吳楠，楊君，張艷，孫正文，張冬梅，李麗花，吳金華，馬峙英，王省芬

（河北農業(yè)大學農學院，華北作物改良與調控國家重點實驗室，華北作物種質資源研究與利用教育部重點實驗室，河北保定 071001）

纖維品質改良是當前棉花育種迫切需要解決的問題[1]。海島棉纖維品質優(yōu)良，表現(xiàn)為纖維長、強度大、細度高[2]。因此，海島棉纖維發(fā)育相關基因尤其是與陸地棉纖維差異表達基因的篩選和功能研究對解析纖維細胞分化發(fā)育的分子機理、改良纖維品質具有重要意義。

棉纖維品質主要包括長度、強度、細度等，是由棉纖維（分化突起的棉花胚珠外表皮細胞）的發(fā)育所決定的。棉纖維發(fā)育是一個有序的過程，主要經(jīng)歷纖維原始細胞的分化突起（-2～5 DPA，days post anthesis，開花后天數(shù)）、纖維細胞伸長（初生壁合成，0～25 DPA）、次生壁合成（16～45 DPA）、脫水成熟（40～50 DPA）4個獨特又互有重疊的階段[3-4]。纖維長度主要由纖維細胞伸長期決定，這一時期細胞的主要活動是非纖維素多糖如果膠多糖和木葡聚糖、結構蛋白以及少量纖維素等物質的合成并組裝形成初生細胞壁；纖維強度主要在次生壁合成期被決定，該時期細胞的主要活動是纖維素（95%）和少量非纖維素多糖的合成及裝配形成次生細胞壁[5-6]。

UDP-D-GlcA是植物細胞壁非纖維素多糖的重要前體分子，大約50%的細胞壁物質來源于前體UDP-D-GlcA[7]。植物中合成UDP-D-GlcA的途徑有兩條[8]：一條是尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenase，UGD）途徑；另一條是由Loewus等[9]于1962年發(fā)現(xiàn)的肌醇加氧酶（myo-inositol oxygenase，MIOX）途徑，在此途徑中，由D-葡萄糖-6-磷酸（D-glucose-6-phosphate，D-Glc-6-P）經(jīng)3步轉變而來的D-葡萄糖醛酸（D-glucuronicacid，D-GlcA）在葡萄糖醛酸激酶（glucuronokinase，GlcAK）的作用下磷酸化為D-葡萄糖醛酸-1-磷酸（D-GlcA-1-P），之后進一步轉變?yōu)閁DP-D-GlcA。1959年，在綠豆幼苗的可溶性組分中首次發(fā)現(xiàn)了GlcAK活性[10]；1977年，Leibowitz等[11]報道百合（Lilium longiflorum）花粉GlcAK在MIOX途徑中可能具有調控作用；Pieslinger等[12-13]從百合花粉中提純了GlcAK，并從擬南芥中克隆出了GlcAK基因，其為GHMP（galactokinase，homoserine kinase，mevalonate kinase，phosphomevalonate kinase）[14]超家族成員，在各組織中均能表達，但有花粉偏好性，暗示該基因很可能和細胞壁合成相關；擬南芥GlcAK能夠調控GlcA的合成并影響糖代謝，其突變體僅積累了GlcA，輸入到細胞壁聚合物中的代謝物減少[15-16]。

本課題組前期利用RNA-seq技術構建了4個海陸栽培棉花品種（系）纖維發(fā)育的表達譜[17]，發(fā)現(xiàn)GlcA K的表達高峰在纖維伸長期，可能參與纖維細胞伸長，且該基因在海島棉中的表達水平高于陸地棉，作為細胞壁前體UDP-GlcA合成途徑中的重要酶，其參與細胞壁發(fā)育調控的研究在棉花中尚未見報道。棉花遺傳轉化周期長，而擬南芥表皮毛發(fā)育與棉纖維發(fā)育具有相似的分子調控機制[18]，利用模式植物擬南芥可以快速有效地初步鑒定纖維伸長發(fā)育相關基因的功能。為此，本研究克隆了海島棉GlcAK基因，通過生物信息學分析、亞細胞定位以及過表達擬南芥表皮毛長度、UDP-GlcA代謝通路相關基因表達和果膠含量分析，初步揭示GbGlcAK調控細胞伸長的機制，為進一步研究其在棉纖維發(fā)育中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試劑

Columbia生態(tài)型擬南芥、海島棉Pima90-53、陸地棉中棉所8號（CCRI8）、植物表達載體pCamE和pCam::GFP[19]、農桿菌GV3101均由河北農業(yè)大學棉花遺傳育種研究室提供。

植物總RNA提取試劑盒、普通質粒小提試劑盒（離心柱型）、pGEM-T克隆載體、大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞均購自天根生化科技（北京）有限公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；EASYspin植物RNA快速提取試劑盒購自重慶波爾生物科技有限公司；THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、DNA Marker、PrimerScriptTM單鏈反轉錄試劑盒以及其他PCR所用試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。測序由北京六合華大基因科技有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 試驗中用到的PCR和qPCR引物Table 1 PCR and qPCR primers used in this study

1.2 GbGlcAK的克隆和生物信息學分析

將Pima90-53和CCRI8種植于河北農業(yè)大學教學試驗中心。收集15 DPA纖維，使用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，參照PrimerScriptTM單鏈反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。分別以Pima90-53和CCRI8的15 DPA纖維cDNA為模板進行高保真PCR擴增，電泳并回收擴增產(chǎn)物，利用T4 DNA連接酶將回收片段連接至pGEM-T載體，熱激轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10，挑取藍白斑篩選、菌液PCR呈陽性的克隆送測序，測序結果正確的即為攜帶有海島棉GlcAK（GbGlcAK）/陸地棉GlcAK（GhGlcAK）ORF序列的載體。引物設計參考Pima90-53和TM-1測序基因組所注釋的GlcAK[2,20]。

本文提出的ICSA-ECOC編碼方法將最優(yōu)編碼矩陣的構造問題轉化為基于免疫克隆選擇算法的搜索問題，基于樣本知識的親合度函數(shù)和變異交叉操作可加速算法收斂，快速搜索數(shù)據(jù)感知的緊湊型編碼.實驗結果說明ICSA-ECOC方法能提高分類精度，并在保證糾錯能力的同時最大限度減小編碼長度.

通過Pfam網(wǎng)站（http://pfam.xfam.org）[21]分析GbGlcAK蛋白的結構域。利用ExPASy ProtScale在線工具（https://web.expasy.org/protscale）[22]繪制蛋白質肽鏈親/疏水性分布曲線。利用TOPpred2（http://sbcb.bioch.ox.ac.uk/TM_noj/TM_noj.html）[23]和TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）[24-25]預測蛋白跨膜區(qū)。利用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）[26]預測并分析蛋白信號肽。通過Psort（http://psort1.hgc.jp/form.html）在線預測蛋白亞細胞定位。使用BlastP（v 2.11.0）比對GbGlcAK、GhGlcAK及其他植物GlcAK的氨基酸序列，使用MEGA7.0[27]構建GlcAK的系統(tǒng)進化樹。

1.3 GbGlcAK蛋白的亞細胞定位分析

設計引物GbGlcAK-F和sGbGlcAK-R（表1），將GbGlcAKORF序列（去除終止密碼子）與pCam::GFP載體連接，構建GbGlcAK的GFP融合表達載體pCam::GbGlcAK-GFP。洋蔥上表皮細胞的制備、基因槍轉化和熒光觀察等操作參照Yang等[28]方法進行。質壁分離試驗使用質量濃度為0.3 g·mL-1的蔗糖溶液。

1.4 超表達GbGlcAK擬南芥的獲得

將擬南芥種植于裝滿蛭石的六棱缽中，在溫度22～23℃、相對濕度60%～70%、光照周期16 h（光照）/8 h（黑暗）的植物生長室中培養(yǎng)，約每5 d澆1次Hogland營養(yǎng)液。

利用引物GbGlcAK-F/R（表1）將GbGlcAKORF序列連接于表達載體pCamE的多克隆位點Xb aⅠ和KpnⅠ之間。通過凍融法將構建好的載體轉入農桿菌GV3101[29]。采用農桿菌介導的蘸花法轉化擬南芥[30]，經(jīng)潮霉素篩選（50μg·mL-1，MS培養(yǎng)基）和PCR檢測獲得超表達GbGlcAK的擬南芥T4代純合株系用于后續(xù)試驗。

1.5 擬南芥表皮毛、下胚軸和根的長度測定

取生長4周的擬南芥第6片真葉，在無水乙醇中脫色2 h后，用95%乙醇繼續(xù)脫至無色，置于Leica DM2500顯微鏡下觀察并采集圖像。野生型和每個轉基因株系各取8片葉，在250×顯微鏡下觀察葉片中心區(qū)域表皮毛，應用ImageJ軟件對4個視野中60根表皮毛的最長分支進行長度測量。

用NaClO對擬南芥種子進行消毒后，每3 mm點種1粒種子至1/2 MS固體培養(yǎng)基，22℃持續(xù)暗培養(yǎng)5 d，利用Epson V800掃描儀采集圖像，應用ImageJ軟件測定野生型和轉基因株系的下胚軸長度，各取15株。隨機選取野生型和轉基因植株碘化丙啶染色后利用Olympus FV10i激光掃描顯微鏡觀察下胚軸細胞并拍照；22℃、16 h（光照）/8 h（黑暗）培養(yǎng)6 d，選取正常生長的單株（約30株）測量根長。

1.6 擬南芥UDP-D-GlcA代謝通路相關基因表達分析

使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取6周齡擬南芥總RNA，利用PrimerScriptTM單鏈反轉錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)GbGlcAK和AtGl c A K（AT3G01640）的ORF分別設計引物qGbGlcAK-F/R、qAtGlcAK-F/R，以AtUbi quitin5（AT3G62250）為內參[31]（表1），利用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行Real-time PCR。反應體系：THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix 10μL，上、下游引物（10μmol·L-1）各1.0μL，cDNA模板1.0μL，ddH2O 7.0μL。反應程序：95℃3 min；95℃10 s，60℃10 s，72℃15 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法[32]對基因相對表達量進行分析。

1.7 擬南芥果膠含量測定

稱取約2.00 g的6周齡擬南芥，加入5 mL堿性蘇打液（2%Na2CO3和0.16%NaOH）研磨，轉移至離心管中，沸水浴處理20 min，8 000 r·min-1離心3 min；取上清加入1 mL冰醋酸攪拌混勻，再加入2 mL 25%CaCl2溶液攪拌并沸水浴約10 min以排出CO2，然后8 000 r·min-1離心2 min，棄上清；用0.1%醋酸沉淀4次，每次10 mL；加入10 mL 1%Na2CO3溶液渦旋混勻，沸水浴5 min并不時攪拌，然后8 000 r·min-1離心2 min，棄上清，沉淀用5 mL熱蒸餾水沖洗1次；加入10 mL 1%醋酸溶液渦旋混勻，沸水浴5 min并不時攪拌，8 000 r·min-1離心2 min，上清轉入錐形瓶中，用10 mL蒸餾水沖洗沉淀，上清并入錐形瓶中的上清；加入5 mL 0.1 mol·L-1特里龍B溶液、5 mL銨緩沖液、50 mg鉻黑T，用0.02 mol·L-1MgSO4溶液滴定至指示劑顏色轉為酒紅色，同樣條件下滴定5 mL 0.1 mol·L-1特里龍B溶液作為對照，計算果膠酸含量。

式中，K為硫酸鎂溶液的滴定度；a為滴定5 mL 0.1 mol·L-1特里龍B溶液所用的0.02 mol·L-1MgSO4體積（mL）；X為分析材料中果膠酸含量（質量分數(shù)，%）；b為滴定鈣（擬南芥樣品溶液）時所用去的0.02 mol·L-1MgSO4體積（mL）；n為分析材料的質量（g）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 GbGlcAK的克隆和生物信息學分析

以Pima90-53基因組為模板，擴增得到大小約為1 100 bp的基因片段，測序結果與參考基因組序列（GbM_A09 G0397.1）一致，命名為GbGlcAK。以CCRI8基因組為模板擴增，得到與參考基因組序列（GhM_A09G0407.1）一致的基因片段，命名為GhGlcAK。擴增結果結合參考基因組注釋表明，在棉花基因組中GlcAK只擁有1個基因座。生物信息學分析顯示，GbGlcAKORF長度為1 101 bp，編碼366個氨基酸，具有GHMP激酶N（PF00288）和C（PF08544）結構域，屬于GHMP超家族成員。肽鏈的親/疏水性分布曲線（圖1A）顯示，GbGlcAK存在較大范圍的親水區(qū)，有一定的親水性，屬于可溶性蛋白。GbGlcAK不存在跨膜區(qū)（圖1B和C），不具有信號肽結構（圖1D），表明GbGlcAK是一種非分泌蛋白。

圖1 GbGlcAK蛋白特征Fig.1 Characterization of GbGlcAK protein

將GbGlcAK和GhGlcAK以及其他物種的同源基因的蛋白序列進行對比，結果（圖2）表明，GbGlcAK與GhGlcAK氨基酸序列相似度為99.2%，在保守區(qū)有3個氨基酸的差異，與擬南芥GlcAK氨基酸序列相似度為88.3%，而與蓖麻（Ricinus communis）、葡萄（Vitis vinifera）、毛果楊（Populus trichocarpa）、大豆（Glycine max）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）GlcAK氨基酸序列相似度分別為90.0%、89.2%、88.7%、86.7%、86.1%、85.3%和84.1%。由系統(tǒng)進化分析可以看出，GlcAK在不同植物間相對保守，與擬南芥GlcAK的親緣關系最近，并與葡萄、蓖麻和毛果楊GlcAK有較近的親緣關系。

圖2 GbGlcAK系統(tǒng)進化分析Fig.2 Evolutionary analysis of GbGlcAK

2.2 GbGlcAK定位在細胞質

生物信息學預測GbGlcAK可能位于細胞質。為進一步確認，構建了GbGlcAK的GFP融合表達載體，采用基因槍轟擊法轉化洋蔥內表皮細胞，分析GbGlcAK的亞細胞定位。從圖3可以看出，不含外源基因的空載體對照pCam::GF P在整個洋蔥細胞均能看到綠色熒光，為組成型表達，而融合表達載體pCam::GbGlcAK-GFP的綠色熒光只出現(xiàn)在細胞質中，表明其發(fā)揮功能的場所為細胞質，與預測結果一致。

圖3 GbGlcAK的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of GbGlcAK

2.3 超表達GbGlcAK增加了擬南芥表皮毛、下胚軸和根的長度

構建了pCamE-GbGlcAK雙元表達載體，利用蘸花法將重組質粒轉化野生型擬南芥，隨后收獲種子（T1）種植于含潮霉素的MS篩選培養(yǎng)基上。10 d后，將正常生根的綠色幼苗移栽到蛭石中繼續(xù)培養(yǎng)，提取葉片基因組DNA，經(jīng)PCR檢測，獲得超表達GbGlcAK的T1陽性植株。繼續(xù)通過抗性篩選及PCR鑒定獲得T4代純合轉基因株系。

取4周齡野生型（WT）和轉基因（OE1和OE2）擬南芥第6片蓮座葉觀察并測量其表皮毛長度，與野生型相比，轉基因擬南芥表皮毛長度極顯著變長，較野生型分別增加了59.2和62.5μm（圖4）。

暗培養(yǎng)5 d的OE1和OE2株系植株下胚軸平均長度分別為15.6和15.5 mm，比野生型（12.3 mm）分別增加了3.3和3.2 mm（圖5A和B）。顯微觀察顯示，轉基因植株下胚軸細胞比野生型更長（圖5C）。

圖5 轉基因擬南芥下胚軸長度分析Fig.5 Analysis of hypocotyl length in transgenic A.th aliana

生長6 d的OE1和OE2株系植株根平均長度分別為29.8和28.9 mm，均比野生型（26.7 mm）增加，差異達極顯著水平（圖6）。

圖4轉基因擬南芥葉表皮毛長度分析Fig.4 Analysis of leaf trichome length in transgenic A.th aliana

圖6 轉基因擬南芥根長分析Fig.6 Analysis of root length in transgenic A.thali ana

綜合表皮毛、下胚軸和根的研究結果，說明該基因具有促使細胞伸長的作用。

2.4 超表達GbGlcAK上調了UDP-D-GlcA代謝通路相關基因的表達

為明確超表達GbGlcAK擬南芥表皮毛、下胚軸及根長度增加的分子機制，測定了UDP-D-GlcA代謝通路中基因表達水平，結果如圖7所示，首先，外源GbGlcAK在轉基因株系中均高效轉錄，轉基因擬南芥內源GlcAK比野生型表現(xiàn)出更高的表達水平（分別為19.1和8.4倍）；其次，與野生型相比，轉基因擬南芥MIOX途徑中的磷酸肌醇合酶基因MIPS、肌醇磷酸酶基因IMP以及肌醇加氧酶基因MIO X表達水平上調（1.2～7.5倍）；再次，UGD途徑中的磷酸葡萄糖變位酶基因P GM、尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶基因UG P以及尿苷二磷酸-葡萄糖脫氫酶基因UGD在轉基因擬南芥中的表達水平極顯著高于野生型（10.6～19.7倍）；最后，UDP-D-GlcA的下游代謝相關基因尿苷二磷酸-木糖合成酶基因UX S和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸異構酶基因GA E在轉基因擬南芥中的表達水平也有所增加（1.6～7.2倍）。上述結果說明，超表達GbGlcAK促進了UDP-D-GlcA合成和轉變代謝通路中相關基因的表達。

圖7 轉基因擬南芥中UDP-D-GlcA代謝相關基因的表達分析Fig.7 Expression analyses of UDP-D-GlcA metabolism related genes in transgenic A rabidopsis

2.5 超表達GbGlcAK使細胞果膠含量增加

為明確超表達GbGlcAK擬南芥表皮毛、下胚軸及根長度增加的生理生化機制，比較了轉基因擬南芥和野生型的果膠含量差異（圖8），發(fā)現(xiàn)兩個轉基因擬南芥株系的果膠含量均顯著提高，其中，OE1果膠含量為23.13%，OE2株系果膠含量為23.40%，分別比野生型WT（19.15%）增加了21%和22%。該結果明確說明超表達GbGlcAK提高了細胞果膠含量。

圖8 轉基因擬南芥果膠含量Fig.8 Pectin content in transgenic A rabid opsi s

3 討論

陸地棉在全世界棉花的種植面積大于90%，但其纖維長度、強度、細度等不及海島棉。研究海島棉中纖維發(fā)育相關基因，能夠為陸地棉纖維品質改良提供理論參考[33]。同為特化的表皮細胞，擬南芥葉表皮毛發(fā)育和棉纖維發(fā)育的調節(jié)機制部分相同[34-37]，此外，擬南芥下胚軸的生長是由于細胞伸長而不是分裂[38-39]，因此可以利用擬南芥來高效初步解析棉纖維發(fā)育相關基因的功能，從而為棉纖維品質改良尤其是長度的改良提供理論參考。基于課題組前期轉錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)1個編碼葡萄糖醛酸激酶的基因GlcAK，其在除起始期之外的其他纖維發(fā)育時期高表達，特別是其在海島棉中的表達高于陸地棉，表明該基因與纖維品質的形成密切相關。本研究中，超表達GbGlc AK的擬南芥的葉表皮毛長度增加、下胚軸和下胚軸細胞長度變長、根長變長，表明GbGlcAK確實具有促進細胞伸長的功能。

UDP-D-GlcA作為細胞壁非纖維素多糖的重要前體，其合成和轉變代謝通路MIOX途徑、UGD途徑及下游途徑中相關基因的表達和細胞壁非纖維素多糖的沉積密切相關[40]，直接影響植物細胞壁的形態(tài)建成，影響棉纖維的品質。本研究在擬南芥中過表達GbGlcAK后，擬南芥內源GlcAK表達水平極顯著上調，可能是由于外源GbGlcAK的高表達引起了上游MIOX基因表達量的增加，從而使得內源GlcAK隨之高表達。UGD途徑中相關基因的表達水平也大幅上調，可能是因為GlcAK的高表達誘使兩途徑共同上游基因轉錄水平提高。MIOX和UGD途徑基因表達量的共同上調使得其下游GAE和U XS表達量亦顯著增加。綜上，GbGlcAK通過上調UDP-D-GlcA合成和轉變代謝通路中基因的表達來促進細胞伸長。

快速伸長的纖維細胞壁含有較多的果膠成分，向組織培養(yǎng)液中加入果膠前體核苷糖，如醛酸糖UDP-GlcA、UGP-GalA或中性糖UGP-Rha，能顯著促進纖維的伸長，說明果膠合成在纖維伸長即初生壁形成過程中具有重要作用[41]。研究表明，肌醇能被擬南芥幼苗攝入并通過MIOX途徑生成UDP-GlcA，從而為細胞壁建成主要是果膠多糖的合成提供足夠的必要前體，萌發(fā)中的百合花粉將雌蕊分泌物中的肌醇大部分整合進新生花粉管細胞壁的果膠聚合物中[42]，GlcAK參與細胞壁主要物質—果膠的合成[43]。本研究中，超表達GbGlcAK擬南芥植株果膠含量比野生型顯著提高。結合表型結果和基因表達分析結果可知，GbGlcAK的過量表達使UDP-GlcA代謝通路中基因表達水平上升，進而增加細胞壁果膠含量，最終促進了細胞伸長。

本研究對GlcAK表達模式進行了分析，挖掘了GbGlcAK促進細胞伸長的分子和生理生化機制，證明GbGlcAK能夠影響植物細胞壁構成，其是否能夠切實促進棉纖維細胞伸長尚需更多證據(jù)，又是否在棉纖維細胞壁強度的增加中發(fā)揮重要作用也值得深入研究。對該基因功能的進一步解析，將豐富對GbGlcAK調控棉纖維發(fā)育、細胞壁發(fā)育以及棉花纖維品質形成的認識。