鄭雪麗 王成進(jìn) 陳文淵 李萍 何曉菲 徐學(xué)海

1河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

2河西學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

3中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

噪聲性聽力損失（Noise-induced hearing loss，NIHL）多因長時(shí)間暴露于交通、工業(yè)、娛樂等環(huán)境噪聲引起，早期多為高頻聽力下降，逐漸累及言語頻率，產(chǎn)生不同程度的感音神經(jīng)性聾[1-3]。NIHL存在個(gè)體差異，需注重基因?qū)W調(diào)查[4]。群體遺傳學(xué)研究顯示，耳鈣粘蛋白基因(Objective To investigate the association of cadherin 23，CDH23)參與前庭毛細(xì)胞和耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛束的形成，其是否作為聽力損失易感性影響因素尚未肯定[5]。miRNAs參與了個(gè)體發(fā)育以及細(xì)胞凋亡、分化、增殖等生命過程，其中miR-183家族，包括miR-96、miR-183，在內(nèi)耳毛細(xì)胞有表達(dá)，不僅影響耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)，還可調(diào)節(jié)耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程，在哺乳動(dòng)物聽覺系統(tǒng)發(fā)育中有一定作用[6]，但其基因突變是否影響聽力損傷的研究較少，尚未達(dá)成共識(shí)。本文總結(jié)分析耳鈣粘蛋白基因(CDH23)多態(tài)性及miR-96與miR-183基因變異與聽力損傷易感性的關(guān)系。如下文報(bào)道。

1 資料和方法

1.1 資料

回顧性分析的259例噪聲暴露人群基本資料，符合《赫爾辛基宣言》的倫理審查。其中，男191例，女68例；年齡30-68歲，平均年齡（47.45±9.48）歲；接觸時(shí)間4-20年，平均（11.45±3.64）年。接觸史：123例存在有機(jī)溶劑接觸史，127例存在重金屬接觸史，121例存在粉塵接觸史，119例存在高溫接觸史。此次試驗(yàn)在2019年2月至2020年4月期間開展。根據(jù)純音聽力、聽神經(jīng)動(dòng)作電位(Compound action potential，CAP）、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（And distortion product otoacoustic emission，DPOAE）測試分為兩組，即聽力損傷組89例，對照組170例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①長期在噪聲暴露環(huán)境下工作，噪聲暴露強(qiáng)度≥80dB；②均處于同一水平噪聲暴露環(huán)境下工作者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性聽力受損者；②完全喪失聽力者；③溝通、交流障礙者；④近期接受過中耳手術(shù)者；⑤存在頭部外傷史、爆震史。

1.2 方法

一般資料調(diào)查：收集人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征（年齡、性別等）、既往史（中毒史、家族性耳聾病史、中耳炎病史）、生活習(xí)慣（飲酒、吸煙）、藥物使用史、重金屬接觸史（包括汞、鎘、鉛、鉻、金屬砷等成分）、有機(jī)溶劑接觸史（包括正己烷、戊烷、汽油、苯、苯乙烯、丁基甲苯、乙烯基甲苯、三氯乙烯、二氯甲烷等成分）、粉塵接觸史、高溫接觸史以及噪聲暴露情況。

純音聽力測試：由專業(yè)人士按照《職業(yè)性噪聲聾診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]進(jìn)行判定。在隔音室內(nèi)（本底值噪聲＜25dBS）用丹麥國際聽力設(shè)備儀器As216聽力計(jì)對所有研究對象開展6個(gè)頻率（500Hz、1000Hz、2000Hz、3000Hz、4000Hz、6000Hz）的純音氣導(dǎo)聽閾測試。聽力損傷：雙耳高頻3000Hz、4000Hz、6000Hz平均聽閾≥40dB。

DPOAE測試：耳聲發(fā)射分析系統(tǒng)選擇Madsen公司提供的CAPELIA系統(tǒng)進(jìn)行DPOAE測試。邀請受檢者坐于隔聲（噪音＜28dBS）屏蔽室內(nèi)。以兩個(gè)連續(xù)具有一定頻率比關(guān)系的f1、f2純音作為第一次刺激信號，強(qiáng)度為60、70dB SPL，頻率比f2/f1=1.22，選取2f2-f1的頻率幅度值，每個(gè)點(diǎn)疊加32次，記錄8個(gè)頻率點(diǎn)的信噪比和反應(yīng)幅值。聽力損傷：信噪比＞6dB SPL。

CAP：在聲電屏蔽的測聽室內(nèi)完成記錄，用SS-1型聲刺激器形成的短純音和CLick音刺激，短純音上升下降時(shí)間1ms，CLick期限1ms，平臺(tái)5ms，誘導(dǎo)電位經(jīng)FZG-81前置放大器放大，30-3000KHz濾波，輸入平均20次電腦疊加，記錄剛出現(xiàn)CAP波形所需最低聲強(qiáng)度為閾值，暴露前、后CAP閾值差值為閾移。聽力損傷：閾移＜10dB，CAP-N1峰潛伏期1.45±0.10ms。

CDH23多態(tài)性分析：DNA提?。撼槿∈軝z者5mL肘靜脈血，肝素抗凝，分離淋巴細(xì)胞需使用密度梯度離心法。基因分型：在分析CDH23基因多態(tài)性時(shí)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段。反應(yīng)條件和PCR引物序列如表1。miR-96、miR-183基因檢測：采用美國LIFE TECHNOLOGIES公司提供ABI GENE AMP PCR SYSTEM 9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，一般資料用（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，將單因素篩查出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入到二元Logistics回歸模型分析；相關(guān)性用Spearman法分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 基因突變檢測

259例測序樣本中，共發(fā)生CDH23基因突變21例，有明確突變位點(diǎn)12例，分別為rs980743065（4例）、rs1006266313（3例）、rs199844049（5例）、rs561600796（6例）、rs760701558（3例），突變頻率8.11%（21/259）。miR-96基因突變 5.79%（15/259）；miR-183基因突變率5.02%（13/259）。

2.2 比較一般資料

兩組比較性別、吸煙史、飲酒史不存在統(tǒng)計(jì)差異性（P＞0.05），但比較年齡、重金屬接觸史、有機(jī)溶劑接觸史、粉塵接觸史、高溫接觸史、工齡、CDH23基因、miR-183基因、miR-96基因存在統(tǒng)計(jì)差異性（P＜0.05）。如表2所示。

表2 對比一般資料Table 2 Comparison of general information

上接表2

2.3 二元Logistic因素分析

以“聽力是否受損”為因變量（賦值：0=未受損，1=受損），以“年齡（0=≤40歲；1=＞40歲）、有機(jī)溶劑接觸（0=否；1=是）、重金屬接觸（0=否；1=是）、粉塵接觸（0=否；1=是）、高溫接觸（0=否；1=是）、工齡（0=≤5年；1=＞5年）、CDH23基因（0=基因未突變；1=基因突變）、miR-96基因（0=基因未突變；1=基因突變）、miR-183基因（0=基因未突變；1=基因突變）”為自變量，納入二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，接觸重金屬、接觸高溫、工齡＞5年、CDH23基因突變、miR-96基因突變、miR-183基因突變是影響聽力受損的獨(dú)立因子（P＜0.05），年齡、接觸有機(jī)溶劑、接觸粉塵屬于可疑因素。見表3。

表3 分析影響聽力受損的二元因素Logistic回歸Table 3 Logistic regression analysis of binary factors affecting hearing loss

2.4 分析各指標(biāo)間相關(guān)性

聽力受損與重金屬接觸、粉塵接觸、高溫接觸、工齡、CDH23基因、miR-96基因、miR-183基因呈正相關(guān)性、（r=0.203；P=0.001）、（r=0.206；P=0.001）。

2.5 分析各基因型分布情況

表4數(shù)據(jù)顯示，兩組比較CDH23-Exon7的末位單核苷酸位點(diǎn)AA、AG、GG基因型分布及A/G等位基因頻率存在統(tǒng)計(jì)差異性（X2：39.084；P＜0.001）、（X2：14.458；P＜0.001）。

表4 分析不同CDH23基因型分布（n=89/170）Table 4 Analysis of the distribution of different CDH23 genotypes(n=89/170)

圖1 miR-96與miR-183基因的SNPs測序圖。Fig.1 SNPs sequencing map of miR-96 and miR-183 genes.注：圖1a-1b為miR-96:rs41274239基因型TT,rs73159662基因型GG；圖1c-1d為miR-183:rs41281222基因型CC,rs72631833基因型GG。

3 討論

NIHL是第二大類感音神經(jīng)性聽力損傷[8]，可因長時(shí)間接觸有害噪聲引發(fā)神經(jīng)性聽覺受損，若未及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療，可對人體造成不可逆損傷，故WHO已將其歸納為公共衛(wèi)生重點(diǎn)防御疾病。國外已有研究表明[9]，NIHL發(fā)病與基因變異有關(guān)，但國內(nèi)關(guān)于此類報(bào)道較少，為了給予臨床新的科學(xué)依據(jù)，本文就CDH23基因多態(tài)性、miR-96基因、miR-183基因與NIHL相關(guān)性進(jìn)行了深入探索。

經(jīng)二元Logistic分析，CDH23基因突變、長期接觸重金屬、長期接觸高溫、工齡＞5年、miR-96基因過度表達(dá)、miR-183基因過度表達(dá)是導(dǎo)致聽力受損的獨(dú)立因子。作用機(jī)制如下：（1）CDH23是鈣粘蛋白超家族的成員之一，被認(rèn)為與毛細(xì)胞束形成和靜纖毛的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)，常表達(dá)于感覺神經(jīng)上皮細(xì)胞表面。當(dāng)人體長時(shí)間處于噪聲暴露環(huán)境下，可導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛損傷[10]。而本次單因素分析中，聽力受損者CDH23基因突變率更高，從而佐證CDH23基因突變與聽力受損存在明顯相關(guān)性?？赡芘cCDH23基因突變使內(nèi)耳神經(jīng)上皮細(xì)胞退化相關(guān)，使得毛細(xì)胞的靜纖毛組織遭到破壞，從而導(dǎo)致前庭功能失調(diào)和耳聾。胡娟[11]通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攜帶CDH23基因突變的小鼠存在靜纖毛束排列紊亂，出現(xiàn)高頻和低頻的聽力損失，且高頻聽力損失小鼠隨著周齡增加而加重；（2）miRNA不僅在神經(jīng)節(jié)和感覺斑中具有較高水平，在蝸器和前庭器發(fā)育中也有一定表達(dá)。而miRNA最重要的三個(gè)成員為miR-96、miR-183、miR-182，其中miR-183家族基因表達(dá)于脊椎動(dòng)物的感知覺細(xì)胞中，內(nèi)耳毛細(xì)胞常見，與機(jī)械感覺的細(xì)胞功能、發(fā)育有關(guān)。章偉敏[12]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠的miR-183表達(dá)變化與ROS相關(guān)，且隨著月齡增長而減少，參與老年性聾的病理機(jī)制。miR-96作為miR-183家族中成員，對耳聾發(fā)作起到重要基礎(chǔ)作用。王耀文[13]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)小鼠耳蝸中miR-96表達(dá)隨月齡增加而減少，在老年性聾的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。而本次經(jīng)單因素分析，聽力受損者miR-96基因、miR-183基因突變率更高，主要因miRNA中任意一個(gè)基因敲出，內(nèi)耳毛細(xì)胞數(shù)量減少、半規(guī)管缺陷，進(jìn)而引起異常神經(jīng)丘，miR-96、miR-183作為miRNA家族中主要成員，在內(nèi)耳特異性表達(dá)，在耳聾發(fā)展中起到關(guān)鍵作用；（3）汞、鎘、鉛、鉻、金屬砷等重金屬成分可在食物鏈的生物放大作用下，成千上萬聚集，通過多種途徑進(jìn)入耳內(nèi)，與蛋白質(zhì)、酶等成分相互抵觸，使其失去活性，能損傷內(nèi)耳，影響聽力。同時(shí)過大噪音，可導(dǎo)致耳膜受損，出現(xiàn)耳鳴、聽力減退等癥狀。目前關(guān)于彼此作用機(jī)制尚未明確，還需日后進(jìn)一步分析；（4）年齡：經(jīng)單因素分析中，年齡≥40歲人群聽力損傷率較高，說明年齡對聽力可造成一定影響，隨著年齡增長，聽毛細(xì)胞逐漸停止向大腦傳遞聲音信號，導(dǎo)致聽力逐漸下降[14]。但本次經(jīng)二元Logistic回顧分析發(fā)現(xiàn)年齡并不屬于獨(dú)立影響因素，可能是本次收治的人群大部分為中年人群，聽力受損程度并不明顯。

在本研究結(jié)果中，兩組比較CDH23-rs3802711位點(diǎn)的基因頻率和基因型存在統(tǒng)計(jì)差異，這是因?yàn)镃DH23-rs3802711位點(diǎn)C＞T突變，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物1804位的殘基精氨酸替換為谷氨酰胺，改變了原本位點(diǎn)的產(chǎn)物，導(dǎo)致CDH23鈣結(jié)合能力下降，削弱CDH23分子和其他蛋白之間相互作用，使靜纖毛更易受到噪聲刺激損傷，降低細(xì)胞間的黏附功能。楊衛(wèi)平等[15]通過鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CDH23-Exon7末位G突變?yōu)锳，可使聽力損失的易感性增加，但本研究并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，可能是由小鼠與人類的種屬差異造成的，但第七外顯子上的末位單核苷酸位點(diǎn)屬于同義突變，可改變CDH23空間結(jié)構(gòu)，影響鈣結(jié)合能力和表達(dá)產(chǎn)物的黏附功能，導(dǎo)致聽力損傷。本次研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，兩組末位單核苷酸位點(diǎn)AA、AG、GG基因型分布及A/G等位基因頻率存在統(tǒng)計(jì)差異性。

4 結(jié)論

綜上所述，CDH23基因多態(tài)性、miR-96基因、miR-183基因與NIHL存在一定相關(guān)性，對噪聲性聽力損傷易感性的判斷具有一定價(jià)值，有助于為人們聽力保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。