石佳卉，張安琪，陳 爽，邵志遠(yuǎn)，王喜波*，江連洲

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030 2 黑龍江省農(nóng)墾龍王食品有限責(zé)任公司 黑龍江綏化 152000）

維生素D 是脂溶性微量元素，在人體細(xì)胞生長、分化中起重要作用，可促進(jìn)鈣、磷吸收和轉(zhuǎn)運，還與自身免疫性疾病有關(guān)[1-2]。在生活、飲食習(xí)慣及年齡等因素的影響下，維生素缺乏在全球范圍內(nèi)普遍存在，尤其是維生素D 缺乏[3-4]。維生素D3（Vitamin D3，VD3） 具有維生素D 最高的生物活性[5]，然而，其在光、熱條件下不穩(wěn)定，容易在空氣中氧化分解，失去活性[6]。

為了提高VD3的穩(wěn)定性及其生物利用度，常采用糖類和蛋白質(zhì)作為封裝載體負(fù)載保護(hù)VD3[7-8]。理論上，作為納米復(fù)合物載體，蛋白質(zhì)比糖類更有優(yōu)勢[9]。大豆分離蛋白（Soy protein isolate，SPI）作為一種功能特性良好，營養(yǎng)價值豐富的植物蛋白，因無毒、廉價等優(yōu)點，而被用于食品封裝技術(shù)中。Chen 等[10]和Pujara[11]分別用SPI 對姜黃素和白藜蘆醇進(jìn)行封裝，均有效提高了被封裝物質(zhì)的水溶性；Lee 等[12]用pH 偏移和超聲結(jié)合制備可溶性SPI 納米聚集體并對VD3進(jìn)行封裝，使其抵抗紫外線破壞的能力提高。

大豆蛋白通過靜電作用和疏水相互作用與可電離或疏水性小分子結(jié)合，因此大豆蛋白和VD3互作是提高VD3穩(wěn)定性的一種途徑。目前關(guān)于SPI-VD3復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)的研究較少。本團(tuán)隊前期研究了不同均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)處理SPI-VD3復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)[13-14]。本文選用不同濃度的VD3分別與SPI 復(fù)合，研究不同濃度VD3對復(fù)合物粒徑、電位、濁度和表面疏水性的影響，闡明VD3與SPI 相互作用后SPI 熒光光譜、紫外光譜和傅里葉紅外光譜的變化規(guī)律及其二級結(jié)構(gòu)變化，旨在為營養(yǎng)強化VD3技術(shù)及拓寬大豆蛋白的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素D3（Vitamin D3，VD3），純度>99%，美國Sigma 公司；低溫脫脂豆粕，山東禹王實業(yè)有限公司；ANS 熒光探針，美國Sigma 公司；濃鹽酸，哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司；試驗試劑均為分析純級。

1.2 設(shè)備與儀器

GL-21M 型冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；ALPHA 1-4 LSC 型冷凍干燥機，德國Christ 公司；FTIR-8400S 型傅里葉紅外光譜儀、UV-240IPC 型紫外分光光度計，日本島津公司；F-4500 型熒光分光光度計，日本日立公司；Zetasizer Nano ZS90 型Zeta 粒度及電位測定儀，英國Malvern 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 SPI 的制備 根據(jù)Sorgentini 等[15]的方法制備SPI，略作改動。取一定量低溫脫脂豆粕粉碎，使用60 目篩篩分得到脫脂豆粉。用堿溶酸沉法提取SPI。為除去SPI 沉淀中的鹽離子，將SPI 沉淀物用去離子水洗滌2 次。用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)SPI 溶液的pH 值至7.0。將樣品倒入平皿后，于-20 ℃冰箱中預(yù)凍24 h，然后在-40 ℃下冷凍干燥。制備出的SPI 粉末儲存于冰箱（-20 ℃）中備用。本試驗提取的SPI 中蛋白含量為90.12%。

1.3.2 VD3溶液的制備 避光下稱取一定量VD3粉末溶解在無水乙醇中，使用磁力攪拌使其充分溶于乙醇，制備好的VD3溶液避光儲存在棕色瓶中備用。本研究中VD3溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 SPI-VD3溶液的制備 將一定量SPI 粉末加入磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）中，配成SPI 溶液（4 mg/mL），按照SPI∶VD3的質(zhì)量比為25∶1，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1，將VD3溶液與SPI 溶液混合，室溫（25 ℃）下避光攪拌1 h，各樣品分別表示為SPI-VD3-1～SPI-VD3-5。

1.3.4 粒徑測定 用粒度分析儀測定復(fù)合體系粒徑。將SPI 溶液及SPI-VD3-1～SPI-VD3-5 樣品溶液稀釋4 倍。分散劑設(shè)定為水，分散劑和顆粒折射率分別為1.330 和1.460，顆粒吸收率設(shè)為0.1。

1.3.5 ζ-電位測定 采用Zetasizer Nano ZS90 型Zeta 電位測定儀分別測定SPI 溶液及SPI-VD3-1～SPI-VD3-5 樣品的ζ-電位。測定前先用0.01 mol/L pH 7.0 磷酸鹽緩沖液稀釋待測樣品，稀釋至溶液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1 mg/mL，然后注入樣品池。儀器操作溫度設(shè)定為25 ℃，蛋白質(zhì)和分散劑的折射率分別為1.450 和1.330，吸收率為0.001。

1.3.6 表面疏水性測定 參照Hayakawa 等[16]的方法測定表面疏水性。用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）稀釋SPI 及樣品溶液，使最終蛋白質(zhì)量濃度為1，0.2，0.04，0.008 mg/mL。將20 μL 的ANS熒光探針（8 mmol/L，用pH 7.0，0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液配制）與4 mL 樣品均勻振蕩，避光處理放置15 min。在激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm 下測定樣品的熒光強度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)擬合曲線，直線斜率為表面疏水性。

1.3.7 濁度測定 參照Lee 等[12]的方法測定樣品濁度。以不同蛋白VD3質(zhì)量比的樣品在600 nm 波長下測得的吸光值表示濁度，用蒸餾水作為空白。

1.3.8 熒光光譜測定 參照Liu 等[17]的方法測定熒光光譜。將SPI 溶液及SPI-VD3樣品溶液稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，設(shè)定激發(fā)波長290 nm，在發(fā)射波長300～500 nm 范圍內(nèi)掃描，設(shè)定電壓700 mV，狹縫寬度2.5 nm。

1.3.9 紫外-可見光譜分析 將SPI 溶液及不同蛋白VD3質(zhì)量比的樣品分別稀釋至0.2 mg/mL，分別移取3 mL 于石英比色池中，吸收光譜掃描范圍200～400 nm。

1.3.10 傅里葉紅外光譜分析 將SPI 和SPI-VD3樣品凍干備用。在干燥環(huán)境下，按KBr∶樣品的質(zhì)量比為150∶1 的比例壓制固體薄片[18]。使用8400S FTIR 紅外光譜儀對固體薄片進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為32 次，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。采用PeakFit 4.12 軟件擬合分析紅外光譜，得到SPI 及SPI-VD3樣品中二級結(jié)構(gòu)含量。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用Origin 8.0 軟件處理數(shù)據(jù)作圖，每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)處理與方差分析（ANOVA）使用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 VD3 添加量對SPI-VD3 復(fù)合物粒徑、PDI 和ζ-電位的影響

如圖1所示，SPI 粒徑呈現(xiàn)雙峰分布，隨著VD3的加入，SPI-VD3復(fù)合物的體積粒徑逐漸朝著單峰分布轉(zhuǎn)變，體積粒徑小的峰占比增大，體積粒徑較大的峰占比減小。由圖2同樣可以看出隨著VD3含量增加，體系平均粒徑由384.3 nm 明顯減小到125.2 nm，且多分散性指數(shù)PDI 變小，說明體系中粒徑分布更均一，穩(wěn)定性較強。可能是由于VD3的存在，與SPI 通過疏水相互作用和氫鍵等自組裝成為膠束，且該膠束的膠束結(jié)構(gòu)比SPI 膠束更加緊密[19]。樣品ζ-電位變化范圍為-19.6～-20.3 mV，隨著VD3含量的增多，電位的絕對值逐漸增大，當(dāng)SPI 與VD3質(zhì)量比為10∶1 時，電位絕對值最大，此時體系最穩(wěn)定。也可能是由于VD3與SPI 交聯(lián)后使SPI 溶液的ζ-電位絕對值升高，有助于保持溶液粒子之間彼此遠(yuǎn)離，從而導(dǎo)致溶液液滴尺寸減小[20]。

圖1 SPI-VD3 復(fù)合物的ζ-電位和粒徑分布圖Fig.1 ζ-potential and particle size distribution of SPI-VD3 complex

圖2 SPI-VD3 復(fù)合物的平均粒徑和PDIFig.2 Average particle size and PDI of SPI-VD3 complex

2.2 VD3 添加量對SPI-VD3 復(fù)合物表面疏水性的影響

表面疏水性（H0） 與蛋白的功能性質(zhì)密切相關(guān)。如圖3所示，隨著VD3濃度的增大，SPI-VD3復(fù)合物的表面疏水性顯著降低 （P<0.05）。當(dāng)SPI與VD3質(zhì)量比為5∶1 時，表面疏水性由1 137.67降到了1 008.57。這表明添加VD3后，SPI 表面更加親水，可能是VD3引起了SPI 結(jié)構(gòu)改變。H0下降可能是由于VD3與SPI 相互作用，導(dǎo)致部分掩埋在SPI 內(nèi)部的親水基團(tuán)暴露出來[21]。同時，VD3是疏水性物質(zhì)，VD3與SPI 疏水基團(tuán)相互作用，從而減少了ANS 與SPI 結(jié)合的數(shù)量，這可能是VD3使SPI 表面疏水性下降的原因之一。

圖3 SPI-VD3 復(fù)合物的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of the SPI-VD3 complex

2.3 VD3 添加量對SPI-VD3 復(fù)合物濁度的影響

濁度是懸浮物對光線的阻礙程度，能夠反映蛋白聚集程度及聚集體大小[22]，同時也直接影響溶液的外觀。由圖4可知，VD3含量的增加使VD3-SPI 復(fù)合物的濁度略有增加，這與前述的SPI-VD3復(fù)合物粒徑變化不同，這可能由于部分VD3沒與SPI 相互作用形成復(fù)合物而是游離于體系中所致。

圖4 SPI-VD3 復(fù)合物的濁度Fig.4 Turbidity of SPI-VD3 complex

2.4 VD3 添加量對SPI-VD3 復(fù)合物熒光光譜的影響

SPI 和SPI-VD3復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜見圖5。激發(fā)波長為290 nm 時，SPI 的熒光發(fā)射峰在360 nm 附近。隨VD3比例的升高，熒光強度降低，表明VD3與SPI 之間存在相互作用，VD3起到猝滅劑作用，且濃度越大猝滅效果越明顯。同時，熒光發(fā)射峰由360.8 nm 紅移至364.4 nm，紅移了3.6 nm。熒光發(fā)射峰的變化反映了蛋白中色氨酸殘基和酪氨酸殘基微環(huán)境的改變。微環(huán)境向親水轉(zhuǎn)變，說明SPI 與VD3結(jié)合，使SPI 空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，肽鏈結(jié)構(gòu)展開[23]。

圖5 SPI-VD3 復(fù)合物的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of SPI-VD3 complex

2.5 VD3 添加量對SPI-VD3 復(fù)合物紫外-可見吸收光譜的影響

在不同濃度VD3影響下SPI 的紫外-可見吸收光譜變化見圖6。隨著VD3濃度的增加，SPIVD3復(fù)合物的吸光度逐漸增強，最大吸收峰波長（λmax）由259 nm 紅移至267 nm。λmax紅移說明SPI中芳香族氨基酸的微環(huán)境發(fā)生變化，SPI 構(gòu)象改變，肽鏈伸展，進(jìn)而增強了吸光度。該結(jié)果與付彩霞等[24]關(guān)于VE 與牛血清蛋白的相互作用的研究結(jié)果一致。

圖6 SPI-VD3 復(fù)合物的紫外-可見吸收光譜Fig.6 Ultraviolet-visible absorption spectrum of SPI-VD3 complex

2.6 VD3 添加量對SPI-VD3 復(fù)合物傅里葉變換紅外光譜的影響

由圖7可知，添加VD3后酰胺Ⅰ區(qū)和酰胺Ⅱ區(qū)的透光率降低了，SPI 酰胺Ⅰ區(qū)從1 632.93 cm-1藍(lán)移至1 631.96 cm-1，酰胺Ⅱ區(qū)從1 531.28 cm-1紅移至1 533.13 cm-1，說明添加VD3使SPI 的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖7 SPI-VD3 復(fù)合物的傅里葉紅外光譜Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy of SPI-VD3 complex

傅里葉紅外變換光譜能夠敏感地反映肽鏈結(jié)構(gòu)的變化，得到的紅外光譜圖利用PeakFit 4.12軟件進(jìn)行處理，通過進(jìn)行區(qū)域選定（1 600～1 700 cm-1）、基線校準(zhǔn)，Savitsk-Golay 平滑處理，以及二階導(dǎo)數(shù)的擬合處理得到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。酰胺I 區(qū)中頻率范圍1 648～1 664 cm-1被指定為α-螺旋結(jié)構(gòu)，頻率范圍1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1被指定為β-折疊結(jié)構(gòu)，頻率范圍1 664～1 681 cm-1和1 637～1 648 cm-1分別被指定為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[25]。從圖8可以看出，與SPI 相比，α-螺旋和β-折疊含量下降，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量明顯升高（P<0.05），這可能是由于VD3與蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸區(qū)域結(jié)合從而使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，α-螺旋和β-折疊轉(zhuǎn)換為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。α-螺旋的結(jié)構(gòu)以緊密、堅固為特點，可能阻礙了SPI 某些功能特性的發(fā)揮。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)象的增加，明顯增強了蛋白質(zhì)的柔韌性，對SPI 功能特性的發(fā)揮產(chǎn)生有利影響[26]。劉英杰等[27]研究花青素與SPI 的不同交聯(lián)法對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)酶法和堿法共價法均使SPI 結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊含量降低，使SPI 肽鏈解折疊。Liu 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸、沒食子酸與乳鐵蛋白結(jié)合，使其α-螺旋減少，蛋白結(jié)構(gòu)更加延展。

圖8 SPI-VD3 復(fù)合物中蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量Fig.8 Content of the secondary structure of proteins in the complex of SPI-VD3

3 結(jié)論

1）VD3與SPI 相互作用后會降低SPI 的表面疏水性；VD3的添加使SPI 的粒徑減小，ζ-電位的絕對值增大，使體系粒徑分布更加均勻，溶液的穩(wěn)定性增強；隨著VD3含量的增加，復(fù)合物的濁度略有增大。

2）VD3使芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境向極性增強方向改變，SPI 分子構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)更加舒展；傅里葉紅外光譜結(jié)果顯示，VD3的加入引起大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步說明VD3與SPI 發(fā)生了相互作用。