丁夢琴，黑達(dá)西·巴哈提，彭鳳強(qiáng)，胡雅麗，沙爾山別克·阿不地力大

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

促卵泡激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)由顆粒細(xì)胞分泌，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，具有7個插入胞膜的疏水螺旋結(jié)構(gòu)，存在于卵巢顆粒細(xì)胞膜上，由676個氨基酸殘基組成，是促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)的特異性受體[1]。FSH是由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，是一種生物大分子，不能自主透過細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)功能及作用，必須通過存在于卵巢顆粒細(xì)胞膜上的FSHR介導(dǎo)將FSH運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而將信息傳遞到靶細(xì)胞膜內(nèi)[2]，當(dāng)激素FSH與FSHR胞外域相互作用后就啟動了級聯(lián)反應(yīng)，直接引發(fā)促性腺激素特定的生物學(xué)效應(yīng)。FSH與FSHR結(jié)合后，在活化芳香化酶的誘導(dǎo)下生成促黃體素(luteinizing hormone，LH)受體，可誘發(fā)排卵。因此FSHR對動物卵巢卵泡的發(fā)育、成熟和排卵具有重要作用[3]。目前，國內(nèi)外對FSHR基因多態(tài)性的研究主要集中在豬、羊等哺乳動物，且FSHR基因多態(tài)性與哺乳動物產(chǎn)仔數(shù)密切關(guān)聯(lián)[4-6]。目前，F(xiàn)SHR基因?qū)仪萆a(chǎn)性能的影響報道較少。本研究以拜城油雞為試驗對象，采取DNA混池重測序技術(shù)篩選SNP，再通過Sequenom飛行時間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行相關(guān)的位點分型，檢測拜城油雞FSHR基因多態(tài)性，并分析其與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)及孵化性能的相關(guān)性，以期為拜城油雞生產(chǎn)性狀的基因標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 試驗在新疆烏魯木齊市米東區(qū)長山子鎮(zhèn)昊翔養(yǎng)殖專業(yè)合作社開展，隨機(jī)挑選126日齡健康拜城油雞母雞150只，在相同飼養(yǎng)環(huán)境及飼糧水平下飼養(yǎng)。試驗雞均置于3層階梯籠同層飼養(yǎng)，自由飲水，每天光照時間16 h，光照強(qiáng)度10 lx，采用常規(guī)的玉米-豆粕型飼糧，每天分別于08:00和19:00供料2次，其他飼養(yǎng)管理按種雞場常規(guī)進(jìn)行。在300日齡時采集血液，EDTA抗凝，-20 ℃保存，用于基因組DNA提取。

1.1.2 測定指標(biāo)及方法 產(chǎn)蛋性能：每天18:00收集雞蛋，分別記錄各試驗雞開產(chǎn)蛋重、開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重、300日齡總產(chǎn)蛋數(shù)、300日齡平均產(chǎn)蛋重，統(tǒng)計300日齡內(nèi)每只雞產(chǎn)蛋率。

蛋品質(zhì)測定：在產(chǎn)蛋初期、產(chǎn)蛋中期及300日齡時分別收集每只雞蛋并做標(biāo)記，測定蛋品質(zhì)。采用多功能蛋品質(zhì)分析測定儀(EA-01，ORKA公司)測定蛋重、哈氏單位、蛋白高度和蛋黃顏色；采用游標(biāo)卡尺測定雞蛋縱徑和橫徑、蛋殼鈍端、中部、銳端厚度，求蛋形指數(shù)和蛋殼厚度值。

孵化率測定：在群體產(chǎn)蛋率達(dá)50%后，每天收集每只雞蛋并做好標(biāo)記，剔除不合格種蛋，放入蛋庫，每隔5～8 d入孵一批種蛋，入孵前記錄每只雞的入孵蛋數(shù)。種蛋入孵后，根據(jù)孵化場的照蛋情況，挑出入孵種蛋中的無精蛋，跟蹤記錄每批入孵種蛋的死胎數(shù)和出雛數(shù)，并計算受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率及死胎率。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，將合格DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA池重測序篩選SNP 試驗前期以16只拜城油雞為試驗對象，運(yùn)用DNA混池重測序技術(shù)篩選到大量SNPs，為保證后續(xù)試驗的可行性和準(zhǔn)確性，將對篩選出的SNPs進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。篩選條件如下[7]：①變異位點位于外顯子區(qū)域；②變異類型選取錯義突變；③一個基因出現(xiàn)多個位點變異的SNPs；④樣本基因型為雜合變異；⑤測序深度>40，測序深度越深，變異位點準(zhǔn)確性越高。最終篩選出7個SNPs位點(表1)。

表1 FSHR基因7個SNPs相關(guān)信息

1.2.3 SNP分型 將檢測合格的DNA送至北京康普森生物技術(shù)有限公司采用Sequenom飛行時間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行相關(guān)的位點分型。主要步驟如下：①引物設(shè)計：根據(jù)SNP位點序列信息，使用Sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay Design 3.1，設(shè)計PCR反應(yīng)引物和單堿基擴(kuò)展引物(表2)；②PCR擴(kuò)增：在TaqDNA聚合酶的作用下DNA序列與引物相結(jié)合，以dNTP為反應(yīng)原料、靶序列為模板對目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增；③SAP消化：將PCR混合物中所有的dNTP去磷酸化；④單堿基延伸反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入延伸引物，擴(kuò)增出帶有SNP位點的PCR產(chǎn)物，熒光標(biāo)記ddNTP，通過單堿基延伸后使引物帶上SNP位點堿基相關(guān)的熒光，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)測序儀分析后得到SNP位點的信息；⑤質(zhì)譜檢測：將反應(yīng)產(chǎn)物(共9 μL)稀釋3倍，使用樹脂進(jìn)行脫鹽，將脫鹽處理后的樣品點在樣品靶上，自然結(jié)晶，進(jìn)行質(zhì)譜檢測，并收集數(shù)據(jù)。

表2 引物信息

1.2.4 統(tǒng)計分析 計算7個SNPs位點的基因型頻率和基因頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡適應(yīng)性檢驗及遺傳多樣性分析。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件初步整理，使用SPSS 26.0軟件的一般線性模型進(jìn)行FSHR基因多態(tài)性與拜城油雞生產(chǎn)性能的相關(guān)性分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA提取

提取的基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，條帶清晰明亮，無蛋白污染(圖1)。試驗樣品符合以下要求：D260 nm/D280 nm值在1.7～2.1之間；單個樣品濃度>50 ng/μL；單個樣品試驗總量>2 μg；樣品無大分子污染；樣品保持完整，無降解，可滿足后續(xù)檢測要求。

M，DNA Marker；1～16，拜城油雞樣品DNAM，DNA Marker；1-16，DNA of samples in Baicheng You chickens圖1 拜城油雞基因組DNA提取Fig.1 Genome DNA extraction of Baicheng You chickens

2.2 拜城油雞FSHR基因多態(tài)性分析

利用Mass Array技術(shù)對129個拜城油雞樣本7個SNPs進(jìn)行基因分型，通過質(zhì)譜軟件統(tǒng)計分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個SNPs均具有多態(tài)性，且未識別出的堿基數(shù)較少，可以進(jìn)行下一步SNPs位點與生產(chǎn)性能遺傳效應(yīng)的研究。利用Excel統(tǒng)計7個SNPs的等位基因頻率和基因型頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗及遺傳多樣性分析，結(jié)果見表3、4。由表3可知，除SNP6外其余SNPs檢出率均在90%以上，將檢出率>90%的SNPs位點用于對拜城油雞生產(chǎn)性能的影響分析。χ2適應(yīng)性檢驗結(jié)果顯示，除SNP2和SNP6外其余突變位點均符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。SNP1檢測到2種基因型：CC和CA，CC為優(yōu)勢基因型，C為優(yōu)勢等位基因；SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7均檢測到3種基因型，SNP2、SNP3和SNP7的基因型分別為：TT、TC和CC，優(yōu)勢基因型均為TC，SNP2和SNP3的優(yōu)勢等位基因均為T，SNP7的優(yōu)勢等位基因為C；SNP4的基因型分別為AA、AG和GG，AA為優(yōu)勢基因型，A為優(yōu)勢等位基因；SNP5的基因型分別為CC、CG和GG，CG為優(yōu)勢基因型，G為優(yōu)勢等位基因；SNP6檢測到2種基因型：AA和GG，AA為優(yōu)勢基因型，A為優(yōu)勢等位基因。由表4可知，SNP1和SNP6均處于低度多態(tài)(PIC<0.25)，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7均處于中度多態(tài)(0.25

表3 拜城油雞FSHR基因SNPs位點的基因型頻率和基因頻率

表4 拜城油雞FSHR基因SNPs位點的遺傳多樣性

2.3 FSHR基因多態(tài)性對拜城油雞產(chǎn)蛋性能的影響

由表5可知，SNP2位點對開產(chǎn)日齡具有極顯著影響，CC基因型個體開產(chǎn)日齡極顯著高于TT基因型(P<0.01)，顯著高于CT基因型(P<0.05)，TT基因型個體開產(chǎn)日齡最早；SNP5位點對拜城油雞300日齡總產(chǎn)蛋量具有極顯著影響，對300日齡平均蛋重、開產(chǎn)蛋重及開產(chǎn)體重均具有顯著影響，其中CG基因型個體300日齡總產(chǎn)蛋量極顯著高于CC和GG基因型(P<0.01)，CG基因型個體300日齡平均蛋重、開產(chǎn)蛋重均顯著高于GG基因型(P<0.05)，CG基因型個體開產(chǎn)體重顯著高于CC基因型(P<0.05)；SNP7位點對拜城油雞開產(chǎn)蛋重有顯著影響，其中TT基因型個體開產(chǎn)蛋重顯著高于CC和CT基因型(P<0.05)。

表5 FSHR基因SNPs對拜城油雞產(chǎn)蛋性狀的影響

2.4 FSHR基因多態(tài)性對拜城油雞蛋品質(zhì)的影響

由表6可知，SNP2位點對拜城油雞蛋重具有顯著影響，其中TT基因型個體蛋重顯著高于CT基因型(P<0.05)；SNP3位點對拜城油雞蛋殼厚度有顯著影響，其中CC基因型個體蛋殼厚度顯著低于TT基因型(P<0.05)；SNP5位點對拜城油雞蛋殼厚度有顯著影響，其中GG基因型個體蛋殼厚度顯著低于CC和CG基因型(P<0.05)；SNP7位點對拜城油雞蛋重、蛋白高度及蛋黃重均有顯著影響，對哈氏單位有極顯著影響，其中TT基因型個體蛋重顯著高于CC和CT基因型(P<0.05)，TT基因型個體蛋白高度和蛋黃重顯著高于CT基因型(P<0.05)；TT基因型個體哈氏單位極顯著高于CC和CT基因型(P<0.01)。

表6 FSHR基因SNPs對拜城油雞蛋品質(zhì)的影響

2.5 FSHR基因多態(tài)性對拜城油雞孵化性能的影響

由表7可知，SNP2對拜城油雞入孵蛋死胚率有顯著影響，其中TT基因型個體入孵蛋死胎率顯著高于CC基因型(P<0.05)；其余6個SNPs不同基因型對入孵蛋孵化率、受精率和受精蛋孵化率均無顯著影響(P>0.05)。

表7 FSHR基因SNPs對拜城油雞孵化性能的影響

3 討 論

3.1 FSHR基因多態(tài)性分析

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因在拜城油雞外顯子1、4、5、10上均存在突變位點，在挑選的7個SNPs位點中，SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP7位點多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在遺傳多態(tài)性分析中可把有效等位基因數(shù)、遺傳雜合度和多態(tài)信息含量作為衡量某群體遺傳變異大小的指標(biāo)，遺傳多態(tài)信息指標(biāo)數(shù)值越大，表明遺傳變異程度越高，選擇的潛力就越大[8]。本研究中，拜城油雞試驗群體多態(tài)信息含量已達(dá)到中度多態(tài)，且該群體未偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明在拜城油雞群體FSHR基因上挑選出的SNPs位點多態(tài)性相對較高，遺傳變異相對較大，有望獲得更多的遺傳進(jìn)展。石宇等[9]研究發(fā)現(xiàn)，兔FSHR基因外顯子10中存在g.163537 G>A和g.163619 A>G突變，其中g(shù).163537 G>A為同義突變，g.163619 A>G為錯義突變，編碼氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸，2個位點均處于低度多態(tài)，群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因外顯子10中存在2個SNPs，均為錯義突變，Hardy-Weinberg平衡檢驗與石宇等[9]研究結(jié)果相似。錯義突變是指在基因序列中編碼某一種氨基酸的密碼子經(jīng)堿基替換而發(fā)生改變，原本的編碼功能變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使得多肽鏈上的氨基酸種類和序列發(fā)生本質(zhì)上的變化。而氨基酸作為構(gòu)成蛋白的基本結(jié)構(gòu)，編碼氨基酸的密碼子改變后會引起編碼的蛋白隨之變化，基因的表達(dá)又受到蛋白的調(diào)控，從而引起生物體基因的功能發(fā)生變化。錯義突變可能是一種積極的變化，自然選擇有利于基因的新表達(dá)，且生物個體可能已經(jīng)從該突變開發(fā)出有利的適應(yīng)，在繁殖過程中將此變化傳遞給后代[10]。

Kang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，雞FSHR基因5′-UTR區(qū)存在1個200 bp長度的插入或缺失，以及cFSHR啟動子片段檢測出49個完全突變，包含39個單核苷酸替換、1個核苷酸替換和9個核苷酸的插入缺失。自先念等[12]研究發(fā)現(xiàn)，茶花雞FSHR基因外顯子1中發(fā)現(xiàn)g.34847 A>G和g.35000 C>T 2個SNPs，其中，g.34847 A>G位點只存在AA和GG 2種基因型，均屬于中度多態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，拜城油雞FSHR基因外顯子1中存在g.7640519 C>A和g.7640639 T>C 2個SNPs，其中g(shù).7640519 C>A位點存在2種基因型，g.7640639 T>C位點存在3種基因型，多態(tài)信息含量與自先念等[12]研究結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)，在人FSHR基因外顯子10上存在2個SNPs，2個SNPs位點均引起編碼氨基酸的變化[13]；豬FSHR基因外顯子10上存在3個SNPs位點，分別為：C1491T、G1885A和C1977T[14]；隴東絨山羊FSHR基因外顯子10上檢測到G1542T和T1595G 2個多態(tài)位點，其中T1595G 位點為錯義突變，可能會引起所編碼的氨基酸發(fā)生改變，此位點存在4種基因型：AA、AB、BB和AC[5]。許瑤[15]在香豬FSHR基因外顯子10中發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點，即rs322800083(C/T)、rs322115220(T/C)和novel 1(G/A)，其中rs322800083(C/T)位點突變引起其編碼氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。綜上，F(xiàn)SHR基因在不同物種群體中均存在多態(tài)性，其中外顯子1、4和10較為重要，更具有遺傳選擇潛力。

3.2 FSHR基因多態(tài)性與拜城油雞生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)性

FSHR基因與動物生產(chǎn)繁殖性能具有緊密的關(guān)聯(lián)性。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因SNPs位點與拜城油雞產(chǎn)蛋性能存在顯著關(guān)聯(lián)性，與Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)北京油雞FSHR基因存在的5個SNPs位點均與產(chǎn)蛋性能呈顯著相關(guān)相同，其中g(shù).-181 A>T、g.159 C>T和g.-310 A>G位點與北京油雞不同周齡產(chǎn)蛋數(shù)均存在相關(guān)性，g.75470 A>G和g.75860 G>A位點對開產(chǎn)蛋重具有顯著影響；在東鄉(xiāng)雞和蘇肯雞群體中FSHR基因的SNP(C1684T)對43周齡產(chǎn)蛋數(shù)存在顯著影響[17]；但在拜城油雞中g(shù).7716725 G>C位點對300日齡總產(chǎn)蛋量呈現(xiàn)極顯著影響，對開產(chǎn)蛋重具有顯著影響，在不同品種雞中FSHR基因影響產(chǎn)蛋量的位點不同。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性對信陽褐雞的開產(chǎn)日齡具有顯著影響；自先念等[12]研究發(fā)現(xiàn)，茶花雞FSHR基因g.35000 C→T位點的TT基因型個體開產(chǎn)日齡顯著高于CT基因型，CT基因型個體43周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于CC和TT基因型。本試驗中，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性對拜城油雞開產(chǎn)日齡具有極顯著影響，其中g(shù).7640639 T>C位點CC基因型個體極顯著高于TT基因型，顯著高于CT基因型。王克華等[19]研究發(fā)現(xiàn)，如皋黃雞FSHR基因內(nèi)含子2中存在3個SNPs位點，其中C+29329A位點對開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)蛋重及40周齡蛋重均具有顯著影響，C+30582G位點對40周齡總產(chǎn)蛋數(shù)具有顯著影響；G+51411A位點對開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重及40周齡總產(chǎn)蛋數(shù)均具有顯著影響。在本研究中沒有開展FSHR基因內(nèi)含子處SNPs位點與拜城油雞生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)性分析，后續(xù)可進(jìn)一步探究。李亨[20]研究表明，文昌雞FSHR基因外顯子4中存在SNPs位點，且與文昌雞300日齡產(chǎn)蛋數(shù)及平均聯(lián)產(chǎn)天數(shù)呈顯著相關(guān)；陳蘭等[21]研究發(fā)現(xiàn)，京海黃雞FSHR基因外顯子1和10中均存在SNPs位點，其中外顯子1突變位點對300日齡產(chǎn)蛋數(shù)存在顯著影響，外顯子10突變位點對開產(chǎn)日齡具有顯著影響。本研究中，F(xiàn)SHR基因外顯子1對拜城油雞開產(chǎn)日齡具有極顯著影響，外顯子10突變位點與300日齡產(chǎn)蛋量、300日齡平均蛋重及開產(chǎn)蛋重均具有顯著影響，與上述研究結(jié)果不同。綜上，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性與雞各生產(chǎn)性能指標(biāo)具有緊密的關(guān)聯(lián)性，但在不同品種雞中其SNPs位點存在差異，不同位點的基因型與不同品種雞生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)結(jié)果也不同。

4 結(jié) 論

FSHR基因外顯子1、4、5和10中的SNPs位點對拜城油雞生產(chǎn)性能存在顯著影響，其中外顯子10中SNPs位點與拜城油雞300日齡總產(chǎn)蛋量存在極顯著遺傳效應(yīng)，與開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重等產(chǎn)蛋性能指標(biāo)及蛋重、蛋白高度、哈氏單位等蛋品質(zhì)指標(biāo)均存在顯著關(guān)聯(lián)性，外顯子1中SNPs位點與拜城油雞開產(chǎn)日齡存在極顯著關(guān)聯(lián)性。FSHR基因外顯子處存在多態(tài)性，且與拜城油雞生產(chǎn)性能具有顯著關(guān)聯(lián)性，可作為與生產(chǎn)性能相關(guān)的分子標(biāo)記基因用于拜城油雞高繁殖力種雞的選育。