楊昌彪，李占彬，闕云飛，黃永橋，包娜，崔姍姍，趙莎，馬凱*

1(貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽,550014)2(貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽,550014)

火鍋?zhàn)鳛樽钍軞g迎的中國傳統(tǒng)美食之一,其食品安全受到高度的關(guān)注。一些不法商販在火鍋食品中摻入罌粟殼以吸引回頭客。罌粟殼俗稱大煙殼，有止痛、止咳等作用，其主要成分包含罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因等多種生物堿類有毒物。消費(fèi)者長(zhǎng)期食用含有罌粟殼的食物及相關(guān)產(chǎn)品容易對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，并可能造成慢性中毒[1]，甚至?xí)霈F(xiàn)內(nèi)分泌失調(diào)等癥狀，最終上癮，具有潛在的吸食毒品的傾向，給社會(huì)造成極壞的影響[2]。此外，為防止火鍋食品的細(xì)菌滋生，影響保質(zhì)期及防止中毒，個(gè)別商家還添加了衛(wèi)生部公布的食品中違法添加的物質(zhì)——喹諾酮類抗生素。若長(zhǎng)期食用殘留喹諾酮類藥物的食品，藥物會(huì)在人體內(nèi)積累，會(huì)使致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而危害人類健康。所以，建立一種同時(shí)測(cè)定火鍋食品的生物堿和喹諾酮類物質(zhì)的檢測(cè)方法，為促進(jìn)火鍋行業(yè)的發(fā)展及保障消費(fèi)者的健康安全具有重要意義。

目前，檢測(cè)食品中罌粟殼的生物堿和喹諾酮類物質(zhì)常用的方法有液相色譜法[3-4]、氣相色譜法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[7-10]。而喹諾酮類藥物檢測(cè)方法多集中在動(dòng)物源性食品和環(huán)境等領(lǐng)域[11-14]，補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《BJS 201909》中涉及11種喹諾酮類藥物的檢測(cè)，其他關(guān)于火鍋食品中喹諾酮類藥物分析的研究鮮見報(bào)道[15-16]。在目前分析技術(shù)手段中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法最具普遍性和實(shí)用性，其前處理簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高。本研究將結(jié)合QuEChERS前處理技術(shù)，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MSMS)同位素內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定火鍋食品中5種生物堿和15種喹諾酮類物質(zhì)，為火鍋食品中生物堿和喹諾酮類物質(zhì)的測(cè)定提供快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1290/6470超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；L-500型高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；N-EVAP 12氮吹儀，美國Organomation公司；電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；UMV-2多管旋渦混合器，北京普立泰科儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器，蘇州江東精密儀器有限公司；Milli-Q Intergra115實(shí)驗(yàn)室超純水制備系統(tǒng)，美國Millipore公司；移液器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5～50 mL瓶口分液器，德國普蘭德公司。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)、0.22 μm PTFE微孔濾膜、粒度40～63 μm乙二胺-N-丙基硅烷(primary-secondary amine，PSA)填料和C18填料，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)，山東西亞化學(xué)股份有限公司；MgSO4(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CH3COONa(分析純)，天津市博迪化工有限公司。

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度分別為50.0、50.0、10.0、10.0和10.0 μg/mL)，喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、嗎啡-d3溶液、可待因-d3溶液、諾氟沙星-d5溶液、恩諾沙星-d5溶液、環(huán)丙沙星-d8溶液(質(zhì)量濃度均為100.0 μg/mL)，天津阿爾塔科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:分別準(zhǔn)確稱取0.50 mL的嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.05 mL喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL(嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為5 000 ng/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制:分別準(zhǔn)確取0.10 mL的嗎啡-d3溶液、可待因-d3溶液、諾氟沙星-d5溶液、恩諾沙星-d5溶液和環(huán)丙沙星-d8溶液至10 mL容量瓶中，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液的制備：分別取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.010、0.050、0.10、0.25和0.50 mL于5個(gè)10 mL容量瓶中，并向不同濃度的容量瓶中準(zhǔn)確加入0.10 mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，得質(zhì)量濃度為1、5、10、25和50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中嗎啡和可待因的質(zhì)量濃度為5、25、50、125和250 ng/mL。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理方法

1.3.2.1 試樣制備和保存

取待測(cè)半固體樣品(>200 g)放入均質(zhì)機(jī)中，勻漿混勻；取待測(cè)液體樣品(>200 g)置玻璃燒杯中，攪勻。將制備完的樣品，裝于潔凈的聚四氟乙烯瓶中，密封并標(biāo)記，于-18 ℃保存，備用。

1.3.2.2 提取

稱取2 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)溶液，加入1粒陶瓷均質(zhì)子，再加入5 mL水，漩渦混合30 s，使樣品分散均勻，加入乙腈-1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸10 mL，置于多管漩渦混合器中，振蕩提取5 min，然后加入1.5 g CH3COONa，6 g MgSO4，迅速振搖，以4 200 r/min離心5 min，待凈化。

1.3.2.3 凈化

吸取6 mL上清液加到預(yù)先放置1 200 mg無水MgSO4、400 mg PSA及400 mg C18填料的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，4 200 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取2 mL上清液于15 mL離心管中，45 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mLV(乙腈)∶V(水)=1∶9混合液定容，渦旋復(fù)溶，過PTFE微孔濾膜，使用UPLC/MSMS進(jìn)行分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫程序：0～2 min(10% B)，2～6 min(10%～30% B)，6～9 min(30%～50% B)，9～11.5 min(50%～95% B)，11.5～14.5 min(95% B)，15.0～16.0 min(95%～10% B)，16.0～20.0 min(10% B)。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring，MRM)，正離子掃描，毛細(xì)管電壓5 500 V，噴嘴電壓500 V，霧化氣壓力45 psi，干燥氣流速8 L/min，干燥氣溫度300 ℃，鞘氣流速10 L/min，鞘氣溫度300 ℃，各目標(biāo)物定性、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)列于表1。

表1 目標(biāo)物的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for the analytes

續(xù)表1

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

本研究采用超高效液相色譜，為保證分離效果和峰形，選擇1.8 μm粒徑，規(guī)格為2.1 mm×150 mm的超高效液相色譜柱，經(jīng)試驗(yàn)，在20 min內(nèi)完成了20種化合物的分離，與傳統(tǒng)色譜柱相比，分離效果較好，峰形更加優(yōu)異。由于被分析物均在正離子模式下掃描，為了提高離子化效率，本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水、乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈-0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸銨溶液)等不同的流動(dòng)相體系，經(jīng)過比較，發(fā)現(xiàn)甲酸更有利于各化合物的離子化，質(zhì)譜響應(yīng)較好，同時(shí)，流動(dòng)相中添加銨鹽，改善了被分析物的峰形和分離效果，最終選擇了乙腈-0.1%甲酸水(含5 mmol/L乙酸銨溶液)作為流動(dòng)相體系進(jìn)行色譜分析。

實(shí)驗(yàn)對(duì)定容溶液進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用不同比例有機(jī)溶劑的溶液作為樣品前處理后的定容液或標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，會(huì)對(duì)目標(biāo)物峰形產(chǎn)生顯著的影響，有機(jī)溶劑比例過高會(huì)造成部分目標(biāo)物的色譜峰形坍塌，特別是嗎啡和可待因的色譜峰嚴(yán)重拖尾。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，確定以V(乙腈)∶V(水)=1∶9溶液作為定容溶液，再通過色譜分離，可獲得良好的峰形，如圖1所示。

1～20分別代表嗎啡、可待因、伊諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、氟羅沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、奧比沙星、司帕沙星、蒂巴因、沙拉沙星、雙氟沙星、罌粟堿、那可丁、噁喹酸、氟甲喹圖1 各目標(biāo)物特征離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of the compounds

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣的方式，將配制好的各組分混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，注入質(zhì)譜儀進(jìn)行全掃描，得到的母離子均為[M+H]+，在正離子模式(ESI+)下，優(yōu)化錐孔電壓，對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描和MRM掃描，獲得每個(gè)母離子的特異碎片離子，優(yōu)化碰撞能量，選擇2個(gè)豐度較高的離子作為定量和定性離子，各目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見表1。以優(yōu)化好的質(zhì)譜參數(shù)聯(lián)機(jī)液相色譜儀，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、霧化氣壓力、干燥氣流量和溫度、鞘氣溫度和流量等離子源參數(shù)，最后選擇的參數(shù)見1.4.2中的質(zhì)譜條件。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

2.3.1 樣品的提取

喹諾酮類化合物結(jié)構(gòu)上既有羥基，又有叔氨基，是兩性化合物，易溶于酸性或堿性溶液，罌粟殼5種生物堿屬弱堿性化合物?；疱伿称坊|(zhì)較為復(fù)雜，在添加溶劑提取前，需要加水對(duì)樣品進(jìn)行分散，增加提取溶劑與樣品的接觸面積。在已有研究的基礎(chǔ)上，本文采用QuEChERS法常用的乙腈作為提取溶劑，分別考察了在相同加標(biāo)量10 μg/kg(嗎啡、可待因50 μg/kg)的情況下純乙腈、乙腈-1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸、乙腈-1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸對(duì)各目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果以回收率表示。3種不同溶劑中，乙腈-1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸提取效果優(yōu)于其他2類溶劑，回收率最低的嗎啡為38%，最高的達(dá)氟沙星為142%(圖2)。從溶劑整體效果考慮，選擇1%甲酸乙腈作為實(shí)驗(yàn)溶劑提取劑。

圖2 不同提取溶劑的回收率Fig.2 Recoveries of analytes with different extraction solvents

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)的考察

通過優(yōu)化的前處理過程和儀器條件，分別測(cè)定空白提取液與純?nèi)軇┲懈髂繕?biāo)物的離子響應(yīng)值，考察各目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)，基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行，如公式(1)所示：

(1)

式中：A，空白樣品基質(zhì)中目標(biāo)物的離子響應(yīng)值；B，純?nèi)軇┲懈髂繕?biāo)物相同濃度的離子響應(yīng)值。

當(dāng)ME<0.5或者>1.5時(shí)，表示存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或者增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)0.8

圖3 優(yōu)化的凈化條件下各目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effects of the compounds under optimum purification conditions

2.4 線性范圍與檢出限

移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用V(乙腈)∶V(水)=1∶9溶液稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照已優(yōu)化的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，罌粟堿、那可丁、蒂巴因以定量離子的峰面積(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，其他目標(biāo)物以定量離子與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面比值(y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，各組分的線性范圍在1.0～250 ng/mL，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)≥0.997 5，結(jié)果見表2。采用空白樣品添加目標(biāo)物，按照1.3.2樣品前處理步驟進(jìn)行處理，并上機(jī)測(cè)定，以定量離子峰的3倍信噪比(signal-to-noise ratio，S/N)確定方法的檢出限(limit of detection，LOD)，各目標(biāo)物的檢出限見表2。

表2 目標(biāo)物的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear ranges, linear regression equations, correlation coefficients and LODs of the compounds

續(xù)表2

2.5 方法回收率與精密度

為驗(yàn)證此方法的可靠性，選取空白樣品，分別加入低、中、高3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2前處理方法處理樣品，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，采用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量，計(jì)算平均回收率和精密度，如表3所示。結(jié)果表明，本研究建立的方法在不同加標(biāo)水平下，平均回收率為74.6%～114.8%，精密度(relative standard deviation，RSD)<15.1%，具有較高的回收率和良好的精密度，能夠滿足火鍋食品中添加的喹諾酮類藥物和罌粟殼中生物堿檢測(cè)的要求。

表3 三個(gè)加標(biāo)水平下目標(biāo)物的回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and repeatabilities of the compounds spiked at three levels (n=6)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

通過對(duì)超市及自制餐館采集3個(gè)類別25批次樣品，其中羊肉湯10批次，牛肉湯10批次及其他預(yù)包裝火鍋食品5批次，進(jìn)行生物堿及喹諾酮類化合物檢測(cè)，結(jié)果見表4。檢測(cè)的25批次火鍋食品中7批次檢出罌粟堿類殘留物，其中2批次羊肉湯檢出嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因5個(gè)物質(zhì)，含量為20.3～627 μg/kg；另外5批次檢出不同類別的罌粟堿類藥，含量為9.07～626 μg/kg，其余的火鍋食品均未檢出罌粟堿類和喹諾酮類藥物，本研究檢測(cè)出的生物堿類藥物和喹諾酮類藥物結(jié)果與馮月超等[15]、李航等[18]研究結(jié)果相當(dāng)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)按要求進(jìn)行了平行樣及加標(biāo)回收質(zhì)量控制，5種生物堿和15種喹諾酮類物質(zhì)的質(zhì)控回收結(jié)果為69.2%～107%，均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》要求，表明結(jié)果準(zhǔn)確、可靠?；疱伿称分袡z出生物堿類藥物的原因主要是添加了罌粟殼或使用含有罌粟堿類藥物的香料導(dǎo)致；而未檢出喹諾酮類藥物主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)代表樣主要為鮮的湯料，不需要添加殺菌劑；其次預(yù)包裝的火鍋食品為正規(guī)的生產(chǎn)商，質(zhì)量控制較好，所以生物堿類藥物及喹諾酮類均未檢出。

表4 不同類別火鍋食品中目標(biāo)化合物檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of the compounds in different kinds of hotpot food

3 結(jié)論

本文結(jié)合QuEChERS前處理技術(shù)，對(duì)提取及凈化方法、色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了同時(shí)測(cè)定火鍋食品中5種生物堿及15種喹諾酮類物質(zhì)的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，適合火鍋食品的非法添加物生物堿及喹諾酮類物質(zhì)的快速篩查，為市場(chǎng)食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。