竇姍姍 高麗穎 林馨怡 孟 堯 董 康 程葆華

(濟寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟寧 272067)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的神經(jīng)退行性疾病[1]，其主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性變，并伴有路易氏小體(Lewy body，LB)出現(xiàn)。LB主要是由于α-突觸核蛋白(α-synuclein)的異常積累形成的[2]。PD的發(fā)病機制還不清楚，而線粒體功能障礙與PD發(fā)病機制密切相關(guān)[3-4]。

魚藤酮(rotenone)是一種細胞毒性物質(zhì)，可選擇性地抑制細胞呼吸鏈 NADH 脫氫酶(即復(fù)合物I，complex I)的活性，使NADH氧化為NAD的過程受阻，減少ATP生成，阻礙質(zhì)子傳遞，細胞中活性氧的含量進而增加，導(dǎo)致自由基過量累積，從而促進細胞凋亡[5-6]。

Apelin最初是從牛胃組織中分離出來的。Apelin-13、apelin-17和apelin-36是apelin前體肽經(jīng)水解生成的生物活性形式。越來越多的證據(jù)表明，apelin可能在PD模型中具有神經(jīng)保護作用[7-8]。

本實驗用魚藤酮刺激SH-SY5Y細胞，制作PD體外模型，然后用apelin-36干預(yù)，研究apelin-36的神經(jīng)保護作用及對線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y細胞)購自美國菌種保藏中心(ATCC)；DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；魚藤酮(美國Sigma公司)；Apelin-36(美國Phoenix Pharmaceuticals公司)；CCK-8(日本Dojindo公司)；Hoechst 33342檢測試劑盒(日本Dojindo公司)；線粒體復(fù)合物 I(complex I)ELISA 試劑盒(酶免),ADP/ATP比率檢測試劑盒(日本Dojindo公司)；RIPA裂解液(碧云天公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(天根生物公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(萬類生物公司)；α-synuclein抗體、bcl-2抗體、Bax抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(北京中杉金橋有限公司)。

1.1.2儀器 微量移液器(德國 Eppendorf公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；臺式低溫高速離心機(美國Beckman公司)；超聲波細胞粉碎儀(江蘇波場智能科技股份有限公司)；普通光學(xué)顯微鏡、倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡(SP8)(德國 Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)。將SH-SY5Y細胞接種于96、12或6孔板在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至約90%后，后續(xù)根據(jù)需要加入魚藤酮和apelin-36。

1.2.2藥物處理及分組 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，以5×104/孔的密度接種于96、12或6孔板中，隨機分成4組：對照組、apelin-36組、魚藤酮組、apelin-36+魚藤酮組，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至約90%，apelin-36組、apelin-36+魚藤酮組先給予apelin-36(10-6M)預(yù)處理，其他兩組加入相同劑量的PBS，魚藤酮組、apelin-36+魚藤酮組2h后給予魚藤酮(500 μM)處理，其他兩組加入相同劑量PBS，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然后進行后續(xù)實驗。

1.2.3細胞活力測定 用CCK-8法測定細胞活力。首先將SH-SY5Y細胞以5×104/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板中，細胞長至約90%，按上述方法進行藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，加入CCK-8溶液(10μl/孔)，避光繼續(xù)孵育2h。最后在酶標儀450nm處測量吸光度值。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗平行重復(fù)3次。

1.2.4細胞凋亡檢測 將SH-SY5Y細胞以5×104/孔的密度接種于12孔板的蓋玻片上，細胞長至約90%，后按上述方法藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，用PBS沖洗細胞，用4%多聚甲醛固定20min，然后用PBS清洗3次。隨后，加入5mg/ml的Hoechst 33342，避光在室溫下放置15min，再用PBS沖洗兩次。染色細胞在倒置熒光顯微鏡下成像。每組選擇3張照片，計數(shù)凋亡細胞數(shù)。

1.2.5線粒體復(fù)合物-I(complex I)檢測 SH-SY5Y細胞以5×104/孔的密度接種在6孔培養(yǎng)板中。細胞長至約90%，然后按上述方法進行藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，去除上清液，按照人Complex I ELISA試劑盒的說明進行操作。

1.2.6ADP/ATP比率檢測 SH-SY5Y細胞以5×104/孔的密度接種在白色96孔培養(yǎng)板中。細胞長至約90%，后按上述方法藥物處理。繼續(xù)培養(yǎng)約22h后，按照ADP/ATP比率檢測試劑盒說明操作。

1.2.7相關(guān)蛋白表達檢測 Western blotting用于檢測Bax、bcl-2、α-synuclein的表達，β-actin作為對照。方法如下：按上述方法處理細胞，然后將SH-SY5Y細胞中提取的等量蛋白質(zhì)(30μg)加載到10% SDS-PAGE上，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，用含5%無脂奶粉的TBST(含1%吐溫20的TBS緩沖液)封閉膜1h，然后在4℃與一抗孵育過夜。然后用TBST清膜3次，在室溫下與二抗(1:5000)孵育1h。最后加入ECL溶液，暗室內(nèi)曝光顯影。實驗平行重復(fù)3次，用ImageJ軟件分析目標條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Apelin-36對魚藤酮處理的SH-SY5Y細胞活力的影響

魚藤酮(500μM)降低了SH-SY5Y細胞存活率，而apelin-36(10-6M)預(yù)處理減輕了魚藤酮的神經(jīng)毒性并提高細胞活力。表明apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細胞存在一定的保護作用。見圖1。

注：***P<0.001 vs.對照組；###P<0.001 vs.魚藤酮組

2.2 Apelin-36對魚藤酮處理的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色結(jié)果(圖2A)顯示，與魚藤酮組相比，apelin-36減輕了魚藤酮引起的細胞凋亡，并顯著降低了細胞凋亡率(圖2B)。

注：***P<0.001 vs.對照組；###P<0.001 vs.魚藤酮組。

2.3 Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細胞中bcl-2、Bax和α-synuclein表達的影響

與對照組相比較，魚藤酮組bcl-2的表達顯著降低，Bax的表達顯著增加；而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比，apelin-36則明顯上調(diào)了bcl-2的表達，減少了Bax的表達(圖3A)。魚藤酮組bcl-2/Bax的比值與對照組相比明顯降低，而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比，bcl-2/Bax的比值明顯升高，說明apelin-36減輕了魚藤酮造成的細胞凋亡(圖3B)。與對照組相比，魚藤酮組α-synuclein的表達顯著增加，而apelin-36+魚藤酮組與魚藤酮組相比，apelin-36明顯減少了α-synuclein的表達(圖3C、3D)。

注：**P<0.01 vs.對照組；#P<0.05 vs.魚藤酮組；##P<0.01 vs.魚藤酮組

2.4 Apelin-36對魚藤酮誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細胞中complex I和ADP/ATP的影響

與對照組相比，魚藤酮組complex I的表達下調(diào)，ADP/ATP比率顯著上調(diào)；而與魚藤酮組相比，apelin-36和魚藤酮共處理組逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象。見圖4。

注：***P<0.001 vs對照組；###P<0.001 vs魚藤酮組；##P<0.01 vs 魚藤酮組

3 討論

線粒體是有氧呼吸發(fā)生的主要場所，除了為細胞提供能量外，線粒體還參與了細胞信息傳遞、細胞分化、和細胞凋亡等過程，而且擁有調(diào)控細胞生長和細胞周期的能力[9]。研究顯示錯誤折疊的α-synulein的過度累積導(dǎo)致了神經(jīng)退行性變，而線粒體功能障礙參與了錯誤折疊的α-synulein累積這一過程[10-11]。

魚藤酮是一種可直接透過細胞膜和血腦屏障的細胞毒性物質(zhì)。線粒體complex I可被魚藤酮選擇性地阻斷，從而使NADH的氧化過程受阻，ATP生成減少，細胞中活性氧族增加，進而自由基增加，進一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激[12]，最終引起細胞凋亡。因此魚藤酮可導(dǎo)致細胞線粒體功能障礙，引起細胞凋亡。在本實驗中，與對照組相比，魚藤酮組α-synulein表達明顯升高，bcl-2/Bax比值明顯降低，細胞活力明顯降低，細胞凋亡顯著增多。Bcl-2家族蛋白是典型的凋亡相關(guān)蛋白，可操控線粒體的外膜通透性。促凋亡蛋白Bax 可與抗凋亡蛋白bcl-2結(jié)合形成調(diào)節(jié)細胞凋亡的異二聚體，當細胞發(fā)生凋亡時，bcl-2/Bax比率降低[13]。與魚藤酮組相比，apelin-36和魚藤酮共處理組中α-synulein的表達明顯降低，說明apelin-36預(yù)處理可減少錯誤折疊的α-synulein累積；同時，apelin-36和魚藤酮共處理組中bcl-2/Bax比率明顯升高，細胞活力顯著升高，細胞凋亡則明顯減少，說明apelin-36預(yù)處理可減少細胞凋亡，因此apelin-36可減輕魚藤酮對SH-SY5Y細胞的神經(jīng)毒性作用，對神經(jīng)細胞起到保護作用。

魚藤酮通過阻斷complex I造成了ATP生成減少，而ATP的生成減少降低了線粒體膜電位(ΔΨm)，導(dǎo)致線粒體膜的通透性改變，引起了線粒體功能紊亂[14-15]。本研究首次在魚藤酮PD體外模型中通過檢測線粒體complex I的表達和ADP/ATP的比率，來討論apelin-36是否可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂。與對照組相比，魚藤酮組complex I的表達明顯降低，而ADP/ATP的比率顯著升高，這說明魚藤酮造成了線粒體功能紊亂。與魚藤酮組相比，apelin-36和魚藤酮共處理組complex I的表達明顯升高，而ADP/ATP的比率顯著降低，說明apelin-36可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂。

綜上所述，apelin-36可以減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂，減少錯誤折疊的α-synulein累積，提高細胞活力，減少細胞凋亡，起到神經(jīng)保護作用。而apelin-36通過何種信號傳導(dǎo)途徑減輕魚藤酮造成的線粒體功能紊亂還不清楚，值得進一步研究，為apelin成為治療PD的潛在臨床藥物提供新的證據(jù)。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。