 ℃離心后從上清液中獲得分泌蛋白，加入100%TCA在冰上放置30 min使蛋白沉淀，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，控干TCA后，加入400 μL冰丙酮洗滌。在12 000 r/min離心15 min，倒掉上清，待丙酮揮干后加入20 μL的1×loading buffer，在95 ℃恒溫加熱5 min使蛋白變性，取蛋白樣品8 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末；ESI-MS287.2 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為286；分子式為C15H10O6；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.02 (1H, s, H-2), 7.02 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2′), 6.86 (1H, dd,= 8.2, 1.8 Hz, H-6′), 6.83 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.33 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 180.8 (C-4), 164.5 (C-7), 163.5 (C-5), 158.3 (C-9), 153.4 (C-2), 145.4 (C-4′), 144.8 (C-3′), 123.4 (C-3), 122.4 (C-1′), 120.3 (C-6′), 116.0 (C-2′), 114.9 (C-5′), 104.9 (C-10), 98.7 (C-6), 93.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物1為香豌豆酚。

化合物2：黃色粉末；ESI-MS301.4 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為300；分子式為C16H12O6；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.11 (1H, s, H-2), 7.18 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′), 7.0 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.88 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 6.37 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.25 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 3.91 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 180.8 (C-4), 164.9 (C-7), 162.1 (C-5), 158.3 (C-9), 153.6 (C-2), 147.4 (C-3′), 146.5 (C-4′), 123.3 (C-3), 122.4 (C-1′), 121.5 (C-6′), 114.8 (C-5′), 112.6 (C-2′), 104.8 (C-10), 98.8 (C-6), 93.4 (C-8), 55.1 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物2為3′--甲基香豌豆酚。

化合物3：黃色粉末；ESI-MS315.3 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為314；分子式為C16H10O7；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.14 (1H, s, H-10), 7.59 (1H, s, H-13), 6.67 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 6.65 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 3.72 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 166.4 (C-7), 161.5 (C-1), 159.4 (C-9), 156.8 (C-5), 156.8 (C-3), 150.8 (C-15), 147.7 (C-11), 146.7 (C-12), 115.8 (C-14), 106.5 (C-10), 103.6 (C-2), 100.1 (C-13), 99.0 (C-8), 98.9 (C-4), 92.4 (C-6), 55.9 (7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物3為蟛蜞菊內(nèi)酯。

化合物4：黃色粉末；ESI-MS301.3 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為300；分子式為C15H8O7；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.15 (1H, s, H-10), 7.60 (1H, s, H-13), 6.69 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.68 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 163.4 (C-7), 160.5 (C-1), 159.3 (C-9), 156.8 (C-3), 156.7 (C-5), 150.8 (C-15), 147.7 (C-11), 146.6 (C-12), 115.8 (C-14), 106.6 (C-10), 103.6 (C-2), 100.0 (C-13), 99.4 (C-8), 98.9 (C-4), 93.7 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物4為異去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯。

化合物5：黃色粉末；ESI-MS287.2 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為286；分子式為C15H10O6；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.29 (1H, dd,= 8.2, 2.2 Hz, H-6′), 7.27 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.81 (1H, d,= 9.0 Hz, H-5′), 6.43 (1H, s, H-3), 6.33 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.10 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 182.4 (C-4), 164.9 (C-9), 164.7 (C-2), 161.8 (C-5), 158.0 (C-7), 149.6 (C-4′), 145.6 (C-3′), 122.3 (C-1′), 118.9 (C-6′), 115.4 (C-5′), 112.7 (C-2′), 103.9 (C-10), 102.4 (C-3), 98.7 (C-6), 93.6 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物5為木犀草素。

化合物6：灰白色粉末；ESI-MS263.1 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為262；分子式為C13H10O2S2；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.86 (1H, s, 5′-CHO), 7.67 (1H, d,= 4.0 Hz, H-3), 7.23 (1H, d,= 4.0 Hz, H-4) 7.20 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.10 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 3.85 (2H, dd,= 10.7, 5.1 Hz, H-9), 2.76 (2H, dd,= 11.1, 5.3 Hz, H-8)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 146.5 (C-5′), 140.3 (C-2), 137.2 (C-2′), 134.3 (C-4), 126.9 (C-4′), 125.0 (C-3′), 124.3 (C-3), 122.4 (C-5), 93.4 (C-7), 74.8 (C-6), 60.9 (C-9), 24.2 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物6為5′-(4-羥基-1-丁炔-1-基) [2,2′-聯(lián)噻吩]-5-醛。

化合物7：黃色粉末；ESI-MS249.4 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為248；分子式為C12H8S3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.18 (2H, dd,= 3.6, 1.0 Hz, H-3, 3′′), 7.23 (2H, dd,= 5.1, 1.1 Hz, H-5, 5′′), 7.08 (2H, s, H-3′, 4′), 7.03 (2H, dd,= 5.1, 3.6 Hz, H-4, 4′′)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 137.1 (C-2, 2′′), 136.2 (C-2′, 5′), 127.9 (C-4, 4′′), 124.5 (C-5, 5′′), 124.3 (C-3′, 4′), 123.7 (C-3, 3′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物7為α-三聯(lián)噻吩。

化合物8：棕黃色粉末；ESI-MS277.2 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為276；分子式為C13H8OS3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.86 (1H, s, H-6), 7.68 (1H, d,= 4.0 Hz, H-4), 7.29 (1H, d,= 4.0 Hz, H-5′′), 7.27 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3), 7.25 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′′), 7.24 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.14 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.06 (1H, dd,= 5.0, 3.7 Hz, H-4′′)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 182.4 (C-6), 146.8 (C-2), 141.6 (C-5), 139.2 (C-2′′), 137.4 (C-4), 136.4 (C-5′), 134.5 (C-2′), 128.1 (C-4′′), 126.9 (C-5′′), 125.4 (C-3′′), 124.7 (C-4′), 124.5 (C-3′), 124.0 (C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物8為α-三聯(lián)噻吩甲醛。

化合物9：棕黃色粉末；ESI-MS279.1 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為278；分子式為C13H10OS3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.23 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5′′), 7.18 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.08 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.06 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.04 (1H, d,= 3.5 Hz, H-3′′), 7.03 (1H, dd,= 5.1, 3.8 Hz, H-4′′), 6.92 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 4.81 (2H, s, H-6)；13C-NMR (400 MHz, acetone6): 143.1 (C-5), 137.4 (C-2), 137.1 (C-2′′), 136.3 (C-5′), 136.1 (C-2′), 127.9 (C-4′′), 126.2 (C-4), 124.3 (C-3′), 124.3 (C-4′), 124.3 (C-5′′), 123.8 (C-3), 123.3 (C-3′′), 60.2 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物9為α-三聯(lián)噻吩甲醇。

化合物10：棕黃色粉末；ESI-MS293.4 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為292；分子式為C14H12OS3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.46 (1H, dd,= 5.1, 1.0 Hz, H-5′′), 7.31 (1H, dd,= 0.8, 3.6 Hz, H-3), 7.23 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.20 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.17 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3′′), 7.11 (1H, dd,= 5.0, 3.6 Hz, H-4′′), 7.01 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 4.60 (2H, s, H-6), 3.35 (3H, s, H-7)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 144.2 (C-5′), 141.2 (C-5), 137.3 (C-2), 136.1 (C-2′′), 136.0 (C-2′), 128.1 (C-4′′), 127.2 (C-4), 125.0 (C-5′′), 124.5 (C-3′), 124.4 (C-4′), 124.0 (C-3), 123.3 (C-3′′), 68.5 (C-6), 56.9 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，故鑒定化合物10為5-甲氧亞甲基-2,2′:5′,2′′-三聯(lián)噻吩。

化合物11：棕黃色粉末；ESI-MS321.4 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為320；分子式為C15H12O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.47 (1H, dd,= 5.1, 1.0 Hz, H-5′′), 7.33 (1H, d,= 3.6, 1.0 Hz, H-3′′), 7.23 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.23 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.19 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.13 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 7.12 (1H, dd,= 5.1, 3.6 Hz, H-4′′), 5.25 (2H, s, H-6), 2.06 (3H, s, H-8)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 170.1 (C-7), 138.0 (C-5), 137.3 (C-2), 136.5 (C-5′), 136.3 (C-2′), 136.2 (C-2′′), 129.3 (C-4), 128.2 (C-4′′), 125.1 (C-5′′), 124.8 (C-3′), 124.6 (C-4′), 124.1 (C-3′′), 123.4 (C-3), 60.0 (C-6), 19.9 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物11為5-羥甲基-(2,2′:5′,2′′)-三聯(lián)噻吩乙酯。

化合物12：棕黃色粉末；ESI-MS363.1 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為362；分子式為C18H18O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.45 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5′′), 7.32 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3′′), 7.23 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.23 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.19 (1H, d,= 3.7 Hz, H-3), 7.13 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 7.11 (1H, dd,= 5.1, 3.7 Hz, H-4′′), 5.29 (2H, s, H-6), 2.46 (1H, m, H-8), 1.71 (2H, m, H-9), 1.14 (2H, t,= 3.5 Hz, H-10), 0.88 (3H, d,= 4.4 Hz, H-11)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 175.5 (C-7), 138.3 (C-5), 136.5 (C-5′), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-2), 135.6 (C-2′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-4′′), 124.8 (C-3′), 124.8 (C-5′′), 124.6 (C-4′), 124.1 (C-3′′), 123.3 (C-3), 59.9 (C-6), 40.6 (C-8), 26.5 (C-9), 16.0 (C-10), 10.9 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20]，故鑒定化合物12為[2,2′:5′,2′′-三聯(lián)噻吩]-5-基甲基-2-甲基丁酯。

化合物13：棕黃色粉末；ESI-MS361.5 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為360；分子式為C18H16O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.46 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5′′), 7.32 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3′′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.20 (1H, d,= 3.7 Hz, H-3), 7.16 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 7.11 (1H, dd,= 5.0, 3.6 Hz, H-4′′), 6.19 (1H, qd,= 7.2, 1.4 Hz, H-4′′′), 5.36 (2H, s, H-1′′′), 1.98 (3H, dd,= 7.2, 1.5 Hz, H-5′′′), 1.89 (3H, s, H-6′′′)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 166.9 (C-2′′′), 138.2 (C-5), 138.1 (C-4′′′), 137.7 (C-2′), 136.5 (C-2′′), 136.3 (C-2), 135.6 (C-5′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-4′′), 127.4 (C-3′′′), 125.1 (C-5′′), 124.7 (C-4′), 124.6 (C-3′), 124.1 (C-3′′), 123.4 (C-3), 59.9 (C-1′′′), 19.8 (C-6′′′), 15.1 (C-5′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20]，故鑒定化合物13為5-羥甲基- (2,2′:5′,2′′)-噻吩當(dāng)歸酸酯。

化合物14：棕黃色粉末；ESI-MS361.5 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為360；分子式為C18H16O2S3；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.45 (1H, dd,= 5.1, 0.9 Hz, H-5′′), 7.31 (1H, dd,= 3.6, 0.8 Hz, H-3′′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.19 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.14 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 7.11 (1H, dd,= 5.0, 3.6 Hz, H-4′′), 6.91 (1H, qd,= 7.0, 1.3 Hz, H-4′′′), 5.33 (2H, s, H-1′′′), 1.83 (3H, t,= 1.0 Hz, H-6′′′) 1.81 (3H, dd,= 7.0, 0.9 Hz, H-5′′′)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 166.8 (C-2′′′), 138.3 (C-5), 137.7 (C-2′), 137.7 (C-4′′′), 136.5 (C-2′′), 136.3 (C-2), 135.6 (C-5′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-3′′′), 128.1 (C-4′′), 124.7 (C-4′), 124.7 (C-5′′), 124.6 (C-3′), 124.0 (C-3′′), 123.4 (C-3), 60.2 (C-1′′′), 13.5 (C-5′′′), 11.3 (C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[21]，故鑒定化合物14為5-羥甲基-(2,2′:5′,2′′)-噻吩巴豆酸酯。

化合物15：棕黃色粉末；ESI-MS329.1 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為328；分子式為C18H16O2S2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.22 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.15 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 6.90 (1H, dd,= 7.0, 1.4 Hz, H-4′′′), 6.17 (1H, dd,= 17.5, 11.3 Hz, H-3′′), 5.77 (1H, dd,= 17.5, 1.9 Hz, H-4′′a), 5.65 (1H, dd,= 11.3, 1.9 Hz, H-4′′b), 5.34 (2H, s, H-1′′′), 1.80 (3H, dd,= 7.0, 1.0 Hz, H-5′′′), 1.83 (3H, t, H-6′′′)；13C-NMR (400 MHz, acetone6): 166.7 (C-2′′′), 139.1 (C-5), 137.7 (C-4′′′), 133.4 (C-5′), 133.3 (C-2′), 129.1 (C-4), 128.2 (C-3′′′), 127.1 (C-4′′), 124.5 (C-4′), 124.4 (C-3′), 124.1 (C-3), 122.1 (C-2), 116.7 (C-3′′), 93.0 (C-2′′), 82.1 (C-1′′), 60.1 (C-1′′′), 13.5 (C-5′′′), 11.2 (C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[22]，故鑒定化合物15為 ()-[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-甲醇-5′-(3-丁烯-1-炔基)-2-巴豆酸酯。

化合物16：棕黃色粉末；ESI-MS329.1 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為328；分子式為C18H16O2S2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.23 (1H, d,= 3.1 Hz, H-3), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 7.17 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 6.17 (1H, dd,= 17.5, 11.3 Hz, H-3′′), 6.13 (1H, dd,= 7.4, 1.4 Hz, H-4′′′), 5.77 (1H, dd,= 17.5, 1.9 Hz, H-4′′a), 5.65 (1H, dd,= 11.3, 1.9 Hz, H-4′′b), 5.36 (2H, s, H-1′′′), 1.98 (3H, dd,= 7.2, 1.5 Hz, H-5′′′), 1.88 (3H, m, H-6′′′)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 166.8 (C-2′′′), 138.2 (C-5), 138.1 (C-4′′′), 133.4 (C-5′), 133.3 (C-2′), 129.2 (C-4), 127.4 (C-3′′′), 127.1 (C-4′′), 124.1 (C-3), 124.1 (C-3′), 124.0 (C-4′), 121.6 (C-2), 116.7 (C-3′′), 93.0 (C-2′′), 82.5 (C-1′′), 59.8 (C-1′′′), 19.8 (C-6′′′), 15.0 (C-5′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[23]，故鑒定化合物16為 ()-5′-(3-丁烯-1-炔基)-[2,2′-噻吩]-5-甲醇-2-甲基巴豆酸酯。

化合物17：棕黃色粉末；ESI-MS289.3 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為288；分子式為C15H12O2S2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.22 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.22 (1H, d,= 3.8 Hz, H-4′), 7.21 (1H, d,= 3.6 Hz, H-4), 7.13 (1H, d,= 3.6 Hz, H-3), 6.17 (1H, dd,= 17.6, 11.3 Hz, H-3′′), 5.76 (1H, dd,= 17.5, 2.0 Hz, H-4′′a), 5.65 (1H, dd,= 11.3, 2.0 Hz, H-4′′b), 5.25 (2H, s, H-6), 2.05 (3H, s, H-8)；13C-NMR (400 MHz, acetone6): 170.0 (C-7), 138.8 (C-5), 133.6 (C-5′), 133.3 (C-2′), 129.3 (C-4), 127.1 (C-4′′), 124.1 (C-3), 124.1 (C-3′), 124.0 (C-4′), 121.6 (C-2), 116.7 (C-3′′), 92.9 (C-2′′), 82.7 (C-1′′), 59.9 (C-6), 19.8 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[24]，故鑒定化合物17為5′-(3-丁烯-1-炔-1-基)-[2,2′-聯(lián)噻吩]-5-甲醇-5-乙酯。

化合物18：棕黃色粉末；ESI-MS247.1 [M＋H]+，確定相對(duì)分子質(zhì)量為246；分子式為C13H10OS2；1H-NMR (400 MHz, acetone6): 7.21 (1H, d,= 3.8 Hz, H-3), 7.17 (1H, d,= 3.9 Hz, H-3′), 7.17 (1H, d,= 3.9 Hz, H-4′), 6.94 (1H, d,= 3.7 Hz, H-4), 6.16 (1H, dd,= 17.6, 11.3 Hz, H-3′′), 5.84 (1H, dd,= 11.3, 2.0 Hz, H-4′′a), 5.76 (1H, dd,= 17.6, 2.0 Hz, H-4′′b), 4.78 (2H, s, H-6)；13C-NMR (100 MHz, acetone6): 147.1 (C-5), 146.9 (C-5′), 139.2 (C-2′), 135.7 (C-2), 133.3 (C-3), 127.0 (C-4′′), 125.0 (C-4), 124.1 (C-3′), 123.4 (C-4′), 116.7 (C-3′′), 92.8 (C-2′′), 82.5 (C-1′′), 59.0 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[25]，故鑒定化合物18為5′-羥甲基- 5-(3-丁烯-1-炔基)-2,2′-聯(lián)噻吩。

3.2 抗T3SS活性篩選結(jié)果

通過SDS-PAGE檢測(cè)沙門菌毒力蛋白分泌情況，篩選化合物1～18的抗T3SS毒力蛋白分泌活性，發(fā)現(xiàn)化合物5對(duì)毒力蛋白（SipA、B、C、D）的分泌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，化合物1、3、4表現(xiàn)出一定的抑制作用。濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），化合物5對(duì)毒力蛋白分泌的抑制作用呈濃度相關(guān)性。在100 μmol/L時(shí)，顯著抑制毒力蛋白的分泌；25 μmol/L時(shí)，對(duì)毒力蛋白的分泌仍有一定的抑制，且不影響鞭毛蛋白FliC的分泌。因此，化合物5可作為T3SS的抑制劑繼續(xù)研究。

A-化合物1～9的活性篩選 B-化合物10～18的活性篩選 C-化合物5的結(jié)構(gòu) D-化合物5濃度相關(guān)性地抑制毒力蛋白Sip A、B、C、D的分泌；FliC-沙門菌鞭毛蛋白；M-Marker

4 討論

應(yīng)用多種色譜分離方法和核磁、質(zhì)譜等技術(shù)從醴腸全草提取物中分離鑒定了18個(gè)單體化合物的結(jié)構(gòu)，化合物6、15、16為首次從該植物中分離得到；利用SDS-PAGE法對(duì)化合物1～18進(jìn)行T3SS抑制活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物1、3～5具有抗沙門菌T3SS的活性，其中化合物5具有較強(qiáng)的抗T3SS活性。本研究結(jié)果豐富了醴腸中化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，并為抗毒力藥物的開發(fā)提供活性先導(dǎo)了化合物，為藥用植物的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突。

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Chemical constituents from whole herbs ofand active components inhibit T3SS of

ZHANG Xiao-chun, LU Chun-hua

Institute of Natural Medicinal Chemistry, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University,Jinan 250012, China

To investigate the chemical constituents and anti-T3SS activity from whole herbs of.The chemical constituents were systematically separated and purified by Sephadex LH-20, Silica gel, MPLC and HPLC column chromatography, and identified based on their MS and NMR data. The anti-T3SS activities of compounds 1—18 on Salmonella were detected by SDS-PAGE assay.Eighteen compounds were obtained from the extracts ofand identified as orobol (1), 3′--methyl orobol (2), wedelolactone (3), isodemethyl wedelolactone (4), luteolin (5), 5′-(4-hydroxy- 1-butyn-1-yl)[2,2′-bithiophene]-5-carboxaldehyde (6), α-terthienyl (7), α-formylterthienyl (8), α-terthienyl methanol (9), 5- (methoxymethyl)-2,2′:5′,2′′-terthiophene (10), 5-hydroxymethyl-(2,2′:5′,2′′)-terthienyl acetate (11), [2,2′:5′,2′′-terthiophen]-5-yl methyl 2-methylbutanoate (12), 5-hydroxymethyl-(2,2′:5′,2′′)-terthienyl angelate (13), 5-hydroxymethyl-(2,2′:5′,2′′)-terthienyl tiglate (14), ()-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-2-methylcrotonate (15), ()-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5- methanol- 2-methylcrotonate (16), 5′-(3-buten-1-yn-1-yl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-5-acetate (17), and 5′-hydroxymethyl-5-(3-buten-1-ynyl)- 2,2′-bithiophene (18), respectively.Compounds 6, 15 and 16 are isolated from this plant for the first time. Compound 5 has significant anti-T3SS activity against the effector protein secretion, meanwhile, compounds 1, 3 and 4 showed certain activity, which provide a theoretical basis for the folk use ofas purulent, hemostatic, heat dysentery, antibacterial and anti-infective drugs.

L.; anti-T3SS ofactivity; anti-virulence drugs; thiophene; flavone; 5′-(4-hydroxy-1- butyn-1-yl) [2,2′-bithiophene]-5-carboxaldehyde; ()-5′-(3-buten-1-ynyl)-[2,2′-bithiophene]-5-methanol-2-methylcrotonate; luteolin

R284.1

A

0253 - 2670(2022)16 - 4940 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.003

2022-02-02

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（22177062）；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（IRT_17R68）

張曉春（1996—），女，在讀博士生，藥學(xué)專業(yè)。E-mail: 2267837415@qq.com

魯春華（1975—），女，教授，天然藥物化學(xué)專業(yè)。E-mail: ahua0966@sdu.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]