蔣 恬， 朱婉華△， 彭江云， 何東儀， 徐智敏， 何 峰， 沙 濱， 孫飛虎， 王鶴潼

(1.南通市良春中醫(yī)藥研究所，江蘇 南通 226009；2.南通良春中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 南通 226009；3.云南省中醫(yī)醫(yī)院， 昆明 650021；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院， 上海 200052)

尿酸長(zhǎng)期在人體內(nèi)過(guò)度累積可導(dǎo)致痛風(fēng)，還能增加心血管病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1，2]。近年來(lái)，我國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率約為3‰，呈年輕化趨勢(shì)[3]。目前西醫(yī)推薦降尿酸治療的一線藥物為別嘌呤醇或非布司他[4]，不良反應(yīng)較大[5-12]。當(dāng)前許多研究表明，中藥具有明顯降低尿酸的作用，并能緩解患者臨床癥狀[13-15]，然而目前對(duì)于本病的中醫(yī)治療方案還未達(dá)成統(tǒng)一。首屆國(guó)醫(yī)大師朱良春教授經(jīng)數(shù)十年臨床觀察研究創(chuàng)制“痛風(fēng)顆?！?，臨床應(yīng)用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、高尿酸血癥等療效顯著。本研究擬通過(guò)建立高尿酸血癥大鼠模型，進(jìn)一步明確其潛在作用機(jī)制。本研究已通過(guò)南通良春中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(批準(zhǔn)號(hào)NTLCTCM2019002)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(220±15)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于寬敞通風(fēng)的清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，噪聲<60分貝，照明時(shí)間L/D=12 h/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

中藥痛風(fēng)顆粒由土茯苓、鬼箭羽、生薏苡仁、徐長(zhǎng)卿等組成，南通良春中醫(yī)醫(yī)院提供。

1.3 主要試劑及儀器

腺嘌呤 (Sigma，貨號(hào)A8626)；氧嗪酸鉀鹽(Sigma，貨號(hào)156124) ；非布司他(貨號(hào)SML1285-1G，規(guī)格1 g，Sigma)；定制高酵母飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1，規(guī)格2 kg)；尿酸鈉鹽(Sigma，貨號(hào)U2875-25G，規(guī)格25 g)；HE染色試劑盒(碧云天，貨號(hào)C0105S，規(guī)格100 mL)。大鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β、IL-4、干擾素(Interferon，IFN)-γ、IL-2、IL-17、IL-13 Elisa試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)分別為CSB-E11987r、CSB-E08055r、CSB-E04635r、CSB-E04579r、CSB-E04628r、CSB-E07451r、CSB-E07454r)。

7150型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立)；RM2035型石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA)；ASP300型自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)LEICA)；EG1160型石蠟包埋機(jī)(德國(guó)LEICA)；CR-GⅢ型高速冷凍離心機(jī)(日本Hitachi)。

1.4 高尿酸血癥大鼠模型建立

需要造模的大鼠喂養(yǎng)定制高酵母飼料，同時(shí)灌胃腺嘌呤，劑量100 mg/kg，每日2次。同時(shí)每日用氧嗪酸鉀懸液以150 mg / kg的劑量皮下注射2 次，每次間隔12 h，共造模21 d。每日定時(shí)尾靜脈取血，7150型全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血漿尿酸水平，連續(xù)3 d維持在400 mmol/L即認(rèn)為造模成功。

1.5 分組與給藥

SD大鼠造模成功后平均分為模型組、痛風(fēng)顆粒組、陽(yáng)性藥物組3組各6只，另設(shè)正常組6只。痛風(fēng)顆粒組按照正常成人劑量以體表面積換算后灌胃給藥，給藥劑量為17.5 g/(kg·d)，陽(yáng)性藥物組用非布司他以4 mg/(kg·d)的劑量灌胃給藥，正常組和模型組用等量純水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥10 d。

1.6 樣本采集與處理

治療結(jié)束后，各組大鼠用3%水合氯醛腹腔注射(1 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，待測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.7 HE 染色觀察大鼠關(guān)節(jié)與肝腎組織病理學(xué)變化

取血后取下大鼠關(guān)節(jié)與肝腎，剝離周圍脂肪及膜組織，置于4%的多聚甲醛中固定1 周，石蠟包埋，切片，光學(xué)顯微鏡觀察分析。

1.8 生化分析儀檢測(cè)血漿中尿酸、肌酐和尿素氮水平

用日立-7150型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿中尿酸濃度及肌酐和尿素氮的含量。

1.9 ELISA法檢測(cè)血漿炎性細(xì)胞因子水平

ELISA法檢測(cè)各組大鼠血漿中TNF-α、IL-1β、IL-4、INF-γ、IL-2、INF-γ、IL-17、IL-13水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模前后大鼠尿酸水平的變化

圖1示，與正常組比較，模型組大鼠的血漿尿酸水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示高尿酸血癥大鼠模型建立成功。

圖1 正常組和模型組大鼠血漿中尿酸水平比較(n=6)

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理染色結(jié)果

圖2結(jié)果表明，正常組大鼠關(guān)節(jié)組織光滑完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管增生；模型組大鼠滑膜破裂不完整，有細(xì)胞壞死，滑膜周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且發(fā)生水腫。

圖2 正常組和模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織染色(HE×200)

2.3 給藥后各組大鼠尿酸、肌酐、尿素氮水平比較

表1示，痛風(fēng)顆粒能有效降低模型組大鼠的尿酸、肌酐、尿素氮水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠尿酸、肌酐、尿素氮水平比較

2.4 給藥后各組大鼠炎性細(xì)胞因子水平比較

表2示，痛風(fēng)顆粒能顯著降低模型大鼠血漿中 TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01)。

表2 各組大鼠血漿炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

2.5 給藥后各組大鼠肝腎組織病理染色結(jié)果

圖3、4示，與正常組比較，痛風(fēng)顆粒組和陽(yáng)性藥物組肝腎組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯變化，血管組織偶見充血改變，表明該中藥顆粒對(duì)肝腎組織形態(tài)和功能無(wú)明顯毒副作用。

圖3 給藥后各組大鼠肝組織染色(HE×200)

圖4 給藥后各組大鼠腎組織染色(HE×200)

3 討論

痛風(fēng)以疼痛性關(guān)節(jié)發(fā)炎為特征，最常見于第一個(gè)跖趾關(guān)節(jié)，這是由于尿酸單鈉晶體在關(guān)節(jié)腔內(nèi)沉淀所致。目前對(duì)痛風(fēng)的疾病診斷采用美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院的臨床標(biāo)準(zhǔn)，可以通過(guò)確定患病關(guān)節(jié)滑液中尿酸單鈉晶體來(lái)確診[16]。目前高尿酸血癥、痛風(fēng)的患病率逐年增加，且病情反復(fù)率高，對(duì)健康有著很大威脅[17]，降低尿酸水平是避免痛風(fēng)發(fā)作的關(guān)鍵。目前，別嘌呤醇和非布司他是預(yù)防復(fù)發(fā)性痛風(fēng)的明星藥物，故本文選用非布司他作為陽(yáng)性藥。由于西藥的副作用較大，探索研發(fā)降低尿酸、緩解疼痛、控制炎癥、改善心肝腎功能、安全性好、副作用低的中醫(yī)療法和中藥制劑，具有十分重要的意義[18]。

中醫(yī)藥治療高尿酸血癥和原發(fā)性痛風(fēng)的報(bào)道較多[19-21]，多采用辨證分型與固定方加減治療，治療原則有清熱利濕、通絡(luò)止痛、溫經(jīng)散寒、除濕通絡(luò)、益氣健脾、泄?jié)犰铕龅?。朱文靜等[22]研究得出菊苣可以很好地改善大鼠“脾虛痰濕”的證候?qū)W特征；有研究表明，四妙丸提取液可以通過(guò)激活腎有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，發(fā)揮促進(jìn)尿酸排泄的作用[23，24]。朱良春教授經(jīng)過(guò)數(shù)十年臨床觀察，發(fā)現(xiàn)患該病人群特征鮮明，多為年長(zhǎng)、體胖或喜飲酒嗜肥甘厚味者，其病癥特點(diǎn)為關(guān)節(jié)異常疼痛，夜間更易發(fā)作且有結(jié)節(jié)等。朱良春[25，26]認(rèn)為中醫(yī)雖有“痛風(fēng)”一名，實(shí)為廣義的風(fēng)濕疾病，非西醫(yī)所言之痛風(fēng)，病名雖同但概念則異，不應(yīng)一概而論。此病的誘因?yàn)槭軡袷芎渲饕驗(yàn)闈駶狃鰷?nèi)阻。古人云：“癥似風(fēng)而本非風(fēng)”“乃濁毒瘀滯使然”，且此濕濁之邪不受之于外，而生之于內(nèi)。在這一理論基礎(chǔ)上首創(chuàng)“濁瘀痹”的痛風(fēng)中醫(yī)病名，倡導(dǎo)從“濁瘀內(nèi)阻”角度認(rèn)識(shí)痛風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和防治規(guī)律，并創(chuàng)立 “泄?jié)峄稣{(diào)益脾腎”的中醫(yī)治法，同時(shí)創(chuàng)制代表方“痛風(fēng)顆?！?，臨床應(yīng)用于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、高尿酸血癥等療效顯著。

本研究結(jié)果表明，痛風(fēng)顆粒能明顯降低模型大鼠血漿中 TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17的表達(dá)水平。且HE染色結(jié)果顯示，中藥痛風(fēng)顆粒對(duì)大鼠肝腎組織無(wú)明顯的損傷作用，說(shuō)明中藥痛風(fēng)顆粒是治療高尿酸血癥的高效藥物，能在降低高尿酸血癥模型大鼠尿酸水平的同時(shí)，降低大鼠體內(nèi)肌酐、尿素氮水平，對(duì)尿酸鹽積累導(dǎo)致的肝腎損傷有一定的保護(hù)作用，還能通過(guò)有效降低TNF-α、IL-1β、IL-2等炎性細(xì)胞因子的過(guò)量表達(dá)，最終達(dá)到減輕腎組織炎癥的效果。這些數(shù)據(jù)都為痛風(fēng)顆粒臨床治療高尿酸血癥提供了科學(xué)依據(jù)。