王 禎，劉 晨，王文婷，張 霞，朱先約，朱 萍，宋 凱

（甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，蘭州 730050）

0 引言

煙葉表面微生物數(shù)量龐大、種類繁多，在煙葉發(fā)酵過程中起到重要作用[1]。微生物存在于煙葉醇化的始終，對煙葉內(nèi)在品質(zhì)和外在色澤都起著十分重要的作用[2]。將有益微生物作用于煙葉表面，能夠縮短醇化周期、增加煙葉香氣、提升煙葉品質(zhì)和提高煙葉安全性[3-5]。醇化煙葉表面微生物與煙葉的種質(zhì)資源優(yōu)良度、品種、產(chǎn)地、等級和醇化時間有關(guān)，品質(zhì)優(yōu)良、香氣質(zhì)量好的煙葉上含有的微生物種類和數(shù)量更加豐富。

目前，分離和鑒定煙葉表面微生物，篩選改善煙草品質(zhì)和生物降解煙草有害物質(zhì)的微生物資源是煙草行業(yè)的研究熱點[6-8]。如Zhao等[9]利用泛菌株微生物降解類胡蘿卜素生成香味物質(zhì)。Ma等[10]利用放線菌產(chǎn)生香味物質(zhì)香蘭增加煙草香氣。陳興等[11]在煙葉上接種嗜熱芽孢桿菌提升煙葉質(zhì)量和香氣。English等[12]從發(fā)酵煙葉上分離出嗜熱細(xì)菌，將這些菌株用于煙葉發(fā)酵，促進(jìn)煙葉的香氣轉(zhuǎn)化。張保國等[13]得到的克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)能產(chǎn)某種特定的酶類，具有一定脫氮作用。Ruan和Zhong等[14-15]利用分離到的假單胞菌(Pseudomonas sp.)有效降低部分煙葉中的煙堿含量，處理煙葉得到的卷煙品質(zhì)的香氣質(zhì)細(xì)膩柔和，勁頭減小，刺激性和嗆咳感減輕。已有報道芽孢桿菌、微球菌和嗜熱菌等細(xì)菌能降低煙葉中蛋白質(zhì)含量，改善煙葉品質(zhì)[16-18]。目前對單一產(chǎn)酶和降解特性的微生物研究較多，而同時產(chǎn)多種酶的煙草增香微生物及其對煙葉品質(zhì)改善作用的研究鮮有報道。

本研究以醇化庫6個不同產(chǎn)地復(fù)烤后煙葉為原料進(jìn)行微生物分離，經(jīng)過產(chǎn)酶篩選和16S rDNA測序，將篩選出的菌株添入低等級煙葉進(jìn)行人工醇化，研究增香菌株對煙葉品質(zhì)的影響，旨在挖掘生物性煙草增香新技術(shù)，為優(yōu)化煙葉醇化工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 選取云南富源、福建三明、四川寧南、貴州桐梓、巴西和湖南永州6個產(chǎn)地的自然醇化片煙，由甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司片煙醇化庫提供，采集時間為2019年。

1.1.2 供試煙葉 牡丹江X2F等級和慶陽B1K等級的醇化煙葉。

1.2 方法

1.2.1 樣品表面細(xì)菌分離 采用常規(guī)平板稀釋法[19]分離煙葉表面細(xì)菌。稱取5 g煙葉樣品，置于500 mL的三角瓶中，加入50 mL的生理鹽水，210 r/min振蕩45 min后收集濾液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[20]上37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落保藏備用。

1.2.2 產(chǎn)酶特性篩選試驗 將分離的菌株分別點接于淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶篩選培養(yǎng)基[21-23]上，37℃培養(yǎng)24 h，菌種產(chǎn)酶能力大小根據(jù)“透明水解圈直徑/菌落直徑”來計算。

1.2.3 分離菌株的16S測序 16S引物序列(27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：TACGGYTA CCTTGTTACGACTT)。PCR擴(kuò)增體系：17.8 μL H2O；3 μL Buffer；2 μL dNTP；正反向引物各3 μL，0.2 μL酶，1 μLDNA模板。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸 10 min。利用Illumina MiniSeq高通量測序平臺對擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行16S rDNA測序。

1.2.4 菌株增香發(fā)酵試驗 取保藏菌種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上37℃恒溫活化48 h，接種到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、210r/min振蕩培養(yǎng)18h，4℃、4000r/min離心15 min，收集的菌體用生理鹽水反復(fù)洗滌后用無菌水重懸，菌體濃度穩(wěn)定在3×108CFU/mL。將菌液均勻噴灑于100 g紫外滅菌的煙葉表面，對照為無菌水處理，將煙葉放置在燒杯中用滅菌紗布包裹，置于37℃、相對濕度60%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵10天。

1.2.5 煙葉感官品質(zhì)評價 將煙葉樣品卷制成單料煙樣品[24]，由甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心有國家認(rèn)證資質(zhì)人員，依據(jù)YC/T 138—1998[25]對煙葉樣品的香氣質(zhì)、香氣量、余味、雜氣、刺激性、燃燒性和灰色等7個方面進(jìn)行感官評吸鑒定。

1.2.6 常規(guī)化學(xué)成分和多酚測定 依據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159—2002、YC/T 468—2013 和 YC/T 161—2002[26-28]測定煙葉樣品中總糖、還原糖、總植物堿和總氮含量。依據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 162—2011和YC/T 217—2007[29-30]測定煙葉樣品中氯和鉀含量。依據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 202—2006[31]測定煙葉樣品中多酚類化合物綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Statistics 19軟件和Microsoft Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，運用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異的顯著性檢驗，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉表面微生物的分離和產(chǎn)酶分析

從6個煙葉樣品中分離出112株細(xì)菌菌株。在分離培養(yǎng)的細(xì)菌中，經(jīng)過產(chǎn)酶平板篩選（圖1），得到產(chǎn)酶菌株84株。以水解圈大小作為產(chǎn)酶能力的評價指標(biāo)，剔除生理生化鑒定重復(fù)的菌株，篩選出7株具有產(chǎn)酶優(yōu)勢的細(xì)菌并對其命名。7株細(xì)菌均產(chǎn)纖維素酶，其中 GY96、GY99細(xì)菌同時產(chǎn) 3種酶，GY51、GY53、GY67和GY85同時產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶，GY72同時產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶，如表1所示。

表1 7株分離細(xì)菌的產(chǎn)酶情況

圖1 產(chǎn)酶菌株在3種篩選培養(yǎng)基上的水解圈效果

2.2 篩選菌株鑒定

將7株細(xì)菌提取全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物利用Illumina MiniSeq高通量測序平臺進(jìn)行16S rDNA測序。GY51為腸桿菌屬(Enterobacter sp.)細(xì)菌，GY53為泛菌屬(Pantoea sp.)細(xì)菌，GY67為微球菌屬(Micrococcus)細(xì)菌，GY72為假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌，GY85為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)細(xì)菌，GY96和GY99為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)細(xì)菌。

2.3 微生物醇化對煙葉感官品質(zhì)的影響

將篩選菌株分別噴灑于牡丹江X2F和慶陽B1K的低等級煙葉醇化20天后，煙葉的香氣量和協(xié)調(diào)性提高，舒適度提升，口感得到改善，雜氣下降。這可能是增香菌株生長繁殖時產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物通過生物酶的催化改變了煙葉的某些化學(xué)成分導(dǎo)致的，進(jìn)而改善煙葉質(zhì)量[32]。

如表2所示，不同菌株對煙葉感官質(zhì)量影響存在一定差異性。在2種煙葉中，與對照相比，菌株GY99處理后的牡丹江和慶陽煙葉總分分別增加了2.26分和2.03分，其中牡丹江煙葉香氣質(zhì)、香氣量、余味和雜氣分別增加了0.44、0.44、0.32、0.28分，慶陽煙葉分別增加了0.33、0.33、0.32、0.24分；菌株GY96處理后的牡丹江和慶陽煙葉總分分別增加了1.92分和1.77分，其中牡丹江煙葉香氣質(zhì)、香氣量、余味和雜氣分別增加了0.36、0.54、0.23、0.26分，慶陽煙葉分別增加了 0.29、0.53、0.30、0.26分；GY99和GY96增加香氣質(zhì)和香氣量，余味舒適，雜氣較輕，刺激性改善。菌株GY67和GY72處理能夠改善香氣質(zhì)、余味、雜氣、刺激性和燃燒性，且GY72處理后余味改善明顯，處理后的牡丹江和慶陽煙葉分別增加0.34、0.35分，但香氣量與對照相比略有下降，2種煙葉均下降0.03分；GY51、GY53和GY85處理后香氣質(zhì)提升，處理后的牡丹江煙葉香氣質(zhì)分別增加了0.12、0.14、0.11分，慶陽煙葉分別增加0.24、0.17、0.16分，但香氣量下降，且GY51處理后余味不舒適感和刺激性增加，GY53和GY85處理后雜氣增加，余味改善不明顯。綜上所述，菌株GY99處理后的煙葉感官評吸各項得分均高于其他菌株處理樣品，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，刺激性和雜氣降低，舒適度提升，感官質(zhì)量提升最為明顯；其次是GY96、GY72、GY67處理樣。

表2 煙葉感官評吸指標(biāo)得分統(tǒng)計分析

2.4 微生物醇化后煙葉化學(xué)成分和多酚含量的變化

如表3所示，牡丹江煙葉中，與對照相比，煙絲化學(xué)成分中總糖、還原糖、總植物堿和總氮含量有明顯變化，氯和鉀含量變化不大。GY67處理的煙葉總糖和還原糖含量明顯增加，分別增加了2.86%和2.21%；GY96和GY99處理的還原糖分別增加了0.74%和1.01%，總糖分別減少了0.81%和0.06%；GY99處理的植物堿和總氮略微增加，分別為0.06%和0.14%；GY53處理氯增加0.09%，GY67處理氯降低0.01；GY51處理的鉀含量增加0.05%，GY99處理的則降低0.03%。慶陽煙葉樣品中，化學(xué)中總糖、還原糖和總植物堿含量有明顯變化，總氮、氯和鉀含量變化不大。GY96、GY67、GY99處理的總糖分別增加2.24%、0.92%和0.37%，還原糖分別增加3.67%、0.58%和2.91%，GY51、GY72、GY85處理的總糖分別下降0.67%、1.34%和0.52%，還原糖分別下降0.33%、0.40%和0.48%，GY72處理的植物堿含量增加0.15，%GY53處的理植物堿降低0.08%。

表3 牡丹江和慶陽煙葉經(jīng)不同菌株處理后化學(xué)成分指標(biāo)的統(tǒng)計分析 %

如表4所示，在2種煙葉中3種多酚類化合物的含量有明顯變化。牡丹江煙葉中，GY72處理后的綠原酸、莨菪亭、蕓香苷分別增加1.47、0.20和1.35 mg/g，GY99處理后三者分別增加3.56、0.05和0.58 mg/g，GY67的三者分別增加1.01、0.08和1.33 mg/g，GY96處理后綠原酸增加0.64。慶陽煙葉中，GY99處理后的綠原酸和莨菪亭含量明顯增加，分別為3.25和0.11 mg/g；GY72處理后的莨菪亭顯著增加1.85 mg/g，GY67和GY96處理后綠原酸分別增加2.61和1.77 mg/g。

表4 牡丹江和慶陽煙葉經(jīng)不同菌株處理后多酚化合物的統(tǒng)計分析 mg/g

3 結(jié)論

（1）6個不同產(chǎn)地?zé)熑~中分離出112株細(xì)菌菌株，其中84個菌株具有產(chǎn)酶能力，大部分能夠產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶，少數(shù)菌株能夠產(chǎn)蛋白酶。

（2）7株細(xì)菌均能產(chǎn)纖維素酶，其中GY96、GY99細(xì)菌同時產(chǎn)3種酶，GY51、GY53、GY67和GY85同時產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶，GY72同時產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶。處理煙葉后能降解淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生香味物質(zhì)，使得舒適度提升，香氣質(zhì)和香氣量增加，刺激性和雜氣降低，有效增加煙葉香氣。

（3）該試驗篩選出一株可同時產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株GY99。同時還篩選到3株可明顯改善煙草品質(zhì)的菌株，分別是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株GY96、假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株GY72和微球菌屬(Micrococcus)菌株GY67。菌株GY99處理樣的感官評吸質(zhì)量提升最為明顯，煙支吸味品質(zhì)有所增加，能有效增加煙葉香氣和甜感，其處理后的牡丹江和慶陽煙葉總分分別增加了2.26和2.03分，舒適度提升，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，2種煙葉的香氣質(zhì)和香氣量分別增加0.44和0.33分，刺激性和雜氣降低，其次是GY96、GY72、GY67處理樣。

（4）16SrDNA測序得知，GY99和GY96為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)細(xì)菌，GY72為假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌，GY67為微球菌屬(Micrococcus)細(xì)菌。

4 討論

在2種煙葉中，GY67、GY96和GY99處理的還原糖顯著增加，這可能是微生物降解淀粉產(chǎn)生水溶性糖，進(jìn)入糖代謝途徑[33]，同時3種菌在生長繁殖過程中分泌胞外多糖類物質(zhì)[34]，導(dǎo)致煙葉中還原糖含量增加。王穎等[35]研究表明，煙葉中水溶性糖的含量與評吸質(zhì)量呈正相關(guān)，大部分水溶性糖的反應(yīng)產(chǎn)物和衍生物具有優(yōu)美的香氣，這些香氣成分能夠協(xié)調(diào)煙草本身香氣，增加香氣濃度，從而有效改善煙葉質(zhì)量。有研究表明，煙葉中的氮含量與植物堿是衡量煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，含氮化合物與煙葉的香氣品質(zhì)密切相關(guān)[36]，植物堿則與煙氣感官品質(zhì)密切相關(guān)[37]。這與本研究結(jié)果一致，GY99調(diào)節(jié)煙葉總氮和植物堿含量，同時顯著提升感官評吸質(zhì)量。

多酚類化合物是煙葉中重要的香氣前體物，是衡量煙草品質(zhì)的重要因素，與煙草制品的等級呈正相關(guān)[38]。綠原酸和蕓香苷作為烤煙特征香氣成分，可賦予煙氣清香和烤香[39]。GY99、GY96、GY67和GY72能夠顯著提高供試煙葉多酚化合物含量，對提升煙葉品質(zhì)有正向作用。

淀粉和纖維素作為煙葉中存在的結(jié)構(gòu)復(fù)雜分子量大的糖類化合物，含量過高會使煙葉燃燒時產(chǎn)生粗糙嗆咳的煙氣，影響吸味品質(zhì)。本研究所篩選出的GY99、GY96和GY67能同時產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶，能夠降解淀粉和纖維素等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生香味物質(zhì)，使得舒適度提升，香氣質(zhì)和香氣量增加，刺激性和雜氣降低，有效增加煙葉香氣。

醇化煙葉表面微生物資源具有較大的應(yīng)用潛力。圍繞煙草行業(yè)庫存煙葉壓力較大的現(xiàn)狀，提高煙葉工業(yè)可用性一直是行業(yè)研究的重點和難點，如何利用煙葉微生物資源提高煙葉品質(zhì)和使用價值，是行業(yè)面臨的現(xiàn)實問題和持續(xù)健康發(fā)展的需要。本研究立足于篩選改善煙草品質(zhì)的煙葉微生物，后期應(yīng)進(jìn)一步探索篩選菌株對提高煙葉工業(yè)可用性的途徑，提高庫存煙葉在卷煙產(chǎn)品中的使用比例，提高煙葉價值，貢獻(xiàn)地方經(jīng)濟(jì)。