李璇，馬偉雄 ，陳文璞 ，湯金榮 ，俞國(guó)鋒 ，陳忠 ，2

1.上海市第六人民醫(yī)院金山分院泌尿外科，上海 201599；2.上海市第六人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200030

前列腺癌是世界范圍內(nèi)排名第5 位的惡性腫瘤，雖然手術(shù)治療對(duì)于局限性前列腺癌有效，但15% ～35%的前列腺癌患者最終會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移［1-2］。骨是前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)的部位，約90%的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者有骨骼病變。骨轉(zhuǎn)移依賴(lài)于前列腺癌細(xì)胞、骨髓微環(huán)境、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)作用［3-5］。原發(fā)組織的前列腺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并獲得骨樣表型，在骨組織中轉(zhuǎn)移。激素消融治療是轉(zhuǎn)移性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。大多數(shù)接受雄激素消融治療的前列腺癌患者最終會(huì)在1 ～3年內(nèi)發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），中位生存時(shí)間為12年。當(dāng)骨轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時(shí)，前列腺特異性抗原進(jìn)展的中位時(shí)間顯著縮短［6］。前列腺癌骨轉(zhuǎn)移形成成骨細(xì)胞病變，其特征是骨生成增加［7］。一些參與富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白1（cysteine and glycine-rich protein 1，CSRP1）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白參與了前列腺腫瘤誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活性［8］，提示靶向CSRP1 信號(hào)的小分子可能是前列腺癌轉(zhuǎn)移的有效干預(yù)。

CSRP1 蛋白是CSRP 家族成員，在中胚層及其衍生物中表達(dá)［9］。CSRP 蛋白的特征性結(jié)構(gòu)是具有2個(gè)LIM 結(jié)構(gòu)域及1個(gè)保守的甘氨酸富集區(qū)域，LIM結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)保守的雙鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有進(jìn)化保守性，存在于多種具有獨(dú)特生物學(xué)作用的蛋白質(zhì)中［10］。LIM 結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是胞質(zhì)和細(xì)胞核中蛋白-蛋白相互作用的中介。目前已知這些與特定蛋白伴侶的相互作用會(huì)影響其亞細(xì)胞定位和活性。CSRP1 蛋白與 Dis-hevelled 2（Dvl2）和 Diversin（Div）相互作用，后者通過(guò)非經(jīng)典Wnt 和JNK 途徑控制細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程［11］，包括細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、分化、代謝、存活和衰老［12-13］。當(dāng) CSRP1信息被敲除時(shí)，會(huì)引起異常的收斂性伸長(zhǎng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致中線結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形。有研究報(bào)道，CSRP1 參與了特發(fā)性肺纖維化的進(jìn)展，而特發(fā)性肺纖維化患者發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［14］。此外，有研究表明，肝癌中CSRP1 基因可通過(guò)異常甲基化在肝癌中失活，提示其可能是惡性腫瘤的重要生物標(biāo)志物［15］。隨著研究的深入，CSRP1 可能會(huì)成為新型分子標(biāo)志物，對(duì)許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有較大的提示意義。但有關(guān)CSRP1 在前列腺癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究旨在探討CSRP1 在前列腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集2018年1 月 — 2019年1 月在我院經(jīng)病理診斷確認(rèn)為前列腺癌并進(jìn)行手術(shù)切除的30例前列腺癌患者組織和相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，且所有患者均未接受內(nèi)分泌和放化療治療，從手術(shù)中獲得的組織標(biāo)本存儲(chǔ)于液氮中。本研究獲得上海市第六人民醫(yī)院金山分院人體研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者均獲得書(shū)面知情同意書(shū)。所有標(biāo)本均按照倫理和法律標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行匿名處理。

1.2 細(xì)胞 人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1、前列腺癌PC-3 和LNCaP 細(xì)胞系均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。

1.3 主要試劑 無(wú)角質(zhì)形成細(xì)胞血清培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基和OPTI-MEMI 培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gbico 公司；熒光定量PCR 反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自日本 TaKaRa 公司（RR047A ／ RR420A）；兔抗人CSRP1 多抗（ab175319）和小鼠抗人 GAPDH 單抗（ab8245）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；兔抗人E-cadherin單抗（#1702-1）購(gòu)自美國(guó)Epitomics 公司；兔抗人Vimentin 多抗（sc-5565）購(gòu)自美國(guó) Santa 公司；ECL 熒光底物試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 用含1%青鏈霉素雙抗的無(wú)角質(zhì)形成細(xì)胞血清培養(yǎng)基培養(yǎng)正常人前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1，含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC-3 和LNCaP 細(xì)胞。所有細(xì)胞在37 ℃，5% CO2，95%濕度條件下培養(yǎng)。

1.5 前列腺癌組織中CSRP1 表達(dá)水平的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。固定臨床前列腺癌標(biāo)本，石蠟包埋，冰凍切片機(jī)切成5 mm 厚度的切片，并按照標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)進(jìn)行染色。通過(guò)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度綜合進(jìn)行免疫反應(yīng)性評(píng)分（immune reactivity score，IRS）。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞0 ～ 5%為 0 分，6% ～ 25%為 1 分，26% ～ 50%為 2分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分；染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性為0 分，微弱為1 分，中等為2 分，強(qiáng)為3 分。每個(gè)病例的最終IRS=百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。

1.6 前列腺癌細(xì)胞中CSRP1 表達(dá)水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR。Trizol ／ 氯仿 ／ 異丙醇法提取RWPE-1、PC-3、LNCaP 細(xì)胞總 RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Primer Premier 軟件設(shè)計(jì)引物，CSRP1 基因上游引物：5′-TGCCGAAGAGGTTCAGTGC-3′，下游引物：5′-AGCAGGACTTGCAGTAAATCTC-3′；內(nèi)參 GAPDH 基因上游引物：5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′，下游引物：5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′，引物由上海捷瑞有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 min；95 ℃變性 12 s，60 ℃退火、延伸 12 s，共 40個(gè)循環(huán)。記錄各樣品中目的基因及內(nèi)參GAPDH 基因的CT 值，計(jì)算各樣品待測(cè)基因的ΔCT 值（目的基因 CT 值 - GAPDH 基因 CT 值）；以正常組 ΔCT值為參照，得出各組ΔΔCT 值；計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量（變化倍數(shù) = 2-ΔΔCT）。

1.7 CSRP1 基因siRNA 序列的合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù) CSRP1 基因 CDS 序列設(shè)計(jì) siRNA 序列：5′-GTCATTAGTGATATGTGGCTT-3′（siCSRP1），以及無(wú)關(guān)序列：5′-GCUUCGCGCCGUAGUCUUATT-3′（siNC），由上海捷瑞生物科技有限公司合成。于6 孔板中常規(guī)培養(yǎng)PC-3 細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)40% ～60%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入不含血清的OPTI-MEMI 培養(yǎng)基2 mL；再用250 μL OPTI-MEMI 培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine RNAiMAX 6 μL 和 siRNA（60 nmol ／ L），室溫放置 5 min 后，將 Lipofectamine RNAiMAX 與siRNA 混合，室溫放置30 min，充分形成混合物；將混合液加入細(xì)胞板中，混勻后于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 ～6 h，吸棄上清液，更換為RPMI1640 完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

1.8 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CSRP1 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot 法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3 細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗滌3 次，用RIPA 緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)超聲、離心后去除其他細(xì)胞成分，用BCA 蛋白測(cè)定儀測(cè)定蛋白濃度。取各組樣品蛋白40 μg，經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以含5%脫脂奶粉的PBS-T 室溫封閉2 h；加入抗CSRP1 抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)┖涂?GAPDH 抗體（1 ∶5 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；加入HPR 標(biāo)記的山羊抗小鼠、抗兔IgG（1 ∶5 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵?2 h；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，并進(jìn)行灰度值分析。

1.9 沉默CSRP1 表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲能力影響的檢測(cè) 采用Transwell 小室試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3 細(xì)胞（為消除不同組細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，饑餓24 h 使各組細(xì)胞處于同一生長(zhǎng)周期），用胰酶消化，經(jīng)離心、計(jì)數(shù)后制成 1 × 106個(gè) ／ mL 的懸液；提前1 d 將Transwell 板用無(wú)血清培養(yǎng)基水化24 h，試驗(yàn)當(dāng)天取出，在下室中加入750 μL 含10% FBS 的完全培養(yǎng)基，上室加入上述細(xì)胞懸液100 μL（共1 × 105個(gè)細(xì)胞），上室培養(yǎng)基中不含F(xiàn)BS，置37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（根據(jù)不同細(xì)胞調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間）；將小室移至新的Transwell 空白孔，經(jīng)多聚甲醛固定10 min；洗滌后加入0.1%結(jié)晶紫染色10 min；移去染色劑，PBS 輕洗2 次，醫(yī)用棉簽擦去小室內(nèi)表面未穿過(guò)膜的細(xì)胞，將小室置于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取膜上9個(gè)不同視野，計(jì)算穿透膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.10 沉默CSRP1 表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移能力影響的檢測(cè) 采用劃痕試驗(yàn)。于6 孔板中培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá) 80% ～ 90%時(shí)，用 200 μL 黃色槍頭均勻用力進(jìn)行劃痕，PBS 洗滌劃痕后漂浮的細(xì)胞，拍照0 h 以及各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，每次在同一視野下拍照，記錄各時(shí)間點(diǎn)距離0 點(diǎn)細(xì)胞遷移的距離。

1.11 沉默CSRP1 表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞EMT 發(fā)生影響的檢測(cè) 采用Western blot 法。以抗E-cadherin抗體、抗Vimentin 抗體、抗GAPDH 抗體為一抗，其余步驟同1.8 項(xiàng)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立t 檢測(cè)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌組織中CSRP1 的表達(dá)水平 免疫組化結(jié)果顯示，CSRP1 在前列腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，見(jiàn)圖1 和表1。

圖1 免疫組化分析CSPR1在前列腺癌組織中的表達(dá)（×400）Fig.1 Immunohistochemical assay of expression of CSPR1 in prostate cancer tissue（× 400）

表1 臨床前列腺組織中CSRP1 的表達(dá)水平及IRS 評(píng)分Tab.1 Expression level and IRS score of CSRP1 in clinical prostate cancer tissue

2.2 前列腺癌組織中CSRP1 的表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞水平的結(jié)果與臨床標(biāo)本一致，CSRP1 在前列腺癌細(xì)胞 PC-3、LNCaP 中 mRNA 的表達(dá)水平顯著高于正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1（t 分別為 157.5 和 190.2，P 均 ＜ 0.01），見(jiàn)圖 2。

圖2 CSPR1 mRNA 在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.2 Expression level of CSPR1 mRNA in prostate cancer cells

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CSRP1 蛋白的表達(dá) Western blot分析顯示，轉(zhuǎn)染CSRP1 siRNA 序列后，PC-3 細(xì)胞中CSRP1 蛋白的沉默效率達(dá)90%以上，見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染PC-3 細(xì)胞中CSRP1 蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Determination of expression level of CSRP1 in PC-3 cells by Western blot

2.4 沉默CSRP1 表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默CSRP1 表達(dá)后，與siNC 組相比，siCSRP1 組PC-3 細(xì)胞的侵襲率和遷移率均明顯降低（t 分別為-176.4 和 55.4，P ＜0.05），見(jiàn)圖 4 和圖 5。

圖4 Transwell 小室試驗(yàn)檢測(cè)PC-3 細(xì)胞的侵襲能力（×200）Fig.4 Transwell assay of invasion ability of PC-3 cells（× 200）

圖5 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)PC-3 細(xì)胞的遷移能力Fig.5 Scratch test for migration ability of PC-3 cells

2.5 沉默CSRP1 表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞EMT 發(fā)生的影響 Western blot 分析顯示，沉默CSRP1 表達(dá)后，PC-3 細(xì)胞中 E-cadherin 的表達(dá)顯著升高（t=85.6，P ＜ 0.05），而 Vimentin 的表達(dá)明顯受到抑制（t =-79.6，P ＜ 0.05），見(jiàn)圖 6。表明 CSRP1 下調(diào)可抑制前列腺癌EMT 的發(fā)生。

圖6 Western blot 分析 PC-3 細(xì)胞EMT 的發(fā)生Fig.6 Western blotting of EMT in PC-3 cells

3 討 論

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)腫瘤常見(jiàn)的惡性腫瘤，在歐美國(guó)家特別是美國(guó)發(fā)病率較高［16-17］。我國(guó)前列腺癌發(fā)病率較低，但近年來(lái)發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)［18］。前列腺癌在未發(fā)生轉(zhuǎn)移前預(yù)后良好，其5年生存率接近100%，但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移（特別是骨轉(zhuǎn)移），患者5年生存率不到31%［19］。骨轉(zhuǎn)移是前列腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，也是患者最主要的死亡原因之一。超過(guò)60%的晚期前列腺癌患者被發(fā)現(xiàn)有骨轉(zhuǎn)移，尸檢發(fā)現(xiàn)90%以上的前列腺癌患者有骨轉(zhuǎn)移的證據(jù)［20］。目前臨床對(duì)骨轉(zhuǎn)移的治療策略主要集中在并發(fā)癥上，并不能提高骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)期生存率。因此，更好地了解腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有利于治療前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。

CSRP 家族是一組進(jìn)化上相對(duì)保守的蛋白質(zhì)。已有研究證明，該家族中的某一成員是心臟和肌肉發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子［21］。迄今為止，科學(xué)家們已證明在脊椎動(dòng)物中表征的3 種CSRP 均由雙拷貝鋅結(jié)合LIM 結(jié)構(gòu)域和相關(guān)的富含甘氨酸的重復(fù)序列組成。這3 種蛋白與人體多種器官的功能密切相關(guān)，其中CSRP1 已被證實(shí)在多種癌癥和疾病中出現(xiàn)表達(dá)失調(diào)［22-25］。有研究表明，全球低甲基化被認(rèn)為是前列腺癌的常見(jiàn)事件，前列腺癌中CSRP1 的上調(diào)與5′非翻譯區(qū)（UTR）低甲基化有關(guān)，該基因在前列腺癌患者中出現(xiàn)較明顯的過(guò)表達(dá)現(xiàn)象［26］。該發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步證實(shí)，CSRP1 與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究檢測(cè)了CSRP1 在前列腺癌組織中的表達(dá)情況，CSRP1 在前列腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中均主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且CSRP1 在前列腺癌組織中的表達(dá)高于正常癌旁組織。研究還發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺上皮細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞中CSRP1表達(dá)上調(diào)。提示CSRP1 表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。為了確定CSRP1 在前列腺癌中的作用，本研究轉(zhuǎn)染靶向CSRP1 基因的siRNA 沉默其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSRP1 沉默后抑制了前列腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力，上調(diào)E-cadhefin 表達(dá)并抑制Vimentin表達(dá)水平，抑制了EMT 的發(fā)生，表明CSRP1 可能是防治前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。