高 倩王建宇孟偉建李 靜崔永健魏 琰

(衡水市人民醫(yī)院(哈勵遜國際和平醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)二科,河北 衡水 053000)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是一種因腦血管病變引起的腦供血不足而導(dǎo)致的具有嚴(yán)重并發(fā)癥和高死亡率的亞急性或急性腦血管類疾病,目前其已經(jīng)成為全球性首位殘疾和第三致死的疾病[1-2]。 持續(xù)的腦缺血會造成腦神經(jīng)的持續(xù)傷害,造成不良預(yù)后甚至死亡,因此,及早的恢復(fù)腦血灌流是治療IS 的主要治療策略[3]。 而再灌注也會加重最初由缺血引起的腦損傷,其還能引起缺血區(qū)神經(jīng)元繼發(fā)性損傷,這種由再灌注引起的腦神經(jīng)二次傷害嚴(yán)重影響患者的病后神經(jīng)功能恢復(fù)[4-5]。 目前沒有特異性抑制腦缺血/再灌注( ischemia/reperfusion,I/R)損傷的方法。 如何改善腦I/R 所致的神經(jīng)損傷已成為目前急需解決的問題。

腦I/R 損傷可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥級聯(lián)反應(yīng)等一系列復(fù)雜的病理變化[6-7]。 大豆皂苷是一類主要從大豆中提取的三萜類齊墩果烷型皂苷,目前已確認(rèn)了18 種大豆皂苷,根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分成A 類、B 類、E 類和DDMP 類[8-9]。 其中,大豆皂苷Bb(soyasaponin Bb,SSBb)是大豆皂苷中主要的活性化合物之一,已發(fā)現(xiàn)其在不同的疾病模型中具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和防治心血管等多種藥理作用[10-11]。 根據(jù)SSBb 的藥理作用,推測其可能也會在腦I/R 中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,而具體作用并不清楚。 本研究以大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型觀察SSBb(灌胃給藥)預(yù)處理對MCAO 大鼠腦I/R 所致的腦損傷是否具有神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60 只SD 大鼠(6 周齡,SPF 級,雄性,體重:220~240 g)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0011]提供,將大鼠飼養(yǎng)在河北醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心維持12 h/12 h 循環(huán)光照、濕度(60±5)%和溫度(22±3)℃的屏障環(huán)境動物房[SYXK(冀)2018-0005],大鼠可自由獲取食物和水。 本實(shí)驗(yàn)使用動物的程序經(jīng)衡水市人民醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)(2020-107),并符合實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南的3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

大豆皂苷Bb(SSBb,純度:99%;#51330-27-9),購自上海一基實(shí)業(yè)有限公司,使用時用生理鹽水配置成混懸液;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenytetrazolium chloride,TTC)染色液(#G3005)購自北京索萊寶生物科技有限公司;兔源微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)抗體(#AF4081)購自美國Affinity Biosciences 公司;小鼠源腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(#sc-12744)購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司;Cy3 標(biāo)記的羊抗兔IgG(#BS10007)和FITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(#BS50950)購自南京巴傲得生物科技有限公司;HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(#CLGRHRP)購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司; 兔源 β-actin 抗體(#WL01372)、RIPA 裂解液(#WLA017)和高敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(#WLA003)購自萬類生物科技有限公司;兔源突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD-95)(#ab18258)、兔源突觸素I(synapsin I)(#ab64581)和兔源突觸結(jié)合蛋白(synaptotagmin)(#ab131548)購自英國Abcam 公司;OCT 冰凍切片包埋劑(#4583)購自美國Tissue-Tek 公司。 真空干燥箱(型號:LVO-0B6020;上海龍躍儀器設(shè)備有限公司);電子天平(型號:BA2204;澳大利亞KEWLAB公司);激光共焦熒光顯微鏡(型號:LSM 980 with Airyscan;德國Carl Zeiss 公司);數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)(型號:Moticam Pro 285C)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);酶標(biāo)儀(型號:EnVision;美國PerkinElmer 公司);蛋白質(zhì)免疫轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號:Tanon V8 ;上海天能科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

大鼠經(jīng)1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后,將其隨機(jī)分為假手術(shù)組,MCAO 組和低、高劑量SSBb 預(yù)處理組,每組15 只大鼠。 參照Zhang 等[12]方法,用線拴法對MCAO 組和低、高劑量SSBb 預(yù)處理組的大鼠行左側(cè)MCAO 術(shù)處理。 具體操作方式:大鼠麻醉后,仰臥位固定,頸部正中切口,結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈近心端;用微血管夾夾閉頸總動脈遠(yuǎn)心端,將線栓沿頸總動脈、頸內(nèi)動脈,送入大腦中動脈約2 cm 處;并于缺血后2 h 抽出線栓,實(shí)現(xiàn)再灌注。 假手術(shù)組大鼠除不進(jìn)行線拴結(jié)扎外,其余步驟程序同MCAO術(shù)。 為研究SSBb 預(yù)處理對腦I/R 的影響,低、高劑量SSBb 預(yù)處理組的大鼠在行MCAO 術(shù)前1 h,分別用灌胃針胃內(nèi)注射20 和50 mg/kg SSBb(SSBb 的劑量參考大鼠實(shí)驗(yàn)的報道[11]);假手術(shù)組和MCAO 組的大鼠行MCAO 術(shù)前1 h 給予等體積生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)功能評估

在再灌注24 h 后,由1 名對分組不知情的實(shí)驗(yàn)人員按照Zhang 等[12]的改良神經(jīng)功能缺損評分量表(modified neurological severity score,mNSS)評估大鼠的神經(jīng)功能缺陷。 NSS 評分在0~18 分之間,0分表示無神經(jīng)功能缺陷,評分較高表示神經(jīng)功能缺陷越嚴(yán)重,18 分表示持續(xù)性昏迷或死亡。

1.3.3 腦含水量檢測

用腦含水量法評估腦水腫[13]。 在神經(jīng)功能缺損評分結(jié)束后,每組任選5 只大鼠,麻醉后,用頸椎脫位法處死。 然后迅速摘除大腦并稱重以獲得濕重。 在烘箱中60℃干燥24 h 后,直到重量不變,再次稱重以獲得干重。 腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4 TTC 染色

每組任選5 只大鼠,麻醉后,用頸椎脫位法處死。 取全腦并快速在-20℃下保存30 min。 用大鼠腦切片器切出連續(xù)11 個2 mm 厚的冠狀切片,然后侵入2% TTC 染液中在37℃下避光染色15 min。 取出切片,用PBS 清洗3 次,濾紙吸掉液體進(jìn)行拍照。蒼白的未染色區(qū)表示梗死區(qū)域,紅色染色區(qū)表示正常組織。 用Image Pro Plus 測量每個切片的梗死面積;每切片梗死體積=各切片梗死面積×層厚(2 mm);總梗死體積為各切片的梗死體積之和。

1.3.5 免疫熒光

剩余大鼠經(jīng)麻醉處死后,迅速切下大腦,在多聚甲醛中固定24 h,然后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液在4℃條件下放置48 h,然后嵌入OCT 冰凍切片包埋劑。 然后用冰凍切片機(jī)將大腦組織切割成6 μm 厚度的切片。 用PBS 沖洗3 次,在室溫下用5%山羊血清封閉30 min,在4℃下分別用兔抗MAP-2(1 ∶2000)和小鼠抗TNF-α(1 ∶500)在加濕室孵育過夜,用PBS 沖洗3 次,在室溫下分別用1 ∶1000 稀釋的Cy3 標(biāo)記的羊抗兔IgG 和FITC 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 的熒光二抗避光孵育2 h,用PBS 沖洗3 次,用DAPI 染細(xì)胞核5 min。 在激光共焦熒光顯微鏡下觀察,并隨機(jī)采集梗死和非梗死區(qū)域交界處的圖像并進(jìn)行定量研究。 用Image Pro Plus 測量熒光強(qiáng)度,陽性表達(dá)水平= 積分光密度值(IOD)/視野面積×100%。

1.3.6 蘇木素-伊紅染色

將腦組織用石蠟包埋,并用石蠟切片機(jī)切為6 μm 厚度的切片。 腦切片經(jīng)脫蠟至水后,按常規(guī)程序分別用蘇木素和伊紅染色液進(jìn)行染色。 脫水封片后,顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡

收集缺血半暗帶腦組織,用RIPA 裂解法提取蛋白,用BCA 法量化每樣本蛋白濃度。 將80 μg 蛋白的樣本行SDS/PAGE 電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。 然后,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1 h,并在4℃下與適當(dāng)稀釋比例的初級抗體孵育過夜?？贵w稀釋濃度為:PSD95(1 ∶3000)、synaptotagmin(1 ∶2000)、synapsin I(1 ∶1000)和β-actin(1 ∶10000)。 TBST 洗膜3 次,室溫下與1 ∶1000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 孵育2 h。 用TBST 洗膜3次,使用ECL 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察蛋白帶,并用Image Pro Plus 進(jìn)行定量光密度值IOD。 陽性表達(dá)水平=目的蛋白(IOD)/β-actin(IOD)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0 分析軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 所有數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。 多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析法,組間均數(shù)兩兩比較采用事后LSD-t檢驗(yàn),P<0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大豆皂苷Bb 預(yù)處理降低腦I/R 所致的神經(jīng)功能障礙和腦水腫

通過mNSS 評分表和腦含水量來分別評估大豆皂苷Bb 預(yù)處理對腦I/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)功能障礙和腦水腫的影響。 如圖1A 所示,與假手術(shù)組相比,MCAO 組NSS 評分顯著升高(P<0.001),提示神經(jīng)功能障礙;而低、高劑量大豆皂苷Bb 預(yù)處理均顯著降低MCAO 大鼠的NSS 評分(P< 0.01 和P<0.001),提示大豆皂苷Bb 預(yù)處理降低MCAO 大鼠神經(jīng)功能障礙,其中高劑量效果更為顯著(P<0.001)。 腦含水量檢測結(jié)果(圖1B)顯示,MCAO組腦含水量顯著高于假手術(shù)組(P<0.001),而低、高劑量大豆皂苷Bb 預(yù)處理的MCAO 大鼠腦含水量均較MCAO 組顯著降低(P<0.01 和P<0.001),提示大豆皂苷Bb 預(yù)處理降低MCAO 大鼠的腦水腫,其中高劑量效果更為顯著(P<0.001)。

2.2 大豆皂苷Bb 預(yù)處理減輕腦I/R 后的腦梗死

用TTC 染色和MAP-2 免疫熒光染色評估大豆皂苷Bb 預(yù)處理對腦I/R 誘導(dǎo)腦梗死的影響。 TTC染色(圖2A、2C)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,MCAO組梗死體積顯著增加(P<0.001);與MCAO 組相比,低、高劑量大豆皂苷Bb 預(yù)處理組梗死體積均顯著降低(P<0.01 和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001)。 MAP-2 免疫熒光染色(圖2B、2D)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,MCAO 組MAP-2 熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.001);與MCAO 組相比,低、高劑量大豆皂苷Bb 預(yù)處理組MAP-2 熒光強(qiáng)度均顯著增加(P<0.01 和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001)。 這些結(jié)果提示,大豆皂苷Bb 預(yù)處理可改減輕腦I/R 后的腦梗死。

2.3 大豆皂苷Bb 預(yù)處理抑制腦I/R 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

為明確大豆皂苷Bb 預(yù)處理對腦I/R 誘導(dǎo)的炎癥的影響,采用HE 染色法觀察腦I/R 后24 h 腦組織形態(tài),免疫熒光法檢測腦組織中TNF-α 的表達(dá)水平,并用MAP-2 顯示缺血半暗帶。 HE 染色結(jié)果(圖3A)表明,假手術(shù)組腦組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常;MCAO 組腦組織顯示水腫和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,組織中的部分細(xì)胞可見細(xì)胞核碎片、核固縮和凋亡小體;低、高劑量大豆皂苷Bb 預(yù)處理組顯示腦組織水腫和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減輕,組織中細(xì)胞形態(tài)也趨向正常。 免疫熒光染色結(jié)果(圖3B~3D)表明,與假手術(shù)組比較,MCAO 組TNF-α 熒光強(qiáng)度顯著增高(P<0.001);與MCAO 組比較,低、高劑量大豆皂苷Bb 預(yù)處理組TNF-α 熒光強(qiáng)度均顯著降低(P<0.01和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001)。這些結(jié)果表明大豆皂苷Bb 可以減輕腦I/R 導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

2.4 大豆皂苷Bb 預(yù)處理抑制腦I/R 誘導(dǎo)的突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot 結(jié)果(圖4)顯示,與假手術(shù)組相比,MCAO 組PSD95、synaptotagmin 和synapsin I 的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.001);與MCAO 組相比,低、高劑量大豆皂苷Bb 預(yù)處理組上述蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01 和P<0.001),且高劑量組效果更顯著(P<0.001),這表明大豆皂苷Bb 抑制腦I/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的軸突損傷。

注:A:各組大鼠的NSS 評分;B:各組大鼠的腦含水量。 與假手術(shù)組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖1 大豆皂苷Bb 預(yù)處理可以降低腦I/R 所致的神經(jīng)功能障礙和腦水腫(n=5)Note.A, NSS scores of rats in various groups.B, Brain water contents of rats in various groups.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 1 SSBb pretreatment reduces neurological dysfunction and brain edema caused by brain I/R

注:A:代表性的TTC 染色圖像;B:代表性MAP-2 染色切片的熒光顯微圖像顯示的腦梗死區(qū)域(MAP-2 為亮紅色點(diǎn),細(xì)胞核為亮藍(lán)色點(diǎn));C:各組梗死體積;D:各組MAP-2 的相對熒光強(qiáng)度。 與假手術(shù)組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖2 大豆皂苷Bb 預(yù)處理減輕大鼠腦I/R 后的腦梗死(n=5)Note.A, Representative images of TTC staining.B, Representative fluorescence microscopy images of MAP-2 stained sections showing the infarction areas in the brain (MAP-2 appears as bright red dots, while the nucleus is represented as bright blue spots).C, Infarct volume in various groups.D, Relative fluorescence intensity of MAP-2 in various groups.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 2 SSBb pretreatment alleviates cerebral infarction after cerebral I/R in rats

注:A:各組腦組織代表性HE 染色圖像;B:缺血半暗帶中MAP-2 和TNF-α 免疫熒光定位圖像;C、D:半暗帶中MAP-2 和TNF-α 的相對熒光強(qiáng)度。 與假手術(shù)組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖3 大豆皂苷Bb 預(yù)處理抑制腦I/R 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(n=5)Note.A, Representative HE staining images of brain tissues in each group.B, Immunofluorescence localization of MAP-2 and TNF-α in ischemic penumbra area.C, D, Relative fluorescence intensity of MAP-2 and TNF-α in the penumbra region.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 3 SSBb pretreatment inhibits inflammatory response induced by cerebral I/R

注:A:各組代表性PSD95、synapsin I 和synaptotagmin 的Western blot;B~D:各組PSD95、synapsin I 和synaptotagmin 的蛋白表達(dá)的定量分析。 與假手術(shù)組相比,???P<0.001;與MCAO 組相比, ##P<0.01, ###P<0.001。圖4 大豆皂苷Bb 預(yù)處理對腦I/R 后突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=5)Note.A, Representative Western blot electrophoregrams of PSD95, synapsin I and synaptotagmin in each group.B~D, Quantification analysis of the expression levels of PSD95, synapsin I and synaptotagmin proteins in various groups.Compared with sham group,???P<0.001.Compared with MCAO group, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 4 Effect of SSBb pretreatment on the expression of synaptic-associated proteins after cerebral I/R

3 討論

腦卒中是導(dǎo)致死亡和神經(jīng)功能障礙的主要原因[1-2],而IS 在所有類型的腦卒中病例中約占80%~85%[14]。 先前的研究已經(jīng)證實(shí),腦I/R 會導(dǎo)致腦血管損傷和血腦屏障的破壞,以及神經(jīng)元損傷的級聯(lián)效應(yīng)[6-7,15]。 目前還沒有阻斷腦I/R 的有效策略,因此,關(guān)于如何減少腦I/R 損傷的不良影響,仍需要做大量的工作。 本研究顯示SSBb 預(yù)處理能減輕腦I/R 后神經(jīng)功能損傷、腦水腫和腦梗死,提示其可能是潛在的用于IS 的神經(jīng)保護(hù)劑。

腦I/R 損傷會加重腦缺血引發(fā)促炎介質(zhì)的釋放、細(xì)胞死亡、軸突損傷和再生抑制[4-5]。 抗炎、抗凋亡和維持損傷神經(jīng)元的存活是神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)和再生的重要過程。 各種促炎細(xì)胞因子的釋放引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)是腦I/R 炎癥損傷的主要機(jī)制[16]。TNF-α 是一種強(qiáng)促炎細(xì)胞因子,在缺血性腦損傷中發(fā)揮多效性功能[17]。 在先前不同疾病類型的研究中顯示SSBb 具有抑制炎癥作用[10-11]。 在本研究中,也證明了SSBb 預(yù)處理能減少缺血半暗帶中TNF-α 的表達(dá),提示其在腦I/R 模型大鼠中也具有抗炎作用。

突觸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元之間的接觸位點(diǎn),有助于信息的處理、傳遞和存儲。 樹突棘是一種分散在許多類型神經(jīng)元的樹突上的微小突起,是興奮性突觸的主要靶點(diǎn)[18]。 大腦中血流減少90%,10~20 min 內(nèi)就會導(dǎo)致樹突棘丟失和不可逆的樹突損傷[19]。 在急性MCAO 模型中,缺血性卒中不僅會導(dǎo)致梗死缺血區(qū)的神經(jīng)元死亡,還會損害缺血半暗帶區(qū)域的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)[20]。 中樞神經(jīng)元的棘和樹突是突觸信號傳導(dǎo)的重要位點(diǎn),其也是缺血后最易損傷的結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)破壞會中斷神經(jīng)元回路和損害大腦突觸發(fā)生的功能。 為增加突觸發(fā)生,神經(jīng)元會增加樹突分枝的形態(tài)學(xué)改變,使大腦能夠重組神經(jīng)元回路,增加與突觸調(diào)節(jié)相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。synaptotagmin 是突觸囊泡的對接和與神經(jīng)元膜的融合的關(guān)鍵蛋白[21]。 Synapsin I 是一種促進(jìn)突觸囊泡形成、突觸發(fā)生和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的蛋白[22]。PSD-95 是樹突棘突觸后密度中的一種主要支架蛋白[23]。 本研究結(jié)果表明,SSBb 預(yù)處理可以明顯增加腦I/R 損傷后synaptotagmin、synapsin I 和PSD-95的表達(dá),表明SSBb 預(yù)處理在突觸發(fā)生中的潛在作用。

本研究結(jié)果表明,SSBb 預(yù)處理能夠減輕大鼠腦I/R 損傷引起的神經(jīng)功能缺陷、腦水腫及腦梗死,并且能夠促進(jìn)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá),具有神經(jīng)保護(hù)作用。