莫紫梅，袁光蔚，王海波，陳寧周，寧 芯，覃 思，何林飛

(1.廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心，廣西 南寧 530022; 2.玉林師范學(xué)院化學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣西 玉林 537000)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)又稱為嘔吐毒素，屬B型單端孢霉烯族化合物，是鐮刀菌屬的菌種引起的谷物赤霉病的重要指示性毒素，會(huì)影響免疫細(xì)胞因子的分泌、抑制淋巴細(xì)胞增殖、具有吞噬作用和巨噬細(xì)胞的殺菌作用，有很強(qiáng)的免疫抑制作用，可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，抑制其增殖[1-3]，人畜如果長期食用被DON污染的食物，會(huì)引起細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性等，其危害直接影響到了人和家畜的健康安全[1-2]。嘔吐毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，受熱不易分解，通常存在于全球各地區(qū)的小麥、玉米和大麥等農(nóng)作物中，是一種嚴(yán)重污染谷物的霉菌毒素，在作物加工、儲(chǔ)存及食品烹調(diào)過程中不容易被破壞，對人類和動(dòng)物健康構(gòu)成很大威脅[3]。

目前測定嘔吐毒素比較常用的檢測方法有薄層色譜法[4-5]、親和高效液相色譜法[6]。但這些分析方法在應(yīng)用上有一定的局限性，具有耗時(shí)長、成本高等缺點(diǎn)，需要大型的儀器設(shè)備，無法在現(xiàn)場靈活使用[7-8]。近些年也出現(xiàn)了一些快速簡便的DON檢測方法，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)[6]、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法[6-7]、光纖生物傳感器技術(shù)[5]、膠體金免疫層析法[9-10]及免疫熒光技術(shù)[11-13]等。這些技術(shù)由于具有現(xiàn)場檢驗(yàn)快速、簡便的特點(diǎn)，特別適合于廣大基層人員使用和大批量食品檢測以及大面積地區(qū)普查，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場應(yīng)用前景[14-15]。

免疫熒光技術(shù)是近年發(fā)展起來的新興技術(shù)，擁有傳統(tǒng)相關(guān)技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢。但因?yàn)閭鹘y(tǒng)的熒光染料如異硫氰酸熒光素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜互相干擾嚴(yán)重，一定程度上限制了免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用范圍。而熒光量子點(diǎn)(QDs)作近幾年出現(xiàn)的新型熒光標(biāo)記材料，因?yàn)槠渚哂邪l(fā)射光譜范圍窄且對稱、Stokes位移大、背景噪聲小等優(yōu)點(diǎn)，致使其靈敏度和分辨率得到顯著提高，并引起了各國研究者的極大關(guān)注[16-17]。熒光免疫層析定量檢測技術(shù)是在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用熒光定量分析技術(shù)對標(biāo)記物濃度進(jìn)行檢測的一種新方法[16]。使用熒光量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記材料的熒光免疫層析定量檢測技術(shù)，通過量子點(diǎn)標(biāo)記嘔吐毒素抗體與樣品中的嘔吐毒素結(jié)合，在毛細(xì)作用下向前層析，達(dá)到檢測區(qū)后，檢測線T線上固定的嘔吐毒素抗原與剩余未結(jié)合的量子點(diǎn)標(biāo)記嘔吐毒素抗體結(jié)合。檢測線T線上結(jié)合的量子點(diǎn)標(biāo)記的嘔吐毒素抗體的量與樣品中嘔吐毒素的濃度成反比，控制線C線結(jié)合的量子點(diǎn)熒光標(biāo)記物與樣品中嘔吐毒素的濃度無關(guān)。層析結(jié)束后，采用 NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度并計(jì)算T/C值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中嘔吐毒素的含量。

本試驗(yàn)采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀快速定量檢測谷物中嘔吐毒素的含量，通過2種方法的比較，確定量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測谷物中嘔吐毒素的可行性和可靠性，且該法操作簡單，檢測時(shí)間短，特異性良好，有望用于各地市場現(xiàn)場快速定量檢測嘔吐毒素，在公共食品安全等領(lǐng)域具有重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器與設(shè)備

QUINTIX313-ICEU電子天平,德國賽多利斯公司；RDTANA460R離心機(jī),美國Thermo Fisher Scientific公司；Multi Reax多管式渦旋振蕩器,德國海道夫公司；NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀,江蘇量點(diǎn)科技有限公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng),美國Milli-pore 公司；EBA 270離心機(jī),德國Hettich科學(xué)儀器公司；Shimadzu DGU-20A超高效液相色譜儀,日本島津公司；AB QTRAP 4500 MS四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源),美國AB SCIEX公司。

1.1.2材料與試劑

DON稀釋液B(20210101)；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。甲醇、甲酸、乙酸、乙酸銨(色譜純),默克股份公司；嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100.10 μg/ml)、嘔吐毒素免疫親和柱，ROMER LABS有限公司。

1.2 方法

1.2.1量子點(diǎn)熒光免疫層析法

(1)樣品前處理

玉米前處理：取20～30 g玉米樣品于粉碎機(jī)中進(jìn)行充分粉碎，可反復(fù)2～3次。將粉碎過的樣品過20目(孔徑0.85 mm)篩，收集過篩樣品備用。稱取過篩樣品5 g置50 ml離心管中，加入55%甲醇溶液25 ml，混勻，旋渦震蕩10 min，6 000 g離心3 min，收集上清液。取上清液100 μl，與稀釋液B 400 μl振蕩混勻，待上樣檢測。(注：個(gè)別檢測樣品如噴漿玉米皮、噴漿玉米胚芽粨、DDGS等呈酸性時(shí)，請微調(diào)pH值至6～8，調(diào)節(jié)pH值時(shí)注意總體積變化不要超過1%)。

小麥前處理：取20～30 g小麥樣品于粉碎機(jī)中，進(jìn)行充分粉碎，可反復(fù)2～3次。將粉碎過的樣品過20目篩，收集過篩樣品備用。稱取過篩樣品5 g置離心管中，加入純水25 ml，混勻，旋渦震蕩10 min，6 000 g離心5 min，收集上清液。取100 μl上清液，加入300 μl稀釋液A，充分震蕩2 min，待檢。

(2)樣品檢測

將檢測卡及待檢樣本取出，平衡至室溫，開啟NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀。將檢測卡加樣孔朝上平放，移取的待檢樣本75 μl垂直緩慢滴入檢測卡的加樣孔中，反應(yīng)15 min，將檢測卡插入 NepQD-Infinity-V1/P1快速熒光分析儀，并進(jìn)行檢測。

1.2.2高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法

(1)樣品前處理

按GB 5009.111-2016[18]操作。稱取 2 g(準(zhǔn)確至 0.01 g)粉碎試樣于50 ml離心管中，加入400 μl混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液(84+16)，置于渦旋振蕩器振蕩20 min，以10 000 r/min 離心5 min，收集上清液 于干凈的容器中備用。

取 5 ml 上清液置于40～50 ℃下氮?dú)獯蹈?加入2 ml 水充分溶解殘?jiān)?，待嘔吐毒素免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至玻璃注射器筒中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以每秒 1 滴的流速通過免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用5 ml PBS 緩沖鹽溶液和5 ml水先后淋洗免疫親和柱，流速約為每秒1～2滴，直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準(zhǔn)確加入 2 ml 甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，加?1.0 ml 初始流動(dòng)相,渦旋 30 s 溶解殘留物，0.22 μ m 濾膜過濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μ g/ml):分別稱取 DON 1 mg(準(zhǔn)確至 0.01 mg)，分別用乙腈溶解并定容至 10 ml。將溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中,在-20℃ 下密封保存，有效期 1 年。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(10 μg/ml):準(zhǔn)確吸取100 μg/ml DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 ml 于10 ml 容量瓶中,加乙腈定容至刻度。在-20 ℃ 下密封保存，有效期半年。

同 位 素 內(nèi) 標(biāo) 工 作 液(1 μg/ml):準(zhǔn) 確 吸 取13C15-DON同 位 素 內(nèi) 標(biāo)(25 μg/ml)1 ml于25 ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20 ℃下密封保存,有效期半年。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相配制成 10、20、40、80、160、320、640 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)系列,其中同位素內(nèi)標(biāo)濃度為100 ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于4 ℃保存，有效期7 d。

(3)色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCRBEH C18柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：40℃；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；流動(dòng)相：A 為水，B 為乙腈；采用梯度洗脫程序，見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

(4)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：負(fù)離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；電噴霧電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；curtain gas(氣簾氣)為35.0 psi；gas 1(霧化氣)、gas2(輔助氣)分別為50，50 psi。MRM相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表2。

表2 嘔吐毒素及其內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間、定性離子、定量離子與內(nèi)標(biāo)物等MRM相關(guān)參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 線性范圍、檢出限、回收率及精密度

同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為：Y=3 064.7X+4 811.2，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6，表明在濃度10～640 ng/ml時(shí)線性關(guān)系良好，檢出限10.0 μg/kg。

量子點(diǎn)熒光免疫層析法采用NepQD-Infinity-V1快速免疫熒光分析儀內(nèi)置曲線，其線性方程為：Y2.020 2X+5.016 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，其中Y=ln(p/q)，p=OD/OD0，q=1-p，式中X為ln(目標(biāo)物濃度)，OD為目標(biāo)物反應(yīng)值，OD0為目標(biāo)物濃度為0的反應(yīng)值均值。量子點(diǎn)熒光免疫層析檢測谷物中嘔吐毒素的線性范圍為25～5 000 μg/kg，檢出限為25 μg/kg。

取陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3個(gè)不同水平，將嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白玉米粉樣品中，混合均勻，按照1.2方法進(jìn)行試驗(yàn)，同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和量子點(diǎn)熒光免疫層析法的回收率分別為92.9%～98.0%和85.5%～101.1%，精密度為1.3%～3.4%及0.4%～3.0%，見表3。根據(jù) GB/T 27404—2008附錄F[19]中的要求，回收率參考范圍被測組分含量<0.1 mg/kg時(shí)，回收率范圍在60%～120%；0.1～1 mg/kg時(shí)，回收率范圍在80%～110%；1～100 mg/kg時(shí)，回收率范圍在90%～110%；>100 mg/kg時(shí)，回收率范圍在95%～105%，符合國標(biāo)要求。

表3 2種檢測方法線性方程、回收率、檢出限比較

2.2 質(zhì)控樣及其精密度

采用2種方法對購買具有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的質(zhì)控樣(特性值1 082.5 μg/kg，特性值區(qū)間1 029.2～1 135.8 μg/kg)進(jìn)行測定。結(jié)果表明，同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法和量子點(diǎn)熒光免疫層次法的結(jié)果分別為1 106.7 μg/kg及1 048.2 μg/kg，均在特性值區(qū)間范圍內(nèi)，符合要求。且對樣品進(jìn)行6次獨(dú)立重復(fù)測試，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9%和2.3%，精密度均符合定量分析的要求。見表4。

表4 2種檢測方法質(zhì)控樣測定結(jié)果

2.3 靈敏度、假陰性率

靈敏度是指方法在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到的實(shí)際最低檢出水平時(shí)，檢出陽性結(jié)果的陽性樣品數(shù)占總陽性樣品數(shù)的百分比。假陰性率是指方法在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到的實(shí)際最低檢出水平時(shí)，陽性樣品中檢出陰性結(jié)果的最大概率(以百分比計(jì))。根據(jù)食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號(hào)《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中計(jì)算公式，見表5。

表5 熒光量子點(diǎn)免疫層析法靈敏度及假陰性率

在參比方法檢測的所有陽性樣本中：

參比方法的陽性樣本數(shù)量(N1)=快檢陽性數(shù)量(N11)+快檢陰性數(shù)量(N12)

靈敏度(p+，%)=快檢陽性數(shù)量(N11)/(參比方法的陽性數(shù)量(N1))×100(其中參比方法的陽性數(shù)量=快檢陽性數(shù)量+快檢陰性數(shù)量)。

假陰性率(pf-，%)=快檢陰性數(shù)量(N12)/參比方法的陽性數(shù)量(N1)×100

本試驗(yàn)中，同位素稀釋法高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法為參比方法，量子點(diǎn)熒光免疫層析為快檢方法。由表6可知，在試驗(yàn)的193批樣本中，參比方法測定的陽性樣本數(shù)為53批，未檢出的視為陰性樣本共140批。量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測的陽性樣本數(shù)為52批，陰性樣本數(shù)為1批，故熒光量子點(diǎn)免疫層析檢測技術(shù)的靈敏度為98.1%，假陰性率為1.9%。

2.4 2種方法一致性的比較

同位素稀釋法高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法和量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測的193批玉米和小麥粉樣品中，有140批樣本采用2種方法均未檢出嘔吐毒素，其余53批樣本中采用2種方法均檢出嘔吐毒素，2種方法測得結(jié)果見表6，其相對偏差為0.16%～4.75%。對2種方法嘔吐毒素檢測結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)，t=0.506 2，t雙衛(wèi)臨尾(0.025,53)=2.311，t

表6 2種方法檢測樣品DON含量的比較

3 結(jié)論與討論

量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測糧食中嘔吐毒素的檢出限、回收率、精密度均良好，且和國標(biāo)檢測方法同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法數(shù)據(jù)對比無顯著性差異，符合國標(biāo)要求。因此，可以認(rèn)為對熒光量子點(diǎn)免疫層析法快速定量檢測食品中嘔吐毒素的評價(jià)良好，該檢測方法可以用于各地市場現(xiàn)場快速定量檢測食品中的嘔吐毒素含量，并將會(huì)在公共食品安全等領(lǐng)域具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

近年來，食品安全問題引起了全世界的普遍關(guān)注，尤其是真菌毒素超標(biāo)問題。嘔吐毒素在自然界中分布廣泛，目前是玉米、小麥等糧食作物污染較嚴(yán)重并且毒性最強(qiáng)的天然污染物之一。量子點(diǎn)作為一類理想的熒光探針，不僅是傳統(tǒng)熒光染料的補(bǔ)充，而且在熒光性能方面更優(yōu)越，在免疫分析中的應(yīng)用是一個(gè)值得引起重視的新領(lǐng)域。本試驗(yàn)利用熒光量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)檢測玉米及其制品中的嘔吐毒素，空白玉米粉中嘔吐毒素的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)取得了較好的結(jié)果，其回收率范圍在85.5%～101.1%，精密度在0.4%～3.0%，與 GB 5009.111—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》方法相比，該方法具有分析時(shí)間短、步驟簡單、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，且靈敏度、特異性均很好，可在基層快檢中推廣應(yīng)用，同時(shí)也為該方法用于其他真菌毒素的定量熒光免疫檢測提供了參考。