楊越，李雪嬌，郭騏源，郭丹丹，郭軒麟，吳業(yè)紅

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130012

目前，大部分流感疫苗采用雞胚工藝進(jìn)行生產(chǎn)，該生產(chǎn)工藝成熟、可靠，但存在許多不可控因素，如疫苗毒株易變異、雞胚質(zhì)量差異大、生產(chǎn)過程質(zhì)量控制難度高、勞動強度大，且產(chǎn)量受雞胚供應(yīng)限制［1-3］。因此，WHO 積極推薦各國發(fā)展以哺乳動物細(xì)胞作為基質(zhì)的細(xì)胞流感疫苗代替雞胚流感疫苗［3-4］。2007年，國外已有MDCK 細(xì)胞流感疫苗上市，臨床應(yīng)用結(jié)果顯示，安全性與雞胚流感疫苗相當(dāng)，且有效性更具優(yōu)勢，特別是針對H3N2 毒株的保護(hù)力明顯強于雞胚流感疫苗［5-6］。

細(xì)胞流感疫苗需采用傳代細(xì)胞系（如MDCK 細(xì)胞）作為生產(chǎn)基質(zhì)，細(xì)胞本身具有成瘤性，因此，將殘余宿主DNA 和蛋白含量降至最低是該疫苗下游純化工藝的重點。雞胚流感疫苗中常用的層析介質(zhì)如分子篩Sepharose 4FF 對去除殘余DNA 的效果較差［7］，因此，急需尋找新型層析介質(zhì)用于細(xì)胞流感疫苗下游純化工藝。親和層析介質(zhì)Cellufine Sulfate由70 μm 纖維素微珠以低濃度的硫酸酯為配體，能夠特異性結(jié)合抗凝血酶Ⅲ、凝血因子、多種酶及多種病毒［8］。國外有文獻(xiàn)報道，硫酸基團(tuán)能特異性吸附流感病毒，可去除MDCK 細(xì)胞流感疫苗中99%的殘留DNA 及69%的殘留宿主蛋白［9］，國外企業(yè)已將該工藝應(yīng)用于細(xì)胞流感疫苗的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)中。本研究以親和層析介質(zhì)Cellufine Sulfate 作為純化介質(zhì)，建立MDCK 細(xì)胞流感病毒的層析工藝，以期為細(xì)胞流感疫苗大規(guī)模純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒液 MDCK 細(xì)胞流感病毒液（批號分別為：SGPBY202104、SGPBY202105、SGPBY202206）由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗六室制備。

1.2 主要試劑及儀器 宿主細(xì)胞殘留DNA 樣本前處理試劑盒及MDCK 細(xì)胞DNA 殘留量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）購自湖州申科生物技術(shù)有限公司；MDCK 宿主蛋白殘留量檢測試劑盒購自美國賽納斯科技公司；抗原標(biāo)準(zhǔn)品（19 ／ 322）及抗體標(biāo)準(zhǔn)品（16 ／ 158）均購自英國 NIBSC；AKTA pure150 及Sepharose 4FF 層析介質(zhì)均購自美國GE 公司；層析介質(zhì)Cellufine Sulfate 購自日本JNC 公司；層析柱BXK16 ／ 20 及 50 ／ 1000 均購自博格隆生物技術(shù)有限公司。

1.3 親和層析條件的優(yōu)化

1.3.1 洗脫緩沖液鹽濃度 用磷酸緩沖液平衡Cellufine Sulfate 層析柱5 ～8個柱體積，至紫外檢測器歸零后上樣（共檢測3 批MDCK 細(xì)胞流感病毒液，批號同 1.1 項），線性流速為 100 cm ／ h；磷酸緩沖液中分別添加不同濃度NaCl（0.5、1、1.5 mol／L）作為洗脫液進(jìn)行目的蛋白洗脫，波長280 nm 紫外吸光值上升時開始收樣，下降后結(jié)束收樣，檢測血凝素（hemagglatinin，HA）含量、宿主DNA 殘留量和宿主蛋白殘留量，并計算HA 回收率、宿主DNA 去除率及宿主蛋白去除率。用0.1 mol／L NaOH 以100 cm ／h 的流速沖洗2個柱體積，保存至0.01 mol／L 的NaOH 中。

1.3.2 線性流速 按1.3.1 項方法上樣后，線性流速分別設(shè)為 50、100、150 cm ／ h，采用最佳鹽濃度的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，其他檢測步驟及檢測項目同1.3.1 項。

1.3.3 樣品濃縮倍數(shù) 將樣品進(jìn)行1、2 及5 倍超濾濃縮，采用最佳線性流速進(jìn)行上樣，最佳鹽濃度的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，其他檢測步驟及檢測項目同1.3.1 項。

1.4 動態(tài)結(jié)合載量 按1.3.1 項方法連續(xù)上樣40個柱體積，采用最佳鹽濃度的平衡緩沖液及線性流速進(jìn)行洗脫，流穿峰起峰后開始分段收集，檢測HA含量，并按下式計算QB，10%的動態(tài)結(jié)合載量。

式中QB，10%為10%穿透水平下的動態(tài)結(jié)合載量（μg ／ mL），VA 為 10%穿透水平的進(jìn)料體積（mL），C0 為進(jìn)料中 HA 的含量（μg ／ mL），VC 為柱體積。

1.5 親和層析優(yōu)化條件的驗證 采用最佳親和層析條件純化3 批細(xì)胞流感病毒液（SGPBY202104、SGPBY202105、SGPBY202206），檢測項目同 1.3.1 項。

1.6 與其他層析介質(zhì)的比較 Sepharose 4FF 柱體積1 800 mL，上樣體積100 mL，上樣緩沖液為平衡緩沖液 0.01 mol ／ L PBS（pH 7.4），上樣流速為60 cm ／ h，280 nm 紫外吸光值開始上升時收樣，下降后結(jié)束收樣；親和介質(zhì)采用已確定的最佳條件，上樣體積為100 mL，其他檢測步驟同1.3.1 項。采用兩種層析介質(zhì)純化細(xì)胞流感病毒液（SGPBY202105），檢測項目同1.3.1 項。

1.7 純化樣品的檢定

1.7.1 HA 含量 采用《中國藥典》四部（2020 版）中的單向免疫擴散實驗［10］。將抗原標(biāo)準(zhǔn)品與純化樣品分別加入含有抗體標(biāo)準(zhǔn)品的1.5%瓊脂糖凝膠板上，20 ～ 25 ℃放置 18 h 以上；用 0.01 mol ／ L PBS 浸泡1 h；干燥、染色、脫色。以抗原標(biāo)準(zhǔn)品形成的沉淀環(huán)直徑對其相應(yīng)抗原濃度建立直線回歸方程，代入供試品的沉淀環(huán)直徑，計算HA 含量。

1.7.2 宿主DNA 殘留量 采用宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒及MDCK 殘留DNA 檢測試劑盒檢測純化樣品中的宿主DNA 殘留量。

1.7.3 宿主蛋白殘留量 采用MDCK 宿主蛋白殘留量檢測試劑盒檢測純化樣品中的宿主蛋白殘留量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析方法，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 最佳親和層析條件

2.1.1 洗脫液鹽濃度 隨著洗脫液鹽濃度的升高，純化產(chǎn)物的宿主蛋白去除率呈上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F = 0.263，P = 0.797）；宿主 DNA 去除率變化較小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F = 0.808，P =0.466）；HA 回收率則顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 5.291，P = 0.030）。見圖 1 和表 1。因此，選擇1.5 mol ／ L 為最佳洗脫液鹽濃度。

圖1 不同鹽濃度洗脫液的層析圖譜Fig.1 Chromatogram of purified virus eluted with eluent at different salt concentrations

表1 不同鹽濃度洗脫液的純化效果（%，，n = 3）Tab.1 Purification effects of virus eluted with eluent at different salt concentrations（%，，n = 3）

表1 不同鹽濃度洗脫液的純化效果（%，，n = 3）Tab.1 Purification effects of virus eluted with eluent at different salt concentrations（%，，n = 3）

鹽離子濃度（mol ／ L）0.5 66.61 ± 10.61 99.93 ± 0.02 29.34 ± 2.82 1 67.39 ± 13.90 99.70 ± 0.25 52.87 ± 7.67 1.5 70.99 ± 15.39 99.80 ± 0.17 59.53 ± 12.28宿主蛋白去除率宿主DNA去除率 HA 回收率

2.1.2 線性流速 50、100、150 cm ／ h 3 種線性流速純化產(chǎn)物的的宿主蛋白去除率、宿主DNA 去除率及HA 回收率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F 分別為3.260、0.726、2.170，P 分別為 0.797、0.522、0.165），見圖2 和表2。因此，選擇HA 回收率最高的100 cm ／ h為親和層析的最佳線性流速。

表2 不同線性流速的純化效果（%，，n = 3）Tab.2 Purification effects of virus at different linear flow rates（%，，n = 3）

表2 不同線性流速的純化效果（%，，n = 3）Tab.2 Purification effects of virus at different linear flow rates（%，，n = 3）

線性流速（cm ／ h）50 66.61 ± 10.61 99.83 ± 0.14 53.08 ± 2.38 100 67.39 ± 13.90 99.79 ± 0.30 64.24 ± 16.99 150 70.99 ± 15.39 99.95 ± 0.01 53.43 ± 0.34宿主蛋白去除率宿主DNA去除率 HA 回收率

圖2 不同線性流速的層析圖譜Fig.2 Chromatogram of purified virus at different linear flow rates

2.1.3 樣品濃縮倍數(shù) 1、2、5 倍 3 種濃縮倍數(shù)純化產(chǎn)物的宿主DNA 去除率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F =1.929，P = 0.195）；但隨著濃縮倍數(shù)的升高，宿主蛋白去除率明顯降低（F = 3.901，P = 0.032）；HA 回收率顯著升高（F = 3.599，P = 0.046）。見圖 3 和表 3。因此，確定樣品的最佳濃縮倍數(shù)為5 倍。

圖3 不同濃縮倍數(shù)的層析圖譜Fig.3 Chromatogram effects of samples at different concentration folds

表3 不同濃縮倍數(shù)的純化效果（%，，n = 3）Tab 3.Purification effects of samples at different concentration folds（%，，n = 3）

表3 不同濃縮倍數(shù)的純化效果（%，，n = 3）Tab 3.Purification effects of samples at different concentration folds（%，，n = 3）

濃縮倍數(shù) 宿主蛋白去除率 宿主DNA 去除率 HA 回收率1 87.71 ± 7.75 99.20 ± 0.74 39.93 ± 21.93 2 83.14 ± 2.34 99.89 ± 0.03 72.67 ± 15.67 5 70.4 ± 16.91 99.75 ± 0.15 80.74 ± 34.34

2.2 動態(tài)結(jié)合載量 上樣35個柱體積后流穿紫外值明顯上升，此時HA 含量為56 μg／mL；上樣至925 mL時發(fā)生10%穿透，親和層析結(jié)合 HA 的 QB，10%為2 072 μg ／ mL 介質(zhì)。見圖 4。

圖4 動態(tài)結(jié)合載量Fig.4 Dynamic binding capacity

2.3 親和層析最佳條件的驗證 3 批細(xì)胞流感病毒液在最佳條件下純化后，宿主DNA 去除率均達(dá)99%以上，宿主蛋白質(zhì)去除率達(dá)70%以上，HA 回收率達(dá)80%以上，該條件對雜質(zhì)去除和HA 回收均較穩(wěn)定，見表4。

表4 最佳層析條件驗證（%）Tab 4.Verification of optimal condition for affinity chromatography（%）

2.4 與其他層析介質(zhì)的比較 親和層析Cellufine Sulfate 和分子篩Sepharose 4FF 純化的宿主蛋白去除率分別為77.44%和87.04%，宿主DNA 去除率分別為97.35%和69.01%，HA 回收率分別為84.96%和55.59%。表明Sepharose 4FF 在宿主蛋白去除效果上有優(yōu)勢，親和層析Cellufine Sulfate 在HA 回收和宿主DNA 去除效果更佳。

3 討 論

由于層析的類型多樣且分離效果理想，目前已成為生物制品生產(chǎn)及研究領(lǐng)域中的主要純化方法。其中親和層析和凝膠過濾層析又稱分子篩層析和離子交換層析，是流感病毒的主要純化方法［11］。細(xì)胞流感疫苗在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生許多影響制品效果和質(zhì)量的雜質(zhì)，從監(jiān)管與安全的角度出發(fā)，一直以來，宿主殘留蛋白質(zhì)和宿主殘留DNA 在內(nèi)的宿主殘余雜質(zhì)受到格外關(guān)注［12-13］。因此，宿主蛋白和DNA 去除率是MDCK 細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒的重要評價指標(biāo)。

研究表明，凝膠過濾層析Sepharose 4FF 對細(xì)胞基質(zhì)流感病毒液的雜質(zhì)蛋白與宿主殘留DNA 的去除率僅為65%和66%［14］；以兩種基于甲基丙烯酸酯的強陰離子交換樹脂GigaCap Q-650M 和NH2-750F 的離子交換層析對HA 回收率和宿主DNA 去除率不穩(wěn)定，且無法實現(xiàn)兩者同時獲得較好的純化效果［15-17］。本研究對親和層析Cellufine Sulfate 純化流感病毒的上樣流速、洗脫液鹽濃度及樣品濃縮倍數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳線性流速為100 cm ／ h，洗脫液最佳鹽濃度為1.5 mol ／ L，最佳樣品濃縮倍數(shù)為5倍。在最佳層析條件下，純化流感病毒的宿主DNA去除率達(dá)99%以上，宿主蛋白去除率達(dá)80%以上，HA 回收率達(dá)70%以上，在確保HA 回收率較高的情況下，可同時獲得較好的雜質(zhì)去除效果，且親和層析Cellufine Sulfate 的HA 回收和宿主DNA 去除效果更優(yōu)于分子篩Sepharose 4FF。本實驗為細(xì)胞流感疫苗的下游純化研究提供了實驗依據(jù)，為大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞流感疫苗奠定了基礎(chǔ)。