肖雪梅，曾冬燕，邱 妹，秦 菁，黃 玲

（湯臣倍健股份有限公司，廣東 珠海 519040）

由于黃曲霉素是一種致癌物質(zhì)，如果不小心誤食了黃曲霉素，積累過多會導(dǎo)致身體內(nèi)的癌細(xì)胞病變，從而導(dǎo)致癌癥。一些食物含有黃曲霉素，消費者一定要先了解食物所含成分再吃。檢測黃曲霉毒素的方法有很多，如薄層分析法（TLC）、液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[1-5]，現(xiàn)在主要研究酶聯(lián)免疫法（ELISA），因為該方法具有檢測速度快、靈敏性高、選擇性強等優(yōu)點，但該方法會存在假陽性的現(xiàn)象，而且試劑盒需低溫保存、只能用1 次，不能循環(huán)使用[6-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

酶標(biāo)儀（Multiskan FC）；離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；洗板機（Thermo）。

黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，河北伊萊莎生物技術(shù)有限公司提供；氯化鈉、無水甲醇、三氯甲烷、無水硫酸鈉，廣州化學(xué)試劑廠提供；實驗室用水（純化水）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

70%甲醇/水溶液體積比70∶30。

1.2.2 樣品前處理

①稱取5 g 樣品于50 mL 離心管中，加0.5 g NaCl，再加入25 mL 甲醇/水溶液；②蓋好蓋子高速振蕩3 min（或搖床振蕩 10～15 min），靜置 5 min（或以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心5 min） 后用定量濾紙過濾，收集濾液，此為樣品待檢液。注意：如果收集的濾液顏色比較深，則需要提油。提油的方法為吸取中層甲醇/水溶液4 mL 于分液漏斗中，加8 mL三氯甲烷，振搖2 min，靜置分層，將下層三氯甲烷層盡量完全放入第2 只分液漏斗中，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分成。采取相同的方法，在分液漏斗中再加5 mL 三氯甲烷，收集三氯甲烷層一并經(jīng)盛有約10 g 預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的定量慢性濾紙過濾于50 mL 圓底燒瓶中，最后用少量三氯甲烷清洗過濾裝置，洗滌于圓底燒瓶中，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在65 ℃條件下蒸干，加入70%甲醇/水溶液4 mL 后溶解，為待檢液。

1.2.3 免疫檢測程序

（1） 清洗液的準(zhǔn)備。根據(jù)需要量將濃縮液稀釋10 倍，取10 mL 10 倍濃縮清洗液到90 mL 蒸餾水中混勻待用。配好的清洗液倒入帶蓋容器中于室溫下保存，下次試驗可以再用（注意不要污染）。

（2） 回溫。從冰箱取出試劑盒，讓試劑盒恢復(fù)至室溫后，分別取出所需要的測試孔和混合孔。

（3） 加板。第一步，加入100 μL 酶標(biāo)記物（Conjugate Solution）到每個混合孔中；第二步，加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)及樣品到相應(yīng)混合孔中，混勻，用移液器轉(zhuǎn)移100 μL 到相應(yīng)的測試孔；第三步，加入50 μL 抗體（Antibody Solution） 到相應(yīng)的每個微孔中，注意使用一次性吸頭防止交叉污染。

（4） 反應(yīng)。室溫下讓測試孔避光反應(yīng)10 min。

（5） 洗板。用洗板機進(jìn)行洗板，先在洗板機上設(shè)置好洗4 次板、重復(fù)3 次的程序，在緩沖液瓶裝上所對應(yīng)的緩沖液，根據(jù)實際情況選擇所需要的列數(shù)，按“START”鍵進(jìn)行洗板。

（6） 顯色。在每個反應(yīng)孔中加入100 μL 底物溶液（Substrate Solution），室溫下反應(yīng)5 min（如果顏色淺可適當(dāng)延長顯色時間）。

（7） 終止。每孔中加入 100 μL 停止液 （Stop Solution）。

（8） 儀器測定。于波長450 nm 處酶標(biāo)儀讀取吸光度。

1.2.4 影響因素及注意事項

（1） 試劑盒里面的混合杯存在有抗體的風(fēng)險，所以建議不用試劑盒自帶的混合杯，否則會影響吸光度的結(jié)果。

（2） 洗板機的固定規(guī)格是8×12 個孔，如果做樣的時候列數(shù)沒有8 個，需要用混合杯補夠8 個孔，再進(jìn)行洗板。如果洗完板發(fā)現(xiàn)沒有完全干，可以用吹風(fēng)機進(jìn)行吹干。

（3） 在每個檢測步驟進(jìn)行加樣或試劑時要直接加到反應(yīng)孔的底部，不能加到孔壁上，同時加完之后不能有氣泡。

（4） 在顯色時加100 μL 底物溶液的時候，這個過程需要快，如果樣品超過20 份的數(shù)量，建議用多道移液槍進(jìn)行加液，以防做出來的標(biāo)準(zhǔn)不呈梯度。

（5） 對于不同批次的試劑盒，里面的反應(yīng)孔和試劑不能混用。

（6） 對于用完的試劑盒和有接觸到標(biāo)樣的器皿，不能直接扔掉，都需要用5%次氯酸鈉或漂白粉浸泡半天后再進(jìn)行處理，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的檢測

該試劑盒有5 個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別為0，2.0，4.0，12.5，50.0 μg/L，于是隨機選了3 個不同的原料和2 個成品用上述所描述的方法進(jìn)行檢測.

酶標(biāo)儀檢測的結(jié)果見表1。

表1 酶標(biāo)儀檢測的結(jié)果

結(jié)果將由酶標(biāo)儀（Multiskan FC） 的軟件根據(jù)5 個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度來繪制ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度和吸光度做出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出樣品中的黃曲霉B1具體的含量，5 個樣品的標(biāo)準(zhǔn)參照＜4 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行判定。

ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由表1 的吸光度和圖1 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可以看出，這5 個樣品的黃曲霉毒素的結(jié)果都低于相應(yīng)的允許限量，屬于陰性樣品，說明該保健食品中3 個原料和2 個成品的黃曲霉B1含量都沒有超標(biāo)。

圖1 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品中黃曲霉毒素B1含量見表2。

表2 樣品中黃曲霉毒素B1 含量

2.2 回收率與精密度

2.2.1 回收率

由國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.24—2016 第四法酶聯(lián)免疫法規(guī)定選取大豆分離蛋白或其他穩(wěn)定的陰性樣品，根據(jù)所購買的黃曲霉試劑盒的檢出限，在陰性條件中添加3 個不同濃度水平的AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照說明書操作方法，用讀數(shù)儀讀數(shù)。于是選取了不同品種的產(chǎn)品對河北伊萊莎黃曲霉毒素B1檢測試劑盒進(jìn)行驗收，測定回收率。

AFTB1 標(biāo)準(zhǔn)液回收率見表3，不同產(chǎn)品回收率見表4。

表3 AFTB1 標(biāo)準(zhǔn)液回收率

表4 不同產(chǎn)品回收率

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016 中規(guī)定，針對每個加標(biāo)濃度，回收率在50%～120%允許范圍內(nèi)的該批次試劑盒均可使用。綜合表3 和表4 的結(jié)果可以看出，其回收率范圍都在規(guī)定的范圍內(nèi)。

2.2.2 精密度

為了符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016 精密度的要求，于是對該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。

檢測結(jié)果見表5。

表5 檢測結(jié)果

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016 中規(guī)定其分析結(jié)果的相應(yīng)相差應(yīng)不大于20%。于是，其精密度也是在允許的范圍內(nèi)。

2.3 結(jié)果與分析

由表1、圖1、回收率和精密度可看出，酶聯(lián)免疫法測保健食品中的黃曲霉毒素B1具有靈敏度高、特異性強、回收率和精密度都比較高的超微量分析技術(shù)，且結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求和客戶的需求。

3 結(jié)語

黃曲霉毒素雖然可怕，也存在于很多地方，但在保健食品中還是挺安全的，而測定黃曲霉的方法有多種，但酶聯(lián)免疫法一直以來都被許多科研工作者認(rèn)可及推崇，該方法是一種敏感性高、特異性強、重復(fù)性好的試驗判定方法。由于該方法是一種限量方法，所以能快速檢測出保健食品中黃曲霉毒素是否在合格的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。該方法的使用使我國在保健食品行業(yè)中測定黃曲霉毒素提高到一個新的水平[10-14]。