朱紅旭,楊本芹,高 媛,翟紅陽,趙艷卿

(昆明理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650500)

氮素是導(dǎo)致水體污染的重要污染物之一，會引起水質(zhì)惡化，水體富營養(yǎng)化，進(jìn)而導(dǎo)致水生動物中毒死亡。因此，氮素的治理工作日益受到重視，生物脫氮技術(shù)受到關(guān)注[1]。生物脫氮法以其安全、高效、經(jīng)濟(jì)等特點被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的污水脫氮方法，傳統(tǒng)生化脫氮要經(jīng)過好氧硝化和厭氧反硝化兩個過程，首先通過好氧硝化菌作用把氨氮轉(zhuǎn)變?yōu)橄醯^而在厭氧環(huán)境下通過反硝化菌作用把硝氮轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨鈴亩_(dá)到氮素的去除[2]。

20世紀(jì)80年代，Robertson等[3]報道了好氧反硝化菌(Paracoccussp.)的存在，此后，越來越多種類的好氧反硝化菌從不同的環(huán)境中被分離出來。目前已知的好氧反硝化菌主要為假單胞菌(Pseudomonas)、不動桿菌(Acinetobacter)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、芽孢桿菌(Bacillus)、代爾夫特菌(Delftia)和鹽單胞菌(Halomonas)等[4-11]。Bell等[12]闡明了好氧反硝化菌的反硝化機(jī)理，證明好氧反硝化的發(fā)生主要歸因于細(xì)胞內(nèi)存在的好氧反硝化作用酶體系，使好氧反硝化菌能夠在有氧的環(huán)境中將硝氮和亞硝氮還原為氮氣。這些理論基礎(chǔ)為本研究篩選和分離高效反硝化能力的好氧反硝化菌株提供了思路。好氧反硝化菌的脫氮工藝與傳統(tǒng)生物脫氮工藝相比，既縮短了工藝流程，又加快了反硝化效率。但是，目前大多數(shù)好氧反硝化菌的脫氮過程受環(huán)境限制，導(dǎo)致反硝化過程不穩(wěn)定且效率不高，硝氮去除效率多數(shù)僅達(dá)到1～10 mg/L[13-14]。因此有必要優(yōu)化好氧反硝化菌的生存環(huán)境以提高其反硝化能力。

研究旨在從濕地植物的根際土壤中分離篩選出高效好氧反硝化菌，對其進(jìn)行16S rDNA分子鑒定和反硝化功能基因的鑒定。同時，為了得到菌株的最適反硝化條件，對菌株的生長環(huán)境條件(碳源、溫度、初始pH值和碳氮比)進(jìn)行優(yōu)化，并探究其反硝化能力。旨在為后續(xù)投加好氧反硝化菌強(qiáng)化含氮污水的處理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與培養(yǎng)基制備

選取滇池濕地植物根際土壤作為研究所篩選的反硝化菌的來源，保存于4 ℃冰箱。培養(yǎng)基的制備：篩選分離培養(yǎng)基[15]：醋酸鈉2 g，胰蛋白胨15 g，酵母浸膏3 g，葡萄糖1 g，NaCl 6 g，KNO31.5 g；脫氮培養(yǎng)基(Denitrification medium,DM)：CH3COONa 2.83 g，KH2PO40.40 g，KNO31.0～4.0 g，Tris-HCl溶液12.0 mL，MgCl20.20 g，CaCl20.09 g，微量元素[8]2.0 mL。上述兩種培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需再加入20 g瓊脂粉，加蒸餾水定容至1 L，pH值為7.0±0.5。

1.1.2 菌株的分離與篩選

取1 mL根際土壤上清液，加入DM液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，160 r/min條件下進(jìn)行多次富集培養(yǎng)，直到觀察到培養(yǎng)液表面有氣體快速產(chǎn)生。之后取100 μL菌液接種到篩選分離固體培養(yǎng)基上，于30 ℃下倒置孵育36 h，之后進(jìn)行多次平板劃線培養(yǎng)，分離出的單菌落于-80 ℃儲藏備用。將分離出的單個菌株接種至DM液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，每12 h取樣并測定硝氮和亞硝氮含量，保留脫氮能力強(qiáng)的菌株。

1.2 方法

1.2.1 菌株的形態(tài)分析

用平板劃線法和掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)，用稀釋涂布記錄菌株生物量。SEM觀察：將菌株在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)36 h，取1.5 mL菌液，于6 000 r/min離心5 min，倒掉上清液。加入2 mL在4 ℃下預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液，固定24 h，之后通過掃描電鏡(日立SU 8010，日本)觀察菌株細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 菌株的PCR擴(kuò)增

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)36 h，用DNA試劑盒SK 8255(上海生工生物工程有限公司)提取50 μL菌株懸液DNA。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA和反硝化基因(napA和nirK)，PCR引物見表1。16S rDNA的PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，10 × buffer 5 μL，dNTP混合物2 μL，正向引物(10 μmol/L)2 μL，反向引物(10 μmol/L)2 μL，Taq酶0.5 μL。反硝化基因的PCR反應(yīng)體系：模板DNA(10～30 ng/μL)10 μL，PCR混合物25 μL，正向引物(10 μmol/L)2 μL，反向引物(10 μmol/L)2 μL，無酶水11 μL。系統(tǒng)發(fā)育分析：16S rDNA的PCR產(chǎn)物由上海生工生物科技有限公司測序，測序結(jié)果通過Blast軟件與GenBank中已提交的模式菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較，通過BIOEDIT軟件進(jìn)行多重序列比對分析，利用MEGA 6.0軟件，以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物列表Table 1 PCR(polymerase chain reaction) primer list

1.3 反硝化能力的優(yōu)化

預(yù)先將菌株接種至篩選分離液體培養(yǎng)基上活化，于30 ℃，160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)完成后取50 mL菌液在8 000 r/min，4 ℃下離心5 min，舍棄上清液，用無菌水清洗3次后重懸菌液，該菌株的OD600為1.0±0.05，之后按培養(yǎng)液體積比的5%分別接種菌液于含不同成分的200 mL的DM液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌株培養(yǎng)環(huán)境因子的優(yōu)化以提高菌株的反硝化能力。其中，碳源設(shè)置：葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、蛋白胨、乙醇；溫度設(shè)置：10 ℃、15 ℃、20 ℃、30 ℃和40 ℃；pH值設(shè)置：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0；C/N比(摩爾比)設(shè)置：1、3、5、7、10和15。其反硝化能力通過在培養(yǎng)過程中每12 h取菌液10 mL，測定生物量(OD600)、硝氮、亞硝氮、總氮(TN)、總有機(jī)碳(TOC)和pH值。

通過分光光度計測定菌液的吸光度OD600確定細(xì)胞密度(Lambda 25,分光光度計，美國)；硝氮、亞硝氮和總氮通過水和廢水監(jiān)測分析方法測定[18]；TOC和pH分別用TOC分析儀測定(日本島津公司)和pH計測定(PHS-3C 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.4 分析方法及計算

圖形的繪制使用Origin8.6(Origin Lab Corp,Northampton，美國)。

硝氮和總氮的去除率計算方法：(C0-C1)/C0×100%。去除效率計算方法：(C0-C1)/t×100%。其中，C0和C1分別為硝氮和總氮的初始濃度和最終濃度；t為反應(yīng)時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

分離得到41株菌株，分別編號為RC-1～RC-41。經(jīng)過脫氮分析后選取菌株RC-15為本研究中篩選出的高效反硝化菌株。

對于金棺中這個人，他是生是死，實在引不起青櫻過多的悲喜。他，不過是自己夫君的父親，王朝的先帝，甚至，遺棄了自己表姑母的男人。

2.2 菌株的形態(tài)與反硝化基因

菌株RC-15的形態(tài)特征為圓形、黃色、菌落較小，表面光滑濕潤，邊緣整齊，緊貼在培養(yǎng)基表面，易挑取[圖1(a)]。且該菌株為桿狀細(xì)菌，其長度約為0.5 μm，寬度約為0.1 μm，無鞭毛和芽孢[圖1(b)]。通過稀釋涂布法得知該菌株在對數(shù)增長期的菌落數(shù)為1.715×1011CFU(Colony-Forming Unit)，表明菌株生長狀態(tài)良好，生物活性高。

圖1 菌株RC-15的培養(yǎng)皿照片(a)和掃描電鏡(SEM)照片(b)Figure 1 Petri dish photos (a) and scanning electron microscope (SEM) photos (b) of strain RC-15

將測得的菌株RC-15的16S rDNA序列在NCBInucleotide數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)菌株RC-15與豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)的同源性為99.93%。采用MEGA4.1軟件進(jìn)行多重序列比對后，基于K-2-P(Kimura-2-parameter)模型構(gòu)建鄰接法(N-J 法)系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap自展檢測1 000，構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，菌株RC-15與豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)的親緣關(guān)系最為相近，推測菌株RC-15屬于氣單胞菌屬(Aeromonassp.)，為豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)。

圖2 利用Neighbor-Joining構(gòu)建的16 SrDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Figure 2 Phylogenetic tree drawn from neighbor-joining analysis based on the 16 SrDNA sequence alignment

生物脫氮是將硝氮轉(zhuǎn)化為一氧化氮、一氧化二氮或氮氣的過程，為了闡明菌株RC-15的脫氮途徑，研究選擇2個潛在的反硝化酶基因(napA、nirK)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在反硝化過程中不同酶的催化作用也不同[19]。由圖3可知，該菌株成功擴(kuò)增出napA和nirK的基因產(chǎn)物。napA基因是在好氧條件下參與硝酸鹽呼吸和反硝化作用的關(guān)鍵基因，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)后可產(chǎn)生硝酸還原酶，napA的表達(dá)也常被認(rèn)為是好氧反硝化細(xì)菌鑒定的功能標(biāo)記[20-21]。因此，該菌株napA基因的成功表達(dá)說明該菌株可產(chǎn)生硝酸還原酶，具有將硝氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮的能力，菌株RC-15的napA基因擴(kuò)增在Aeromonassp.HN-02中也有報道[22]。此外，nirK基因是編碼亞硝酸還原酶的基因[21]。該菌株成功擴(kuò)增出nirK基因的產(chǎn)物，說明該菌株可產(chǎn)生亞硝酸還原酶，具有轉(zhuǎn)化亞硝氮的能力。綜上所述，菌株RC-15功能基因的擴(kuò)增表明該菌株可產(chǎn)生2個關(guān)鍵酶(硝酸還原酶、亞硝酸還原酶)，進(jìn)一步說明該菌株具有好氧反硝化的能力。

Marker：DL 2000。圖3 氣單胞菌RC-15的反硝化基因擴(kuò)增Figure 3 The amplification of denitrification genes of Aeromonas strain RC-15

2.3 菌株RC-15的培養(yǎng)條件探究

2.3.1 碳源

碳源是為微生物提供能量的必要元素，不同碳源在微生物代謝中地位不同。探究菌株RC-15在不同碳源環(huán)境下的脫氮能力。圖4顯示：培養(yǎng)72 h后，與其余4種碳源相比在以蛋白胨為碳源時菌株的OD值(生物量)最大，其次是乙酸鈉，說明在乙酸鈉和蛋白胨兩種碳源條件下菌株的生長狀態(tài)較好。同時，隨著OD值的增加，該菌株的反硝化速率也增加，以蛋白胨和乙酸鈉為碳源時硝氮的去除率分別達(dá)到99.80%和99.06%，且亞硝氮的積累量最少，說明該菌株在這兩種碳源培養(yǎng)條件下反硝化能力最強(qiáng)。因此得出菌株RC-15最優(yōu)碳源為乙酸鈉和蛋白胨。

圖4 72 h時菌株RC-15生長量(OD600)、硝氮濃度和亞硝氮濃度變化Figure 4 The growth of strain RC-15 (OD600) and variation of nitrate and nitrite concentration during 72 h cultivation

2.3.2 溫度

菌株RC-15在不同溫度條件下的生長情況和反硝化能力如圖5所示，培養(yǎng)72 h后，對比不同溫度條件下該菌株的脫氮能力，發(fā)現(xiàn)其在30 ℃下OD值最大、硝氮的去除率最高且亞硝氮積累量最低，說明其在30 ℃條件下脫氮能力最強(qiáng)。同時發(fā)現(xiàn)低溫(10 ℃和15 ℃)條件對OD值有明顯的抑制，說明該菌株對環(huán)境溫度非常敏感且低溫下該菌株的生長較差。但是，該菌株在低溫下72 h時硝氮的去除率分別為27.44%和42.89%，說明其在低溫下也能進(jìn)行脫氮，為低溫條件下處理硝酸鹽廢水提供了保障。綜上所述，菌株RC-15適宜的環(huán)境溫度為30 ℃，且能在低溫下(10 ℃和15 ℃)完成反硝化過程。

圖5 72 h時菌株RC-15生長量(OD600)、硝氮濃度、亞硝氮濃度的變化Figure 5 The growth of strain RC-15 (OD600) and variation of nitrate and nitrite concentration during 72 h cultivation

2.3.3 pH值

圖6 72 h時菌株RC-15生長量(OD600)、硝氮濃度、亞硝氮濃度和pH值變化Figure 6 The growth of strain RC-15 (OD600) and variation of nitrate and nitrite concentration and pH values during 72 h cultivation

2.3.4 碳氮比

碳氮比是影響反硝化脫氮的重要指標(biāo)[25]。圖7顯示，當(dāng)碳氮比為5、7、10和15時，菌株的OD值和硝氮去除率均明顯提升，僅有少量亞硝氮積累，均有TOC的剩余。當(dāng)碳氮比為7時，該菌株的反硝化能力最強(qiáng)，說明碳源充足時菌株的生長能力和反硝化能力都顯著增強(qiáng)。

圖7 不同碳氮比對菌株RC-15生長量(OD600)、硝氮濃度、亞硝氮濃度和總有機(jī)碳(TOC)濃度的影響Figure 7 Different C/N ratio on growth (OD600) andnitrate concentration and nitrite and total organic carbon (TOC) concen- tration ofstrain RC-15 influence

在低碳源條件下(碳氮比為1和3)，該菌株的OD值和硝氮的去除率都不理想，且都有明顯的亞硝氮積累。同時發(fā)現(xiàn)在低碳源條件下72 h時培養(yǎng)環(huán)境的TOC剩余濃度極低，幾乎被菌株消耗殆盡。說明在低碳源條件下，菌株的生物量和脫氮效率都會受到明顯抑制。綜上所述，碳氮比為7時，菌株RC-15反硝化能力最強(qiáng)，且在碳氮比較低的環(huán)境中也能進(jìn)行反硝化過程。

2.3.5 菌株RC-15最優(yōu)脫氮性能

探究菌株RC-15在上述最優(yōu)條件(乙酸鈉、30 ℃、初始pH值為8.0和碳氮比為7)下的生長情況和反硝化能力。圖8顯示，菌株的反硝化能力與上述實驗相比得到了明顯提升，但是，菌株的OD值與先前實驗相比增長緩慢，結(jié)合該菌株培養(yǎng)環(huán)境中的亞硝氮濃度分析其原因，發(fā)現(xiàn)在12～36 h培養(yǎng)環(huán)境中有大量亞硝氮積累，且亞硝氮積累量均超過50 mg/L。有研究表明，高濃度亞硝酸鹽(50 mg/L)會抑制細(xì)菌的生長[25]。

圖8 48 h時菌株RC-15生長量(OD600)、硝氮濃度、亞硝氮濃度、總氮(TN)濃度、總有機(jī)碳(TOC)濃度和pH值的變化Figure 8 The growth of strain RC-15 (OD600) and variation of nitrate and nitrite and total organic(TN) carbon (TOC) concen-tration and pH during 72 h cultivation

結(jié)合培養(yǎng)環(huán)境的硝氮和總氮去除率分析培養(yǎng)環(huán)境中亞硝氮濃度明顯增多的原因，發(fā)現(xiàn)24 h時培養(yǎng)環(huán)境硝氮的去除率達(dá)到95.57%，對應(yīng)的去除速率達(dá)到14.62 mg/(L·h)，48 h時菌株的硝氮和總氮的去除率分別達(dá)到96.31%和82.84%。所以推測其培養(yǎng)環(huán)境中亞硝氮濃度明顯增多的原因是該菌株的硝氮去除效果顯著增加。此外，通過對比該菌株培養(yǎng)環(huán)境不同時刻的pH值，發(fā)現(xiàn)48 h時的pH值與初始pH值相比有明顯的增長，說明該菌株在反硝化過程中會導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境pH值升高。在48 h內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境的TOC濃度共消耗392.38 mg/L，且在起初的12 h內(nèi)消耗了285.83 mg/L，消耗碳源較多，說明該菌株需要利用大量碳源來維持自身的生長。

通過對菌株生長的環(huán)境因子進(jìn)行優(yōu)化后菌株對硝氮和總氮的去除效果良好，24 h時硝氮的去除率達(dá)到95.57%，對應(yīng)的硝氮去除速率達(dá)到14.62 mg/(L·h)，其硝氮的去除速率與篩選時[4.09 mg/(L·h)]相比提升顯著。

3 討論

目前，利用反硝化菌進(jìn)行脫氮的工藝已經(jīng)成為污水處理的熱門工藝，反硝化機(jī)理研究的報道也越來越多，但是，大多數(shù)學(xué)者對好氧反硝化菌的脫氮特性的微觀研究并不多。研究從植物根際土壤中篩選分離出好氧反硝化菌株RC-15，對其進(jìn)行微觀形態(tài)觀察并鑒定為豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)。PCR測序得到反硝化基因napA、nirK，確定該菌株的好氧反硝化能力。此外，對norB和nosZ基因也進(jìn)行了擴(kuò)增，但未得到產(chǎn)物。norB和nosZ基因是常見的反硝化基因，負(fù)責(zé)編碼一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶[19]。通過對比菌株RC-15與其他菌株的功能基因，發(fā)現(xiàn)其不同的反硝化菌對應(yīng)的功能基因也不同，Xia等[20]和陳茂霞等[22]鑒定出Acinetobactersp.ND7菌株和Aeromonassp.HN-02菌株具有napA基因；Su等[19]鑒定出Comamonassp.YSF15菌株具有nirS基因，可以看出不同反硝化菌株的功能酶基因也不同。雖然研究未得到norB和nosZ的基因產(chǎn)物，但是否能認(rèn)定該菌株不會產(chǎn)生這兩種反硝化酶(一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶)。據(jù)報道，nirS基因具有催化硝氮轉(zhuǎn)化為氮氣的能力[20]；P450nor等也屬于反硝化酶基因[26]。故此，可能還存在其他反硝化酶基因未被鑒定出，且脫氮能力與其功能基因表達(dá)的強(qiáng)弱有關(guān)，生物脫氮的最終目的應(yīng)致力于將氮元素轉(zhuǎn)化為對環(huán)境無害的氮氣，其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

在宏觀層面，大多數(shù)反硝化菌的脫氮過程受環(huán)境限制，導(dǎo)致反硝化過程不穩(wěn)定且效率不高，研究通過單因素?fù)u瓶試驗發(fā)現(xiàn)菌株RC-15可以在低溫環(huán)境、弱酸性環(huán)境和低碳氮比條件下進(jìn)行脫氮。當(dāng)碳源為乙酸鈉，溫度為30 ℃、初始pH值為8.0、碳氮比為7時，菌株的生長和脫氮能力較好，24 h時硝氮的去除率達(dá)到95.57%，對應(yīng)的硝氮的去除速率達(dá)到14.62 mg/(L·h)。將菌株RC-15的脫氮能力與相關(guān)反硝化菌的脫氮能力[2,13-14,22,27]對比發(fā)現(xiàn)：該菌株的脫氮能力超過了以往的大多數(shù)菌株，具有良好的脫氮工藝應(yīng)用前景，且該菌株是從當(dāng)?shù)貙嶋H廢水中提取的土著優(yōu)勢菌株，為后續(xù)利用高效反硝化菌株強(qiáng)化實際污水中的脫氮研究提供新型菌源。