張如珍，陳 勝，王鋒超，胡先成

(1．重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,重慶 401331；2．陸軍軍醫(yī)大學(xué) 軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系，重慶 400038)

0 引言

細胞骨架是一種相互連接的精細結(jié)構(gòu)，主要由肌動蛋白、微管和中間絲組成。其作為膜突出的支架，如微絨毛、纖毛和鞭毛[1]等調(diào)節(jié)細胞的形態(tài)和生理活性。許多上皮細胞，如小腸上皮細胞、腎上皮細胞和支氣管上皮細胞具有大量微絨毛[2]。微絨毛數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常變化與生理功能有關(guān)，如分泌和吸收[3]。此外，肌動蛋白在很多關(guān)鍵的細胞進程中起著重要作用，包括遷移、內(nèi)吞、細胞內(nèi)運輸、蛋白質(zhì)和mRNA拼接、附著、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜皺褶和胞質(zhì)分裂等[4]，并且它在很大程度上決定了細胞的形狀以及細胞質(zhì)中細胞器的位置和形狀[5]。在哺乳動物中，至少有6種肌動蛋白亞型由單獨的基因編碼，并根據(jù)其等電點分為α、β和γ 3類[6]。到目前為止，有關(guān)肌動蛋白的研究多集中在其結(jié)構(gòu)和功能上[7]，而缺乏利用肌動蛋白在不同細胞中的差異進行形態(tài)學(xué)和定量學(xué)的分析。鑒于腸道上皮細胞獨特的細胞組分及結(jié)構(gòu)，本研究旨在通過對腸道隱窩-絨毛細胞β-Actin的免疫熒光染色、蛋白免疫印跡法、流式細胞檢測和細胞周期分析，以判斷β-Actin在不同腸道細胞中的表達量和表達模式，為利用β-Actin協(xié)助區(qū)分腸道增殖和分化細胞及細胞周期的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 小鼠和試劑

1.1.1 實驗小鼠

C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周齡12 只，體重25～30 g，購自成都集萃藥康生物科技公司。動物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，小鼠飼料喂養(yǎng)，自由食水，自然光暗周期，室溫22～25℃。本實驗操作均經(jīng)過陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理學(xué)審核通過。

1.1.2 主要試劑和材料

Actin-Tracker Green-488(碧云天貨號C2201S)、PE anti-mouse CD24(BioLegend 貨號101808)、PE/Cy7 anti-mouse/human CD44(BioLegend 貨號103030)、FVD(invitrogen Firable Viability Dye 660 貨號65-0864-14)、 Alexa Fluor 647anti-mouse CD45(BioLegend 貨號103124)、DAPI(索萊寶)、β-Actin(beyotime 貨號：AA128-1)、Akt(beyotime 貨號：AA326-1)、PCNA(CST 貨號：2586T)、Goat anti-Mouse IgG(H+L)(聯(lián)科生物 貨號：GAM007)、Anti-rabbit IgG (CST 貨號：7074S)、BCA試劑(TakaRa 貨號：T9300A-1)、免疫印跡一抗稀釋液(Beyotime 貨號：P0023A)、Super ECL Plus Western Blotting Substrate(葆光生物 貨號：BG0001)、PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)(雅酶 貨號：PG112升級版)、 T-PERTMTissue Protein Extraction Reagent(Thermo 貨號：78510)、TrypLETMExpress(thermo 貨號：12604013)、中性甲醛(重慶川東化工)、多聚甲醛(thermo貨號305362)、EDTA(碧云天 貨號：ST066)、EGTA(國藥集團 貨號10809717)、Trition X-100(索萊寶 貨號T8200)、防脫載玻片。

1.2 樣本制備

處死小鼠后取出小腸浸泡于盛有冰冷的PBS緩沖液培養(yǎng)皿中(置于冰上)，沖洗干凈腸內(nèi)殘余物，縱向剪開小腸，輕柔涮洗小腸內(nèi)壁，對折后剪取2 cm左右空腸，置入螯合液中(1×解離buffer：EDTA:EGTA 100∶1∶1)于4℃冰箱的在搖床上螯合40 min，而后用玻片刮取腸上皮，用1×PBS吹散，自然沉降，4℃冰箱存放。

1.3 熒光探針染色

將制備好的隱窩絨毛樣本使用10%中性甲醛常溫固定30 min，而后用1×PBS洗滌3次，自然沉降，而后用0.5%的Triton X-100常溫破膜2 h，后用1×PBS洗滌3次，自然沉降，而后用Actin-Tracker Green-488 (1∶200)探針室溫染色1h，1×PBS洗滌3次，滴加UEA(1∶100)孵育30 min，洗滌3次，防熒光淬滅劑混勻封片。

1.4 蛋白免疫印跡分析

將收集的隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)用RIPA裂解液作用30 min，離心收集上清液，取出10 μL用BCA法進行蛋白定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算樣品蛋白濃度，并將所有蛋白配制成等量關(guān)系，然后置于99℃的金屬浴中變性10 min，待蛋白冷至室溫后，以每孔18 μL的量加入準(zhǔn)備好的凝膠中進行電泳(恒壓135 V)。之后采用三明治法進行轉(zhuǎn)膜(恒流400 mA)，接著用5%脫脂奶粉封閉90 min，配制一抗(β-Actin 1∶5000、Akt 1∶1000、PCNA 1∶1000)在4℃下孵育過夜后用1× TBST洗滌3次，并室溫孵育二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)1∶1000、 Anti-rabbit IgG 1∶1000)90 min，再用TBST洗滌3次，配制化學(xué)發(fā)光液(1∶1)上機進行曝光分析。

1.5 流式分析

1.5.1 隱窩細胞表面標(biāo)記染色流式分析

將螯合結(jié)束的腸段通過震搖方式分離隱窩絨毛，并通過70 μm濾器過濾，將富集隱窩濾液放入預(yù)冷過的4℃離心機上700 rpm離心5 min，棄上清液，向隱窩沉淀中加入1 mL TryPLETM裂解液和250 μL的胰蛋白酶(4∶1)，在恒溫37℃金屬浴中將隱窩裂解成單細胞后終止裂解，1×PBS洗滌3次，1500 rpm離心5 min，100 μL液體重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，分別加入PE Anti-mouse CD24(1∶200)、PE/Cy7 Anti-mouse/human(1∶100)、CD45(1∶1000)熒光抗體以及FVD(1∶500)熒光染料，充分混勻，冰上孵育30 min后洗滌3次，1500 rpm離心5 min，400 μL 1×PBS重懸上機。

1.5.2 隱窩細胞周期流式分析

如上法將制備好的單細胞懸液加入PE Anti-mouse CD24(1∶200)、FVD(1∶500)、CD45(1∶1000)冰上孵育30 min，而后1500 rpm離心5 min，加入400 μL 4% PFA冰上固定30 min，1500 rpm離心5 min，0.1% Triton X-100室溫破膜15 min，1500 rpm離心5 min加入DAPI原液400 μL室溫染色30 min，洗滌，離心后400 μL 1×PBS重懸后上機。

1.6 數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析

流式數(shù)據(jù)使用SonyMA900流式分析/分選儀進行樣本分析，使用奧林巴斯顯微鏡進行免疫熒光圖片采集。使用ImageJ對蛋白免疫印跡條帶進行灰度值測定。使用FlowJoV10版本軟件進行流式數(shù)據(jù)處理，通過流式熒光參數(shù)進行Actin定量分析。使用Image-Pro plus 6.0版本對熒光圖片進行熒光定量分析，RGB模式選區(qū)，其通道閾值分別為R 0～255、G 14～255、B 0～255。通過SPSS 19.0版本進行獨立樣本t檢驗統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，運用Graphpad 8.0版本進行統(tǒng)計圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 β-Actin 在隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)中的分布

β-Actin作為細胞骨架蛋白在細胞中廣泛表達，為探究腸道絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)β-Actin分布及表達情況，將獲得的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)進行免疫熒光染色(圖1A)，發(fā)現(xiàn)絨毛的熒光強度較強，隱窩的熒光強度相對較弱。通過對其熒光密度進行量化統(tǒng)計，結(jié)果表明隱窩和絨毛間β-Actin的表達存在顯著差異(P<0.05)；為了進一步證實結(jié)果的可靠性，通過震搖方法分別富集高純度的隱窩細胞和絨毛結(jié)構(gòu)(圖1B)，并進行蛋白免疫印跡分析(圖1C)，結(jié)果同樣表明隱窩和絨毛間β-Actin表達存在顯著差異(P<0.05)，即絨毛β-Actin表達量約是隱窩的1.74倍。

圖1 β-Actin在隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)中的表達A：小鼠隱窩-絨毛免疫熒光染色，熒光密度定量(P<0.05 T-test(scale bar= 50μm)；B：小鼠隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)；C：小鼠隱窩-絨毛免疫印跡結(jié)果，β-Actin密度定量(P<0.05 T-test)

2.2 UEA染色分析增殖細胞和非增殖細胞β-Actin的表達

鑒于隱窩復(fù)雜的細胞組分及隱窩各細胞不同的功能，存在處于增殖和非增殖兩種狀態(tài)的細胞，腸道β-Actin蛋白主要參與腸上皮細胞的形態(tài)和遷徙。為了探究隱窩底部細胞β-Actin表達情況，研究發(fā)現(xiàn)隱窩底部干細胞龕中存在一群高密度熒光細胞群(圖2A)，為進一步探究其是否具有增殖能力，我們進行了荊豆凝集素(Ulex Europaeus Agglutinin, UEA)染色，一種分泌系細胞如潘氏細胞(Paneth cells PC)、內(nèi)分泌細胞(Endocrine cells EEC)和杯狀細胞(Goblet cell GC)等染料，以區(qū)分干細胞龕增殖與非增殖細胞群。通過熒光強度曲線分析發(fā)現(xiàn)，隱窩底部紅色熒光區(qū)域可見綠色熒光相對較強，提示非增殖的細胞具有更高β-Actin蛋白的表達。

圖2 β-Actin在非增殖細胞中高表達(scale bar =50 μm)A：小鼠隱窩免疫熒光染色；B：非增殖細胞與β-Actin免疫熒光共染

2.3 β-Actin 在隱窩和絨毛細胞表達的流式細胞分析

為了進一步定量隱窩-絨毛細胞β-Actin表達情況，選擇流式細胞技術(shù)對隱窩和絨毛進行定量分析。通過分別制備絨毛、隱窩細胞單細胞懸液，在保證染色條件相同前提下，經(jīng)過β-Actin熒光探針染色后通過流式細胞技術(shù)對隱窩和絨毛細胞進行熒光定量分析，如圖3A所示，隱窩細胞熒光跨度較大，提示隱窩細胞中各細胞成分之間存在增殖、分化及功能上的較大差異。作為分化后的絨毛細胞β-Actin表達相對集中，進一步提示增殖細胞相較于非增殖細胞的低表達β-Actin的結(jié)論。但就細胞的平均表達量而言(圖3B)，絨毛細胞β-Actin表達量是隱窩細胞均值的1.46倍，這種差異性提示β-Actin作為整個腸上皮蛋白內(nèi)參的局限性[8]，同時，也可為內(nèi)參校正提供參考。

圖3 β-Actin蛋白在絨毛細胞和隱窩細胞表達比較A：隱窩和絨毛細胞的熒光密度峰圖；B：隱窩和絨毛細胞熒光密度定量圖(流式熒光定量分析 *P<0.05 T-test)

2.4 CD24表面標(biāo)記區(qū)分下的各譜系細胞β-Actin表達的流式分析

隱窩細胞成分包含干細胞、前體細胞和分化后細胞，通過CD24表面標(biāo)記可實現(xiàn)隱窩細胞成分的區(qū)分[9]，如圖4A所示。通過SSC-A和CD24流式參數(shù)將隱窩細胞分為潘氏細胞、內(nèi)分泌細胞、增殖細胞以及其他分化細胞，通過對其熒光定量分析發(fā)現(xiàn)(圖4B、4C)各細胞系間存在β-Actin表達上的差異，其中Paneth細胞β-Actin表達量分別是內(nèi)分泌細胞的1.46倍、增殖細胞的2.49倍，與成像結(jié)果非增殖細胞表達較高相一致，而內(nèi)分泌細胞是增殖細胞的1.7倍，這些結(jié)果提示，β-Actin蛋白在分化后分泌細胞中具有更高表達量，可能參與了細胞分化和相關(guān)功能的執(zhí)行。

圖4 β-Actin在增殖細胞、內(nèi)分泌細胞、Paneth細胞中表達情況A：隱窩細胞CD24染色細胞分群(Progenitor cells, Pro Cells)；B：隱窩細胞β-Actin表達熒光峰圖；C：隱窩細胞β-Actin表達熒光定量分析柱狀圖(流式熒光定量分析 *P<0.05 T-test)

2.5 β-Actin表達與細胞周期的關(guān)系

腸道隱窩細胞是一群快速增殖的細胞，干細胞分化后通過TA(transient amplifying)區(qū)域快速擴增來確保絨毛細胞的更新?lián)Q代。這種快速的增殖和遷徙勢以及分化勢必會引起細胞骨架蛋白的表達變化，為探究隱窩細胞β-Actin與細胞周期的關(guān)系，對不同β-Actin表達的細胞群進行周期分析。如圖5A所示，隱窩細胞呈現(xiàn)出不同β-Actin表達量的細胞群，通過β-Actin-H和β-Actin-L細胞群周期分析發(fā)現(xiàn)(圖5B、5C)，β-Actin-H細胞主要處于G0/G1期，約占整個細胞群80%以上，與β-Actin-L細胞群(約占整個細胞群的50%～60%)具有顯著差異，這種周期上的差異表明，β-Actin在細胞增殖過程中為維持自身骨架重構(gòu)的流動性而處于相對低表達狀態(tài)，一旦細胞停止增殖走向分化，將伴隨骨架蛋白的表達增高，以維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的發(fā)揮。

圖5 隱窩細胞β-Actin表達水平不同的細胞的細胞周期分析A：隱窩細胞鬼筆環(huán)肽染色后細胞分群；B、C：不同β-Actin表達水平細胞的細胞周期分析(*P<0.05 T-test)

3 討論

腸道是哺乳動物重要的消化、吸收、排泄、免疫和內(nèi)分泌器官，腸道上皮的更新依靠位于隱窩底部腸道干細胞的增殖分化來實現(xiàn)[10]。腸道干細胞擴增后通過向上遷移至絨毛頂端最后脫落至腸腔，在3～5天內(nèi)完成腸上皮細胞的一次更新過程[11]。腸道干細胞關(guān)鍵細胞事件離不開細胞骨架的作用。細胞骨架是細胞在分裂、生長和發(fā)育過程中發(fā)生變化的動態(tài)結(jié)構(gòu)[12]。肌動蛋白絲、微管和中間絲是哺乳動物細胞骨架的主要成分。肌動蛋白絲代表在分化過程中經(jīng)歷廣泛重塑的細胞骨架系統(tǒng)，是負責(zé)細胞剛度和韌性的細胞骨架的主要組成部分[13]。

本研究免疫熒光染色結(jié)果顯示，隱窩β-Actin的表達量低于絨毛的，與蛋白免疫印跡結(jié)果一致。原因可能為處于未分化狀態(tài)的細胞形態(tài)需要處于一個動態(tài)變化的過程，以適應(yīng)關(guān)鍵細胞增殖和分化進程的發(fā)生；此時肌動蛋白絲處于解聚狀態(tài)，在細胞中形成不連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，故增殖細胞中β-Actin的表達量低于分化細胞的[14]。另外，通過隱窩細胞流式細胞檢測結(jié)果顯示，隱窩底部Paneth細胞β-Actin的表達量較其他隱窩細胞高，揭示了處于高度活躍增殖狀態(tài)的細胞其β-Actin的表達量最低。研究表明，動物細胞在進行胞質(zhì)分裂事件，即處于中后期時，肌動蛋白絲開始聚集在細胞質(zhì)中各細胞器的周圍并參與形成中央紡錘體及收縮環(huán)，相互間形成豐富的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以完成最后的胞質(zhì)分裂事件[14]。本實驗結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象：流式細胞周期結(jié)果顯示，大部分處于G0/G1期的細胞和少量G2/M期的細胞，β-Actin的熒光密度較強(未發(fā)表數(shù)據(jù))。這些結(jié)果提示在整個細胞周期中，處于活躍的細胞分裂時期，細胞形態(tài)的變化較大，故需要相關(guān)骨架蛋白成分發(fā)生較大的變動使細胞骨架陣列的重排，來滿足細胞分裂所需的形態(tài)學(xué)改變和細胞極化[15-16]。

本研究完成了對隱窩-絨毛細胞群β-Actin相對定量分析，測量出隱窩-絨毛細胞的β-Actin平均表達量差異比值，這一結(jié)果可為β-Actin作為內(nèi)參蛋白在研究絨毛-隱窩蛋白表達量時提供校正依據(jù)。同時，利用流式細胞技術(shù)進一步分析腸道各細胞群包括前體細胞、潘氏細胞和內(nèi)分泌細胞的β-Actin蛋白表達相對定量值，揭示了腸道隱窩細胞群β-Actin蛋白表達上的差異，而這種差異致使在選用β-Actin蛋白作為內(nèi)參時不可避免的產(chǎn)生誤差，因為在某些模型和疾病條件下隱窩細胞成分是存在差異的[17]，即使不同腸段細胞成分占比也存在明顯差異[18]，而本文相對定量研究結(jié)果可為研究小腸上皮隱窩細胞β-Actin蛋白作為內(nèi)參提供校正加權(quán)值。另外，在β-Actin與周期分析中揭示了β-Actin的表達可能與細胞的增殖活性有關(guān)，處于高度增殖活性的細胞，其細胞骨架處于一個高度動態(tài)重組狀態(tài)，以適應(yīng)細胞形態(tài)變化，并完成細胞增殖分化的關(guān)鍵細胞進程。同時，也提示當(dāng)細胞退出細胞周期可能需要β-Actin蛋白來穩(wěn)定細胞骨架參與隱窩細胞終末分化。鑒于這一結(jié)果，肌動蛋白染色和定量分析在一定程度上可以作為一種標(biāo)記來協(xié)助對腸上皮細胞增殖和分化狀態(tài)進行區(qū)分，甚至可以結(jié)合流式細胞技術(shù)，測算隱窩細胞中成熟分泌系細胞的比例，這都為研究腸上皮增殖和分化機制以及相關(guān)疾病模型提供了新的方法。接下來，我們將把注意力集中在β-Actin蛋白和骨架調(diào)控在腸干細胞和前體細胞分化中的具體作用上，為了解腸上皮組織再生和癌癥發(fā)生等病理現(xiàn)象提供新的數(shù)據(jù)。