秦 花，李小燕，何 杰，李 婷

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(成都 610500)

隨著環(huán)境污染加劇、職業(yè)暴露和吸煙人群增多、人口老齡化及肺癌影像學(xué)篩查普及，肺癌患者數(shù)量呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年世界人口中肺癌新增病例約200萬人，直接或間接因肺癌死亡病例150萬人，其中70%以上的肺癌都屬于非小細(xì)胞肺癌[3]。而近年來，非小細(xì)胞肺癌中肺腺癌所占比例高于肺鱗癌，居第一位[3-4]。因肺腺癌起病相對(duì)較隱匿，早期并無特殊癥狀，以致部分患者確診時(shí)已錯(cuò)失手術(shù)良機(jī)，總體的5年生存率低于20%[5]。盡管目前研究[6]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種分子生物標(biāo)志可以輔助臨床用于肺腺癌的預(yù)后判斷，但均有一定的局限性和不足。因此,構(gòu)建一種新的、有效的預(yù)測(cè)模型有助于肺腺癌患者的預(yù)后判斷和個(gè)體化治療。

自噬是一種正常的生物過程，它將細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)組成轉(zhuǎn)移到溶酶體中，再將其分解為初級(jí)成分[7]。自噬的平衡出現(xiàn)異常將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)也可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)的信號(hào)通路，干擾腫瘤細(xì)胞的增殖周期和凋亡。如在黑色素細(xì)胞瘤中，miR-290-295簇能靶向結(jié)合ulk1、atg7等多個(gè)自噬相關(guān)基因，抑制黑色素瘤細(xì)胞自噬性死亡，以提高腫瘤細(xì)胞的生存力[9]?；騧tor參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的過程，也是miR-1271的靶基因。在非小細(xì)胞肺癌中，miR-1271與mtor呈負(fù)相關(guān)，miR-1271通過吸附mtor基因抑制其表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖[10]。

鑒于miRNA在肺癌自噬中的重要作用，本研究通過比較癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中肺腺癌與正常肺組織中不同的自噬基因，尋找與自噬基因相關(guān)的miRNA，并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(risk score，RS)模型，探討運(yùn)用自噬相關(guān)miRNA預(yù)后RS模型預(yù)測(cè)肺腺癌患者預(yù)后的可行性，為肺腺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2021年8月從TCGA官方網(wǎng)站(https://gdc-portal.nci.nih.gov/)下載肺腺癌患者的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)和miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床信息,測(cè)序數(shù)據(jù)由Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)獲得。數(shù)據(jù)內(nèi)容涉及肺腺癌患者535例腫瘤組織和59例癌旁組織及相關(guān)臨床信息。由于生存時(shí)間少于30 d的患者可能導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此將其刪除，最終納入肺腺癌患者的例數(shù)為490例。

1.2 研究方法

1.2.1 自噬相關(guān)miRNA的提取 從人類自噬數(shù)據(jù)庫(human autophagy database，HADb)(http://autophagy.lu/)中獲得自噬基因232個(gè)，通過ActivePerl軟件(版本號(hào)5.26)提取自噬基因在TCGA的表達(dá)譜以及miRNA的表達(dá)譜。采用R軟件中的“edgeR”包(https://www.R-project.org)對(duì)mRNA和miRNA測(cè)序表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，以log2(fold change)的絕對(duì)值>2和偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05設(shè)定為閾值，差異基因表達(dá)分析采用“edgeR”包。繪制熱圖展現(xiàn)差異表達(dá)的自噬基因和miRNA。使用R軟件中的“corrplot”包篩選出與自噬基因相關(guān)的miRNA，閾值設(shè)定為相關(guān)系數(shù)|r|>0.4，P<0.05，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2 隨機(jī)分組產(chǎn)生訓(xùn)練集和測(cè)試集 使用Excel軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù),將490例肺腺癌患者均分為訓(xùn)練集和測(cè)試集。訓(xùn)練集用來完成學(xué)習(xí)標(biāo)本特征分析和模型構(gòu)建，測(cè)試集用來完成內(nèi)部驗(yàn)證。

1.2.3 單因素Cox回歸分析聯(lián)合LASSO回歸分析篩選關(guān)鍵miRNA 為初步篩選出和生存預(yù)后相關(guān)的miRNA，使用R包“survival”對(duì)自噬相關(guān)miRNA進(jìn)行單因素Cox回歸分析，篩選出與預(yù)后相關(guān)的miRNA,并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比。為避免單因素Cox回歸分析結(jié)果可能有過度擬合的問題，通過R包“glmet”對(duì)單因素Cox回歸篩選出的結(jié)果再次進(jìn)行LASSO回歸分析。本研究使用10折交叉驗(yàn)證法來確定最小λ值，當(dāng)λ最小時(shí)模型最優(yōu)化。一旦確定了miRNA，應(yīng)用它們構(gòu)建基于如下表達(dá)式的預(yù)后RS模型，表達(dá)式如下所示：

1.2.4 預(yù)后模型評(píng)價(jià)和卡普蘭-梅爾估計(jì)量法描述生存分析 為驗(yàn)證肺腺癌預(yù)后RS模型是否可以用于肺腺癌患者的預(yù)后評(píng)估，本研究對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群和低風(fēng)險(xiǎn)人群采用卡普蘭-梅爾估計(jì)量法(Kaplan-Meier,K-M)進(jìn)行生存分析；其次，再次利用R軟件中的“survival”和“time ROC”包繪制3年及5年總生存率的受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)的曲線下面積(area under curve，AUC)，評(píng)估其預(yù)測(cè)3、5年生存率的能力。此外，本研究結(jié)合TCGA下載的肺腺癌臨床相關(guān)信息，如年齡、性別、病理分期等，對(duì)預(yù)后模型進(jìn)行多因素Cox回歸分析，以驗(yàn)證該模型所計(jì)算出的危險(xiǎn)評(píng)估是否可成為獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子，以諾莫列線圖的形式加以展示。

1.2.5 試驗(yàn)驗(yàn)證 1)標(biāo)本來源：收集成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2016年3月至2019年7月收治的肺腺癌患者50例，相應(yīng)的50例肺腺癌樣本及癌旁正常組織樣本通過外科手術(shù)或呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科纖支鏡活檢手術(shù)獲得，病理結(jié)果均確診為肺腺癌?；颊呒凹覍俸炇鹬橥鈺?，配合參與本研究試驗(yàn)，倫理申請(qǐng)通過成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。2)制劑：Trizol、實(shí)時(shí)定量PCR所需試劑、RIPA裂解緩沖液(美國，賽默飛世爾科技公司)。3)引物的設(shè)計(jì)和合成：按照GenBank中提供的人hsa-mir-31，hsa-mir-1293，hsa-mir-548f-1全長基因序列，由杭州艾比肯生物工程(浙江)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，以U6為內(nèi)參基因，制定的引物序列(表1)。4)PCR實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)時(shí)定量PCR嚴(yán)格按照商品的使用說明書進(jìn)行操作，所獲標(biāo)本進(jìn)行研磨后，用Trizol試劑從標(biāo)本中提取總RNA，用ND-1200核酸定量檢測(cè)儀(美國,賽默飛世爾科技公司)測(cè)定提取總RNA的濃度和吸光度值，以吸光度值1.8～2.0為合格?？俁NA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，所有樣本總RNA的吸光度值均為1.8～2.0，提示提取的總RNA質(zhì)量合格。按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(日本,Takara公司)合成cDNA，以u(píng)6為內(nèi)參；檢測(cè)在ABI 8000實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)定：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、34 s；總共40個(gè)循環(huán)；60 ℃退火30 s。計(jì)算2-ΔΔct作為相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的miRNA和參照基因的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 納入患者的基本情況

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的肺腺癌患者490例，隨機(jī)分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，兩組患者的臨床特征，包括年齡、性別、腫瘤分期、生存狀態(tài)和生存時(shí)間等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2),說明訓(xùn)練集和測(cè)試集的樣本來源于同一個(gè)總體，隨機(jī)分組合理。

表2 納入患者的基本資料和特征

2.2 自噬基因在肺腺癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)

總體樣本中，經(jīng)R軟件分析，滿足條件log2FC的絕對(duì)值>2和FDR<0.05的自噬基因共有30個(gè)。基因表達(dá)譜聚類熱圖展示了其在樣本中的表達(dá)(圖1)。

圖1 59例正常肺組織和490例肺腺癌組織中30個(gè)自噬基因的差異表達(dá)

2.3 自噬相關(guān)miRNA的確定

通過Perl軟件共提取出1 881個(gè)miRNA，篩選出70個(gè)差異表達(dá)的miRNA(圖2)，依據(jù)相關(guān)系數(shù)(|r|>0.4，P<0.05)獲得12個(gè)自噬相關(guān)miRNA，這12個(gè)自噬相關(guān)miRNA和5個(gè)自噬基因相關(guān)(圖3)。

圖2 70個(gè)差異miRNA的熱圖

圖3 自噬相關(guān)的12個(gè)miRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.4 構(gòu)建模型

訓(xùn)練集中，采用Perl軟件將每個(gè)樣本的臨床信息與miRNA的表達(dá)量進(jìn)行合并，單因素Cox回歸分析初步篩選出和肺腺癌預(yù)后相關(guān)的3個(gè)關(guān)鍵miRNA；通過LASSO回歸分析進(jìn)一步確定了3個(gè)關(guān)鍵的自噬相關(guān)miRNA，分別是hsa-mir-31、hsa-mir-1293和hsa-mir-548f-1(圖4)。3個(gè)自噬相關(guān)miRNA的生物學(xué)信息(表3)。

圖4 LASSO回歸模型篩選變量

表3 3個(gè)自噬相關(guān)miRNA的詳細(xì)信息

2.5 肺腺癌預(yù)后RS模型構(gòu)建和評(píng)價(jià)

訓(xùn)練集中，上述研究中所得的3個(gè)自噬相關(guān)miRNA，通過RS表達(dá)式再次計(jì)算出訓(xùn)練集中每個(gè)肺腺癌患者的預(yù)后RS，RS=0.048×hsa-mir-31+0.201×hsa-mir-1293+0.174×hsa-mir-548f-1，以中位值為界線將患者分成高、低風(fēng)險(xiǎn)組，并構(gòu)建相應(yīng)的預(yù)后模型。K-M生存分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的中位生存期是1.63年，預(yù)測(cè)3、5年患者的生存率分別為49%、25%，低風(fēng)險(xiǎn)組中位生存期是2.08年，3、5年生存率分別為74%、52%，低風(fēng)險(xiǎn)組總體生存時(shí)間(overall survival,OS)較高風(fēng)險(xiǎn)組長(P<0.05)(圖5A)；3年總生存率的AUC=0.796,5年總生存率的AUC=0.837(圖5B),該預(yù)后模型的C指數(shù)為0.811。與訓(xùn)練集一樣，測(cè)試集中高風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)越高的患者預(yù)后越差(P<0.05)(圖6A)，3年總生存率的AUC=0.684,5年總生存率的AUC=0.646(圖6B),并且R軟件計(jì)算出該預(yù)后模型的C指數(shù)為0.761。

圖5 訓(xùn)練集中模型的預(yù)測(cè)能力評(píng)估

圖6 測(cè)試集中模型的預(yù)測(cè)能力評(píng)估

2.6 肺腺癌預(yù)后RS模型在測(cè)試集中的驗(yàn)證

訓(xùn)練集中，以O(shè)S為因變量，以RS、年齡、性別、病理分期等多個(gè)因素作為協(xié)變量進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示RS與患者OS呈負(fù)相關(guān)，且可作為1個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)預(yù)后的因子(HR=2.100,95%CI=1.541～2.861,P<0.05)。經(jīng)過測(cè)試集驗(yàn)證，本預(yù)后模型也可作為1個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)預(yù)后的因子(HR=1.826,95%CI=1.282～3.425,P<0.05)(表4)。

表4 肺腺癌患者訓(xùn)練集、測(cè)試集的單因素和多因素分析比較(n=245)

2.7 諾莫列線圖建立

基于多因素Cox回歸系數(shù)建立諾莫列線圖(圖7A)；校正曲線提示,模型對(duì)3、5年的生存率均有較好的預(yù)測(cè)能力(3年的C指數(shù)為0.712，5年的C指數(shù)為0.705)(圖7B)。

圖7 模型形成諾莫列線圖

2.8 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

收集到的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的肺腺癌患者50例，其中男35例，女15例，年齡中位數(shù)為47歲，TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期10例。實(shí)時(shí)定量PCR提示，hsa-mir-31在肺腺癌中相對(duì)量表達(dá)水平為(3.381±0.265)，正常組織(0.682±0.014)(t=69.287，P=0.001)，hsa-mir-1293在肺腺癌中相對(duì)表達(dá)量表達(dá)水平為(1.862±0.054)，正常組織(0.161±0.021)(t=217.352，P=0.004)，hsa-mir-548f-1在肺腺癌中相對(duì)表達(dá)量表達(dá)水平為(0.967±0.179)，正常組織(0.217±0.041)(t=28.046，P=0.001)。3個(gè)miRNA在肺腺癌組織中表達(dá)均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖8)。

圖8 3個(gè)miRNA在肺腺癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)

3 討論

miRNA為一種轉(zhuǎn)錄長度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，伴有非完整的特異性開放閱讀框，同時(shí)缺乏編碼蛋白質(zhì)的功能[11]。目前許多研究[12-13]證實(shí),miRNA能夠通過組蛋白修飾、染色質(zhì)異構(gòu)、RNA代謝等生物學(xué)過程調(diào)控自噬基因的表達(dá)。多種腫瘤和miRNA的異常表達(dá)緊密相關(guān)，miRNA既可作為腫瘤抑制因子，又可作為促腫瘤生長因子[14]。有研究[15]報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌中，腫瘤抑制因子有l(wèi)et-7家族、miR-200、miR-486等；而另一方面，miR-31、miR-212及miR-196a具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長的作用[16]。miRNA以通過與靶標(biāo)基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合為主要途徑，沉默靶標(biāo)mRNA或者抑制mRNA的翻譯，以此調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達(dá)[17]。

miRNA的過表達(dá)、缺失或突變可通過調(diào)控腫瘤的自噬基因而對(duì)腫瘤的惡性生物行為產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)作用。Pishkari等[18]研究表明，在甲狀腺髓樣癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-183后LC3B表達(dá)量下降，腫瘤細(xì)胞增殖速度增快。此外，一些異常表達(dá)miRNA也與肺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，如程永華等[19]研究表明，miR-200b在非小細(xì)胞肺癌患者血清中表達(dá)量較健康人低,且低表達(dá)miR-200b的肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率明顯增高，OS更短。盡管目前關(guān)于miRNA在肺癌自噬中的研究已有很多，但多數(shù)是研究單個(gè)miRNA對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用，范圍較局限，自噬相關(guān)miRNA在肺腺癌中的作用和機(jī)制以及在臨床預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步探索。

本研究通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TCGA和HADb，獲得了肺腺癌患者自噬相關(guān)miRNA表達(dá)譜，用Perl軟件與生存相關(guān)信息匹配合并。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中的自噬基因存在異常表達(dá)，這些異常與患者的預(yù)后相關(guān)。針對(duì)自噬基因的表達(dá)改變，初步篩選出了自噬基因相關(guān)的miRNA有70個(gè)。為探尋單個(gè)自噬相關(guān)miRNA和臨床預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)行了單因素Cox回歸分析，篩選出12個(gè)自噬相關(guān)miRNA和臨床預(yù)后密切相關(guān)。但單因素Cox回歸分析每次僅納入1個(gè)變量，可能存在過度擬合的現(xiàn)象，進(jìn)一步使用LASSO回歸分析進(jìn)行降維可以降低過度擬合，最終確定了3個(gè)關(guān)鍵的自噬相關(guān)miRNA構(gòu)建模型。根據(jù)模型對(duì)每個(gè)肺腺癌患者計(jì)算預(yù)后RS，并按照預(yù)后RS的中位數(shù)值分為高危組患者和低危組患者，在高、低危組間運(yùn)用K-M生存分析，繪制ROC并計(jì)算C指數(shù),以評(píng)估該預(yù)后RS模型的預(yù)測(cè)精度，模型結(jié)果提示,低危組患者具有明顯的生存優(yōu)勢(shì)，3、5年總生存率的AUC值均較高，預(yù)示模型具有中等程度的預(yù)測(cè)能力。最后，將年齡、性別、病理分期等納入多因素Cox回歸分析，模型的HR=2.100,95%CI=1.541～2.861,P<0.05，說明可以作為1個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，并且諾莫列線圖提示預(yù)后模型具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值。為了更進(jìn)一步驗(yàn)證模型中3個(gè)miRNA的臨床意義，本研究收集了50例肺腺癌患者的腫瘤標(biāo)本，檢測(cè)這3個(gè)自噬相關(guān)miRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，hsa-mir-31、hsa-mir-1293、hsa-mir-548f-1的表達(dá)水平在肺腺癌組織中均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其結(jié)果與生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的趨勢(shì)一致。本研究中，hsa-mir-31與cdkn2a有共表達(dá)關(guān)系，研究[20]表明，hsa-mir-31是一種人體進(jìn)化中高度保守的miRNA，定位于人類染色體9q21.3上，cdkn2a并不是hsa-mir-31靶基因，不能直接受到hsa-mir-31的調(diào)控，兩者共表達(dá)關(guān)系可能與hsa-mir-31與cdkn2a位置相鄰有關(guān)，關(guān)于hsa-mir-1293，hsa-mir-548f-1和肺癌的研究報(bào)道較少，其與gapdh、birc5的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

雖然本研究模型中的3個(gè)miRNA與肺腺癌預(yù)后密切相關(guān)，且該模型可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子，但是目前暫缺乏關(guān)于它們調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，所以它們?cè)诜蜗侔┲兴l(fā)生的作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步探索。另外，本研究采用的生物信息分析方法和工具較多，利用系統(tǒng)方法處理大量的數(shù)據(jù)是其優(yōu)勢(shì)，但仍然存在一定的不足之處：1)大部分?jǐn)?shù)據(jù)均來自于TCGA數(shù)據(jù)庫，未通過其他數(shù)據(jù)庫再次對(duì)其驗(yàn)證；2)預(yù)后RS模型僅納入了自噬相關(guān)miRNA表達(dá)水平，未考慮其他基因改變，如LncRNA、circRNA等表達(dá)水平改變對(duì)預(yù)后的影響。在下一步研究中，將結(jié)合本研究的驗(yàn)證數(shù)據(jù)和隨訪信息,開展更為深入的生物學(xué)水平機(jī)制研究，同時(shí)考慮納入更多可能影響臨床預(yù)后的因素，如吸煙情況、LncRNA、circRNA表達(dá)水平等，以期構(gòu)建更穩(wěn)定和可靠的預(yù)后RS模型服務(wù)于肺癌患者。

綜上所述，本研究通過挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建了1個(gè)基于3個(gè)自噬相關(guān)miRNA的肺腺癌預(yù)后模型，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性中等，且該模型可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子，可能為肺腺癌機(jī)制的研究提供一定理論依據(jù)，為探索肺腺癌相關(guān)分子標(biāo)志物及個(gè)體化治療方案提供一定參考。