韓曉云，胡長林，許 可，鄭桂華，郭宇豪，孫慶申

（1黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高等學校分子生物學重點實驗室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高等學校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米芯、秸稈等是重要的生物質(zhì)資源，對其進行深度開發(fā)利用具有重要的理論意義及實踐價值[1]。黑龍江省是農(nóng)業(yè)大省，每年秋季產(chǎn)生大量包括玉米芯在內(nèi)的農(nóng)業(yè)廢棄物[2]，這些玉米芯除了少部分被回收利用生產(chǎn)吸附劑、餐具、多酚、納米纖維素、催化劑、糠醛及糠醇[3-8]，大部分都被焚燒掉，不僅造成環(huán)境污染，而且燃燒釋放的氮、硫氧化物對人體健康也構(gòu)成威脅[9]。隨著人們對環(huán)境保護意識的增強，以焚燒包括玉米芯在內(nèi)的農(nóng)業(yè)廢棄物已經(jīng)被嚴令禁止，因此，尋求快速降解玉米芯的方案，提高其生物可利用性是迫切需要解決的問題。

玉米芯主要由木質(zhì)素和纖維素組成，結(jié)構(gòu)堅實，難降解[10]，為此，目前采用化學、生物學方法來降解纖維素。其中生物法，特別是微生物降解法因其對環(huán)境友好，不會造成二次污染而備受青睞[11]。在生物法降解纖維素木質(zhì)素方面，目前用的較多的是各種真菌如嗜熱毛殼菌[10]，利用其產(chǎn)酶性來降解木質(zhì)纖維素[1,10-14]。基于微生物降解木質(zhì)纖維素的優(yōu)良特性，本課題組自2013年開始開展了以牛糞玉米芯為發(fā)酵基質(zhì)，培育巴西菇項目的研究，并獲得國家技術(shù)發(fā)明專利一項[15]。但是牛糞富集、曬干，再與玉米芯混合發(fā)酵，過程繁瑣，且也存在著污染環(huán)境的問題。牛屬于反芻動物，牛瘤胃的微生物大多都是細菌，本研究是從牛糞體系中篩選出纖維素降解菌，研制出可有效降解玉米芯的復合菌劑，代替牛糞發(fā)酵降解玉米芯的纖維素、半纖維素，從而提高其生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用到的牛糞和玉米芯均來自黑龍江省銀沐生物科技有限公司。實驗試劑：羧甲基纖維素鈉，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；其他試劑均為分析純。實驗在黑龍江大學工業(yè)發(fā)酵分析實驗室，于2019年12月—2020年11月進行。

1.2 菌株的富集培養(yǎng)

按照本課題組專利[15]的方法制備牛糞玉米芯發(fā)酵料，采用二次發(fā)酵法，即分別于37℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵3天，57℃發(fā)酵2天，每隔36 h進行翻堆和補水。將37℃發(fā)酵3天、57℃發(fā)酵2天的牛糞玉米芯發(fā)酵料以及干牛糞各5 g，分別加入95 mL的無菌生理鹽水制成懸液，分別利用PDA平板和LB平板進行菌落計數(shù)。

1.3 纖維素降解菌株的篩選及鑒定

初步形態(tài)學觀察，確定上述純化菌株為細菌，將上述純化菌株用LB液體培養(yǎng)基，37℃，120 r/min搖床培養(yǎng)12 h待用。

1.3.1 初篩 參考文獻[16-17]，使用剛果紅法對菌株進行初篩。

1.3.2 復篩 采用改良后的濾紙酶活法[18]對初篩結(jié)果中具有纖維素酶活的菌株進行復篩，參考文獻[19]的方法制備液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將初篩得到的菌株以濾紙酶活為指標測定菌株的纖維素酶活力。

1.3.3 菌株鑒定 將復篩后得到的目標菌株接種于LB平板上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色等特征，革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。并根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》[20]及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]，設計了甲基紅實驗，淀粉水解實驗，吲哚實驗，V-P實驗，過氧化氫實驗和糖酵解實驗對菌株進行初步鑒定。最后將純化的目標菌株樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行鑒定，所得序列提交NCBI網(wǎng)站進行Blast比對，并獲得NCBI序列號。

1.4 復合菌劑構(gòu)建

1.4.1 菌株拮抗實驗 將復篩獲得的菌株于LB平板上兩兩相交劃線，37℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌株相交處是否有菌落生長，菌落生長完好表示菌株間沒有拮抗作用，可進行復合菌劑的制備。

1.4.2 復合菌劑酶活力測定 根據(jù)前期平板菌落計數(shù)結(jié)果，將沒有拮抗作用的目標菌株以等菌落數(shù)加入至50 mL的LB液體培養(yǎng)基中進行復配，參照文獻[18]的方法對優(yōu)勢降解菌單一菌株和復合菌劑分別進行羧甲基纖維素酶(CMCase)、β-葡萄糖苷酶(β-Gase)和濾紙酶活(FPA)測定。

1.5 復合菌劑對玉米芯的發(fā)酵效果評價

1.5.1 牛糞玉米芯發(fā)酵料的制備 參考本實驗室的方法[15]進行。

1.5.2 復合菌劑玉米芯發(fā)酵料的制備 對牛糞玉米芯發(fā)酵料配方進行改良，因使用了復合菌劑代替牛糞，本實驗將其他配料加入量修改為：玉米芯88.24%、復合菌劑為10.59 log CFU/g、石膏1.18%、石灰1.18%、尿素0.47%和麩皮8.93%，混合后，加水攪拌，用力握緊發(fā)酵料有水從指縫滲出，然后放入37℃培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵，每間隔36 h進行翻堆和補水。

發(fā)酵料的取樣采樣點為堆料的四角和中心點處，采樣點的深度為3～4 cm，各點取樣50 g混勻。每隔6天取樣，每個樣品3個生物學重復。

1.5.3 纖維素降解率測定 使用纖維素測定儀（SLQ-202型，上海纖檢儀器有限公司）測量樣品中的纖維素含量并計算其降解率。試樣中的纖維素含量，按公式(1)進行計算。

式中：CF—纖維素的百分含量(%)；A1—坩堝+纖維+殘渣及灰分質(zhì)量(g)；A2—坩堝+殘渣及灰分質(zhì)量(g)；S1—試樣質(zhì)量(g)。

然后按照公式(2)計算纖維素降解率。

式中Y—纖維素降解率(%)；X0—初始玉米芯纖維素含量；X1—試樣中玉米芯纖維素含量。

1.5.4 木質(zhì)素降解率測定 使用范式測定法[22]測定樣品中木質(zhì)素含量，按公式(3)進行計算。

式中：X—試樣中木質(zhì)素的含量(g/100 g)；m1—烘干恒重后的試樣和濾紙質(zhì)量(g)；m2—濾紙質(zhì)量(g)；m3—試樣的質(zhì)量(g)；100—單位換算系數(shù)。

1.5.5 發(fā)酵料的結(jié)構(gòu)表征測定 X-Ray分析將發(fā)酵后發(fā)酵料粉碎，過60目篩，利用D/max-r B型X射線衍射儀（D/max-r B型，日本理光光學電機公司）測定其X-射線衍射圖譜。根據(jù)衍射圖譜強度，利用高度法計算纖維素結(jié)晶度，見公式(4)。

式中I002—002晶面衍射強度；Iam—無定型區(qū)衍射強度。

紅外光譜檢測稱取發(fā)酵后發(fā)酵料粉末2 mg，與200 mg在105℃條件下烘干至恒重的溴化鉀粉末混合均勻，研磨后壓片，利用傅里葉紅外光譜儀（Magna-560型，美國尼高力公司），掃描范圍為4000～370 cm-1，得到紅外光譜圖。

掃描電鏡觀察將發(fā)酵前后的玉米芯顆粒水洗至表面沒有雜質(zhì)，將玉米芯顆粒切成0.3 mm厚的均勻薄片，貼在導電膠上，加速電壓為15 kV，樣品表面進行60 s噴金處理，采用QUANTA200掃描電鏡（QUANTA200型，荷蘭FEI公司），觀測發(fā)酵前后玉米芯表面結(jié)構(gòu)的破壞程度和結(jié)構(gòu)的變化情況。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

本研究中利用PDA平板從干牛糞中分離到4株菌（BC-1、BC-6、BC-8和BC-9），從牛糞和玉米芯37℃發(fā)酵料和57℃發(fā)酵料中分別分離到9株和4株菌，但是在之后的形態(tài)學觀察（鏡檢）和革蘭氏染色后，初步判定都是細菌，所以后來培養(yǎng)都采用LB培養(yǎng)基，不再使用PDA培養(yǎng)基。對干牛糞，37℃發(fā)酵3天牛糞玉米芯發(fā)酵料和57℃發(fā)酵2天的牛糞玉米芯發(fā)酵料分離純化得到菌株56株，將干牛糞中分離出的菌株編號為BC，37℃發(fā)酵3天牛糞玉米芯發(fā)酵料命名為B1，57℃發(fā)酵2天的牛糞玉米芯發(fā)酵料命名為B2。其中有17株其菌落較為干燥，39株較為濕潤；14株菌落顏色為黃色或深黃色，42株為乳白色。

2.1.1 纖維素降解菌篩選結(jié)果 如圖1剛果紅培養(yǎng)基初篩結(jié)果所示，56株菌中，能產(chǎn)生透明圈的菌株共35株，可以證明這35株菌株都能產(chǎn)生纖維素酶，屬于纖維素降解菌。

圖1 纖維素降解菌利用剛果紅培養(yǎng)基初篩結(jié)果

2.1.2 濾紙酶活復篩結(jié)果 在初篩所篩選出的35株菌株中有14株菌株的濾紙酶活力均在9.0 U/mL以上，分別為BC-2W，BC-2Y，BC-7W，BC-7Y，BC-12W，BC-12Y，BC-15W，BC-15Y，B1-2，B1-11，B2-1，B2-7，B2-8，B2-9。其中最高為B2-9，酶活為18.40 U/mL。在接下來的復合菌劑的制備中，將以這14株菌株作為目標菌株。

2.2 纖維素降解菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學與生理生化鑒定 如圖2和表1所示，除BC-12Y和BC-15Y為革蘭氏陽性菌(G+)外，其余菌株均為革蘭氏陰性菌(G-)。菌體大小(μm)范圍在(0.8±0.65)×(0.60±0.04)～(3.48±0.78)×(0.86±0.07)之間。生理生化實驗結(jié)果表明，初步判斷B1-2、B1-11、B2-7、B2-8、B2-9、BC-2Y、BC-2W、BC-7Y、BC-7W、BС-12W、BC-15W和B2-1為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，BC-12Y和BC-15Y為微小桿菌科(Microbacillaceae)。

表1 纖維素降解菌生理生化鑒定結(jié)果

圖2 纖維素降解菌革蘭氏染色圖片(1000×)

2.2.2 分子生物學鑒定結(jié)果 分子生物學鑒定結(jié)果如表2所示。菌株B1-2、B1-11、B2-7、B2-8、B2-9、BС-2W、BС-2Y、BС-7W、BС-7Y、BС-12W、BС-15W均屬于腸桿菌屬，同源序列相似性達到99%，結(jié)合菌株形態(tài)學特征和生理生化特征及系統(tǒng)進化樹分析，最后確定菌株B1-2、B1-11、BС-2W、BС-2Y、BС-7W、BС-7Y為阿氏腸桿菌(Enterobacter asburiae)；B2-7為路德維希腸桿菌(Enterobacter ludwigii)；B2-8、B2-9、BC-15W為霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)，BС-12W為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。與B2-1相似性最高的菌株屬于克雷伯氏菌屬，同源序列相似性達到99%，結(jié)合菌株的形態(tài)學特征和生理生化特征及系統(tǒng)進化樹分析，最后確定菌株B2-1為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。BС-12Y和BС-15Y與微小桿菌屬相似性最高，結(jié)合菌株的形態(tài)學特征和生理生化特征及系統(tǒng)進化樹，最后確定菌株BC-12Y為微小桿菌(Exiguobacterium)，BС-15Y 為 乙 酰 微 小 桿 菌(Exiguobacterium acetylicum)。因為 BС-12W，B2-1為致病菌，因此在復合菌劑的制備中不使用此兩株菌株。

表2 菌株16S rDNA序列比對結(jié)果

2.3 復合菌劑構(gòu)建結(jié)果

2.3.1 菌株拮抗實驗結(jié)果 為了得出各個菌株之間的拮抗作用，用平板劃線法將不同的菌株進行兩兩相交劃線，然后得到菌株之間的拮抗關(guān)系，結(jié)果見圖3。在3個劃線交點處都可見菌落正常生長，沒有空斑出現(xiàn)，表明兩兩菌株相遇后其生長不受抑制，從而證明所選12株菌株相互之間均沒有拮抗作用，它們均可以進行下一步復配實驗。

圖3 部分菌株劃線拮抗實驗結(jié)果

2.3.2 復合菌劑酶活力測定結(jié)果 復合菌劑CM與單菌株酶活力測定結(jié)果見圖4，復合菌劑CM的濾紙酶活(FPA)、β-葡萄糖苷酶活(β-Gase)和羧甲基纖維素酶活(CMCase)分別為15.72±0.37 U/mL、1.26±0.20 U/mL和2.61±0.20 U/mL。其中FPA活力均顯著高于其他單菌株酶活力(P＜0.01)，結(jié)果表明復合菌劑CM的3種酶活強于其他單菌株酶活，證明復合菌劑構(gòu)建有效。

圖4 單一菌株與復合菌劑CM酶活比較圖

2.4 復合菌劑對玉米芯的發(fā)酵效果

2.4.1 纖維素及木質(zhì)素降解率測定結(jié)果 發(fā)酵料中玉米芯纖維素與木質(zhì)素降解率測定結(jié)果見圖5。

圖5 玉米芯纖維素及木質(zhì)素降解率

在整個發(fā)酵過程中，復合菌劑對纖維素的降解效果均高于牛糞，復合菌劑發(fā)酵后的纖維素降解率為(55.63±2.21)%，牛糞發(fā)酵后的纖維素降解率為(51.34±0.60)%。說明復合菌劑CM可有效降解玉米芯。

3組樣品在相同條件下發(fā)酵，木質(zhì)素降解率隨著時間的增加呈現(xiàn)上升趨勢。發(fā)酵終點時，復合菌劑發(fā)酵玉米芯后木質(zhì)素降解率(41.56±4.17)%，高于牛糞發(fā)酵玉米芯后木質(zhì)素降解率(38.90±2.57)%，通過對木質(zhì)素的測定可知，復合菌劑CM可以有效降解木質(zhì)素。有研究顯示，木質(zhì)素酶通過首先降解木質(zhì)素，使得纖維素酶更能夠靠近底物，從而促進纖維素的降解[14]。因此，對于玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物，木質(zhì)素與纖維素的降解存在一定的協(xié)同作用，在降解這類生物質(zhì)能源時，需要降解菌劑能夠?qū)δ举|(zhì)素和纖維素進行聯(lián)合作用[1]，這也是本研究的主要依據(jù)之一。

2.4.2 發(fā)酵料的結(jié)構(gòu)表征測定 化學結(jié)構(gòu)的改變是反應木質(zhì)纖維素降解過程的直觀表現(xiàn)[1]，因此，本研究對不同處理玉米芯材料的降解效果通過不同的結(jié)構(gòu)表征手段進行了分析，如圖6所示。

圖6 發(fā)酵料X-射線衍射、FTIR及掃描電鏡結(jié)果

X-射線衍射檢測結(jié)果纖維素由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)構(gòu)成，而半纖維素和木質(zhì)素均為無定形區(qū)。結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率稱作結(jié)晶度，它反映了纖維素聚集時形成結(jié)晶的程度[23]。一般認為，在22°出現(xiàn)的衍射峰代表纖維素結(jié)晶區(qū)的晶面衍射強度峰，而在18°左右的峰代表的是無定形區(qū)衍射強度峰。經(jīng)計算，發(fā)酵前的玉米芯，結(jié)晶度為33.13%；自然發(fā)酵的玉米芯，結(jié)晶度為31.20%；經(jīng)牛糞發(fā)酵后的玉米芯，結(jié)晶度為29.29%；經(jīng)復合菌劑發(fā)酵后的玉米芯結(jié)晶度為28.30%。由于結(jié)晶纖維素大分子排列緊密，水分子一般不能進入。水分子只能進入到結(jié)構(gòu)松散的無定形區(qū)，又因為水分子有一定的極性，所以與無定形區(qū)中的羥基以氫鍵結(jié)合，發(fā)生結(jié)晶區(qū)之間的潤脹。導致發(fā)酵前的玉米芯在22°與18°的相對衍射強度均較高。玉米芯經(jīng)發(fā)酵后，對于纖維素的作用主要集中于無定型區(qū)，對于纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞程度很有限，遠遠小于非結(jié)晶區(qū)的降解，因而結(jié)晶度下降程度不明顯。相比較，復合菌劑對于玉米芯纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞作用略高于牛糞。

結(jié)果表明，在3413 cm-1處為玉米芯中—OH的伸縮振動峰，在2920 cm-1處為CH3的對稱伸縮振動峰，在1637 cm-1處為C=C的伸縮振動峰。在1377、1733 cm-1處的振動峰分別屬于纖維素與半纖維素C-H變形鍵和木聚糖C=O鍵特征峰[1]，經(jīng)過不同發(fā)酵處理的玉米芯在1733 cm-1處的振動峰都完全消失，表明木聚糖被完全降解。經(jīng)復合菌劑發(fā)酵后的玉米芯在1637 cm-1處的C=C伸縮振動峰相對增強，這是由玉米芯中C—C鍵斷裂形成C=C鍵所致，表明復合菌劑降解玉米芯中木質(zhì)纖維素的C—C鍵，形成不穩(wěn)定的C=C鍵，從而有效降解玉米芯。上述結(jié)果表明玉米芯中半纖維素和纖維素都得到了不同程度地降解。

掃描電鏡觀察可以更為直觀地反應出明顯的降解效果[1]，對不同處理的發(fā)酵后的玉米芯進行電鏡掃描觀察，結(jié)果如圖6所示。發(fā)酵前的玉米芯有較完整的外壁結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)有規(guī)律的孔狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，孔洞緊密排列，玉米芯自然發(fā)酵后孔洞變得疏松，外壁結(jié)構(gòu)變薄。經(jīng)過復合菌劑發(fā)酵后的玉米芯外壁結(jié)構(gòu)基本被破壞裂解，說明微生物對玉米芯起到了降解作用，且比牛糞發(fā)酵后的玉米芯表面結(jié)構(gòu)破壞更加明顯。

3 討論與結(jié)論

玉米芯的結(jié)構(gòu)致密，主要由木質(zhì)素、纖維素及半纖維素組成，難于降解，利用度低，為此，本課題組前期利用牛糞通過二次發(fā)酵法降解玉米芯，效果好[15]。由此推測，牛糞中的微生物對玉米芯的降解起到關(guān)鍵的作用。因為利用牛糞直接發(fā)酵需要對牛糞進行收集、晾曬、保存等，操作復雜，而將牛糞中的微生物分離出來，基于其對木質(zhì)素和纖維素的降解能力對其進行初篩，再將篩選到的菌株進行復配，實現(xiàn)不同菌株在降解玉米芯方面的優(yōu)勢互補，具有重要的理論及應用價值。

為此，本研究從牛糞與牛糞玉米芯發(fā)酵料中分離纖維素降解菌，其中從干牛糞中分離到了微小桿菌(BC-12Y)，乙酰微小桿菌(BC-15Y)，霍氏腸桿菌(B2-8、B2-9、BC-15W)，和阿氏腸桿菌(B1-2、B1-11、BС-2 W、BС-2Y、BС-7W、BС-7Y)，與前人[24-28]分別從板栗苞殼堆積物，土壤中，白蟻體內(nèi)，腐木、稻桿堆積的土壤，豬床40 cm墊料樣品中分離得到的菌株相同。但與文獻報道的菌株相比，本實驗中阿氏腸桿菌，微小桿菌及霍氏腸桿菌的纖維素降解能力較低，而路德維希腸桿菌的FPA酶活較高，可能是因為微生物生長環(huán)境不同，底物不同，其產(chǎn)酶能力不同。本研究從牛糞及牛糞玉米芯發(fā)酵體系中分離纖維素降解菌，因此所篩選出的菌株可能更適用于降解玉米芯。

對生物質(zhì)材料如秸稈、玉米芯等進行生物處理不僅對環(huán)境友好，而且成本低，所以已成為對生物質(zhì)原料進行轉(zhuǎn)化的首選[1]。大多數(shù)研究采用真菌來降解木質(zhì)素，如Xu等[1]利用樺褐孔菌產(chǎn)木質(zhì)素酶來降解秸稈生物質(zhì)。而本研究采用的菌株均為細菌，且復配后的復合菌劑對玉米芯木質(zhì)素降解率可達(41.56±4.17)%，對玉米芯的纖維素降解率為(55.63±2.21)%，高于黃穎婕等[29]與劉曉飛等[30]分別從牛糞堆肥與寒地黑土中分離出的解淀粉芽孢桿菌與放線菌GS-3-39的纖維素降解率。這可能因為單菌株酶活有限，而復合菌劑由不同微生物復配到一起，協(xié)同分泌纖維素酶來降解，此外，復合菌劑的加入，會使發(fā)酵基質(zhì)的pH進一步降低，有利于纖維素的降解[14]。

本實驗復合菌劑發(fā)酵后的玉米芯結(jié)晶度降低，玉米芯的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素特征峰相對吸光度減弱，外壁結(jié)構(gòu)基本被破壞，這與孫玲等[31]，劉曉飛等[30]所做研究結(jié)果一致，證明本研究中所復配的復合菌劑可有效降解玉米芯。

本實驗以牛糞及牛糞玉米芯發(fā)酵料為菌源進行分離純化，最終鑒定14株纖維素降解菌株，分別屬于7個菌種，這些菌株酶活力范圍在(9.15±0.81)U/mL～(12.06±1.43)U/mL之間。將其中12株菌種等菌落數(shù)復配，獲得的復合菌劑纖維素酶活力為(15.72±0.37)U/mL，對玉米芯纖維素降解率為(55.63±2.21)%，木質(zhì)素降解率為(41.46±0.87)%，有較強的纖維素及木質(zhì)素降解能力。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果證明復合菌劑發(fā)酵后的玉米芯結(jié)晶度最低，玉米芯的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素特征峰相對吸光度減弱，破壞程度最明顯，外壁結(jié)構(gòu)基本被破壞。本研究為新型玉米芯降解菌劑的開發(fā)奠定了理論基礎，也為后續(xù)復合菌劑的優(yōu)化與研發(fā)提供了理論依據(jù)。但是本研究中僅對具有降解纖維素和木質(zhì)素能力的菌株進行等比例復配，初步驗證了這些菌株之間的協(xié)同作用，后續(xù)將進一步研究這些菌株中降解纖維素和木質(zhì)素的關(guān)鍵菌株，并根據(jù)降解貢獻率優(yōu)化復配比例。