蔡 娜 沈 佳 史巧巧

（江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212003）

真菌毒素是一類由絲狀真菌所產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，其種類繁多，存在廣泛，大部分具有致癌、致畸、致突變等作用，在極低含量時即可對人體健康與安全構(gòu)成巨大威脅。嘔吐毒素（DON）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，于1972年由日本的Morooka 等首次分離，其污染率和污染水平居單端孢霉烯族毒素之首，并常與其他真菌毒素協(xié)同作用于人體，產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。DON 能侵染大麥、小麥、玉米等谷類作物，可以在糧食生長、收獲、儲存、加工乃至運輸?shù)攘鞒讨羞M(jìn)行侵染，產(chǎn)生真菌毒素，更可以通過動物代謝作用進(jìn)一步擴大污染范圍，從而對糧食、蔬果和動物性食品造成不可避免的廣泛污染。同時DON 具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在一般的生產(chǎn)加工過程中難以去除[1-3]。國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency of Research on Cancer，IARC）已將DON 歸為第三類致癌物質(zhì)。歐盟要求DON 含量要小于1.0 mg/kg，中國飼料要求低于1000 μg/kg。針對DON 污染廣、去除難、限量低等特征，開發(fā)針對DON的快速便捷、高穩(wěn)定性、高靈敏度的檢測方法具有十分重要的意義。

目前針對DON 的檢測方法主要分為儀器檢測與快速篩查兩類。

儀器檢測主要應(yīng)用于實驗室分析，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好等優(yōu)點，主要包括高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，由于其穩(wěn)定性好、靈敏度高，是世界各國真菌毒素檢測的標(biāo)準(zhǔn)仲裁方法。但儀器檢測耗時長、操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、需要專業(yè)人員，不利于現(xiàn)場操作使用，無法滿足快速、便捷、低成本的檢測要求。在儀器檢測過程中往往需要先進(jìn)行富集凈化等前處理，從而極大影響檢測效率與準(zhǔn)確性[4-5]，對樣品數(shù)量大、種類多、基質(zhì)復(fù)雜的食品檢測不太適用。

快速篩查法以免疫分析技術(shù)為代表，利用抗原抗體間的特異性親和能力，廣泛應(yīng)用于大批量樣品的現(xiàn)場快速篩查工作，主要包括酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、膠體金檢測試紙條（ICA）等，具有測試操作簡單、儀器廉價、檢測速度快、樣品檢測通量高等優(yōu)點，在大量樣品的篩選檢測[6-7]中得到廣泛應(yīng)用。但是這些快速檢測方法在靈敏度方面仍具有一定的局限性。

我們擬通過制備金納米顆粒（AuNPs），并將其與HRP-IgG 偶聯(lián)，制備得到一種高活性的酶-金納米復(fù)合物（HRP-IgG-AuNPs）作為ELISA 中的探針。AuNPs 有許多優(yōu)良的物理特性，包括與形狀相關(guān)的光電特性、大的表面體積比、出色的生物相容性、低毒性和價格低廉等特點，可以簡單、有效地與抗體蛋白結(jié)合，并且其具有辣根過氧化物酶的特性，將其應(yīng)用于ELISA 中，建立了一種新型的納米金增強ELISA 方法。與傳統(tǒng)ELISA 方法相比，該方法的檢測靈敏度提高約13 倍，因此，該方法有望在高靈敏免疫分析方法中獲得廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

嘔吐毒素（DON）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、T-2毒素（T-2）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素（OTA），Sigma 公司；嘔吐毒素包被抗原（DON-BSA）、嘔吐毒素單克隆抗體（DON mAb），山東綠都生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗（HRP-IgG），華美生物工程有限公司；氯金酸，無水碳酸鉀，檸檬酸鈉，上海國藥公司；普通試劑，均為國產(chǎn)分析純級。

紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；集熱式恒溫磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN 透射電鏡，美國FEI公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AuNPs 的制備

所用燒瓶均用新配制的王水充分洗凈、烘干。取99.0 mL 的超純水和1% 氯金酸水溶液1.0 mL，加入250 mL 三口圓底燒瓶中，采用140 ℃油浴加熱回流，邊加熱邊伴以大力攪拌，直至沸騰，迅速開蓋加入1%檸檬酸三鈉水溶液1.0 mL，繼續(xù)加熱并大力攪拌，使溶液保持沸騰狀態(tài)15 min，該時間內(nèi)瓶中溶液的顏色由淡黃色轉(zhuǎn)為黑灰色，最后變?yōu)榫萍t色且穩(wěn)定不變色，反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至試劑瓶中保存待用。通過透射電子顯微鏡（TEM）和紫外-可見分光光度計對制備的AuNPs 的粒徑和形貌進(jìn)行鑒定。

1.2.2 HRP-IgG-AuNPs 的制備

取1.0 mL 上述制備的AuNPs 溶液，用0.2 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH 至8.0 左右，然后向該溶液中加入1.0μL 的HRP-IgG，攪拌2 h 后放入4 ℃冰箱反應(yīng)過夜。然后以12 000 r/min 的速度在4 ℃下離心30 min，保留離心管底部的沉淀，即得HRP-IgGAuNPs。用一定體積的抗體稀釋液重懸，于4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 納米金增強酶聯(lián)免疫法的建立

該方法的操作步驟與傳統(tǒng)ELISA 的方法相同[8]。首先，采用100 μL/孔DON-BSA 進(jìn)行包板，37 ℃孵育2 h，PBST 洗板3 次并拍干；每孔用200 μL 含0.2%（w/v）明膠的碳酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉，37 ℃孵育1 h，PBST 洗板3 次并拍干；每孔分別加入100 μL 不同濃度的DON 標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μL 適宜濃度的DON mAb 溶液，37 ℃孵育30 min，PBST 洗板3 次并拍干；每孔加入HRP-IgG-AuNPs 溶液100 μL，37 ℃孵育30 min，PBST 洗板3 次并拍干；每孔加入100 μL 顯色液，37 ℃避光顯色15 min，最后加入100 μL/孔終止液結(jié)束反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm 值。

1.2.4 樣品的加標(biāo)回收

取經(jīng)過確證未受DON 污染的面粉樣品，分別按照1、5、10 ng/mL 三個水平進(jìn)行DON添加回收試驗。每份樣品各稱取5.0 g，加入25 mL 超純水于振蕩器上劇烈振蕩2 min，超聲提取30 min。提取液經(jīng)5 000 r/min 離心后，上清用PBS 稀釋1 倍后進(jìn)行ELISA 分析。每次實驗重復(fù)三次，根據(jù)讀取的OD450 nm 值對照所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測試濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料的表征

用透射電子顯微鏡（TEM）觀察所制得的AuNPs粒徑的均勻程度和大小，見圖1。圖1 顯示，所制備的AuNPs 粒徑約為54 nm，形貌良好，多呈圓形或橢圓形，且分散均勻。

通過調(diào)整HRP-IgG-AuNPs 溶液濃度與AuNPs的濃度，采用紫外-可見分光光度計進(jìn)行掃描，設(shè)置其波長范圍為400～800 nm 之間，結(jié)果見圖2。圖2 顯示，AuNPs 的最大吸收峰為536 nm，HRP-IgG-AuNPs的最大吸收峰發(fā)生紅移，位置在545 nm，因此，初步證明HRP-IgG 已成功吸附在AuNPs 的表面。

2.2 探針偶聯(lián)條件的優(yōu)化

2.2.1 AuNPs 偶聯(lián)最佳pH 值確定

用0.2 mol/L 的K2CO3溶液調(diào)節(jié)AuNPs 溶液的pH，分別取1 mL 不同pH 的AuNPs 加入1 μL 的HRP-IgG，反應(yīng)20 min 后加入20 μL 10% NaCl 溶液，具體見表1。用紫外可見分光光度計掃描400～800 nm 范圍內(nèi)的吸收光譜，在pH 位于7.0～8.5 范圍內(nèi)時，AuNPs 的最大吸光度隨著pH 的增加而增大，pH 為8.5 時達(dá)到最大值，之后吸光度隨著pH 的增加而減小，見圖3。因此選擇pH8.5 作為AuNPs 偶聯(lián)時的最佳pH。

表1 AuNPs 偶聯(lián)最佳pH 值確定

2.2.2 HRP-IgG 最佳添加量的確定

在0.5 mL pH=8.5 的AuNPs 中加入不同量的HRP-IgG 溶液，4 ℃反應(yīng)30 min，再加入20 μL 10%NaCl 溶液，具體見表2。用紫外可見分光光度計掃描400～800 nm 范圍內(nèi)的吸收光譜，HRP-IgG 添加量在0.1～1.4 μL 范圍內(nèi)時，AuNPs-HRP-IgG 吸光度隨著HRP-IgG 添加量的增加而變大，HRP-IgG 添加量在1.0μL 時吸光度最大，因為隨著HRP-IgG 的不斷增加，AuNPs 表面的有效位點越來越多的被占據(jù)；當(dāng)HRP-IgG 的添加量超過1.0 μL 后，達(dá)到飽和狀態(tài)，吸光度變化微小，見圖4。因此HRP-IgG 的最佳添加量為1.0 μL。

表2 HRP-IgG 最佳添加量的確定

2.3 納米金增強ELISA 檢測DON

在最優(yōu)條件下，分別采用納米金增強ELISA 和傳統(tǒng)ELISA 方法對不同質(zhì)量濃度的DON 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，以競爭抗原DON 標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度建立橫坐標(biāo)，以吸光率B/B0值（B 代表各DON 標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的OD450nm值，B0代表DON 濃度為0 時對應(yīng)的OD450nm值）建立縱坐標(biāo)，通過Origin 軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖5。

由圖可知，納米金增強ELISA 的檢測靈敏度（50%抑制濃度）為0.28 ng/mL，最低檢測限（90%抑制濃度）為0.01 ng/mL，檢測線性范圍為0.01～10 ng/mL，而傳統(tǒng)ELISA 的靈敏度和檢測限分別為3.61 ng/mL 和0.1 ng/mL，檢測線性范圍為0.1～100 ng/mL，兩種方法相比較，本研究所建立的納米金增強ELISA 靈敏度提高了約13 倍，檢測限和線性范圍也均有提高。結(jié)果表明，由于金納米顆粒自身的納米酶特性加上其表面吸附的多個酶標(biāo)二抗所共同表現(xiàn)出的強催化活性，使得納米金增強ELISA 的檢測靈敏度得以提高。

2.4 特異性

測定DON 及其結(jié)構(gòu)類似物AFB1、T-2、ZEN 及OTA 的IC50，以DON mAb 對DON 的IC50與各競爭物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率（CR%）。以交叉反應(yīng)率評價方法的特異性，交叉反應(yīng)率越低，方法的特異性越高，結(jié)果見表3。與常見的其他類似物幾乎沒有交叉反應(yīng)，證明該納米金增強ELISA 方法的特異性良好。

表3 交叉反應(yīng)率結(jié)果

2.5 樣品的加標(biāo)回收

將不同濃度的DON 標(biāo)準(zhǔn)品加入陰性面粉樣品，用所建立的納米金增強ELISA 方法測定面粉中DON 含量，結(jié)果見表4。研究發(fā)現(xiàn)，對加標(biāo)范圍在1～10 ng/mL 的面粉樣品的回收率可達(dá)86.54%～107.34%，變異系數(shù)均低于8%，說明該方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性良好。

表4 樣品回收率測定結(jié)果分析

3 結(jié)語

本文成功建立了一種納米金增強ELISA 用于DON 的檢測，是通過簡單的方法在納米金表面負(fù)載ELISA 檢測中常用的酶標(biāo)二抗分子，從而得到更高活性的酶標(biāo)二抗-納米金復(fù)合物。該復(fù)合物具有更高催化活性，相較于傳統(tǒng)的ELISA，方法的靈敏度可提高約13 倍，同時改善檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。該方法成本低、靈敏度高，也具有傳統(tǒng)ELISA 可滿足現(xiàn)場大批量檢測的優(yōu)點，可在質(zhì)檢機構(gòu)、企業(yè)等基層單位推廣，應(yīng)用前景良好。