馮 潔 郭曄紅 姜 侃 朱文娟

(1 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州，730070； 2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州，730070)

肉蓯蓉來源為列當(dāng)科植物肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)或管花肉蓯蓉(Cistanchetubulosa(Schenk)Wight)的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，主要功效為補(bǔ)腎養(yǎng)陽、益精益血、潤腸通便等[1]，其主要生物活性成分為苯乙醇苷類[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、助陽排便、保肝、改善大腦記憶等藥理作用[3-9]，通常用于經(jīng)血不足、腎陽虛等多種疾病，是一種有價(jià)值的中草藥[10]。

肉蓯蓉是一種寄生植物，寄主植物通常為藜科梭梭屬植物梭梭[Haloxylonammodendron(C.A.Mey.)Bunge]，通常分布在我國西北地區(qū)，具有耐旱、耐鹽、耐貧瘠等特性[11]，是一種極其重要的防沙固沙植物[12]。肉蓯蓉的各種栽培技術(shù)都在不斷改進(jìn)[13]，但因梭梭的生長受到限制，生長4年以后才可以培養(yǎng)沙漠肉蓯蓉，阻礙了肉蓯蓉的生長過程，制約了肉蓯蓉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，技術(shù)人員在甘肅省成功種植了以四翅濱藜[Atriplexcanescens(Pursh)Nutt]為寄主植物的肉蓯蓉，極大地促進(jìn)了肉蓯蓉的發(fā)展。因?yàn)樗某釣I藜和梭梭同屬藜科植物，關(guān)系密切，廣泛應(yīng)用于牧草和鹽堿地改良，被稱為“生物脫鹽器”[14-17]，四翅濱藜生長迅速，具有較強(qiáng)的抗寒、抗鹽、抗堿特性。四翅濱藜是墾荒，退化牧場改良，恢復(fù)工礦區(qū)的廢墟地帶、道路兩旁、鹽含量高的荒漠地帶植被和水土保持的先鋒樹種。它的蛋白質(zhì)含量高，是飼養(yǎng)牛、羊的好飼料。其可飼性、產(chǎn)肉率與其他幾種常見的飼料相當(dāng)。同時(shí)四翅濱藜的生物量較大，尤其在冬春雪后不易被雪掩埋，從而可以提高牧區(qū)的抗“白災(zāi)”能力。建立四翅濱藜的灌木飼料林，對(duì)于氣候干旱、草場產(chǎn)草量低、牛羊飼草嚴(yán)重不足的地區(qū)來說，具有十分重要的意義。

然而，目前國內(nèi)外對(duì)其寄生關(guān)系的關(guān)鍵問題，以及寄生在四翅濱藜上的肉蓯蓉的質(zhì)量特性尚不清楚，而肉蓯蓉因具有較高的藥用價(jià)值，具有巨大的市場價(jià)值和良好的開發(fā)前景。一測多評(píng)(Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker，QAMS)是一種新的適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，在只測定一種成分的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分含量的同時(shí)測定。在中藥成分的測定中，由于中藥成分復(fù)雜，活性成分多，通常需要多種對(duì)照品，化學(xué)成分難以分離，價(jià)格昂貴，導(dǎo)致大量的中藥對(duì)照品匱乏[18]。QAMS通常只需要測出一種化學(xué)成分含量，根據(jù)中藥化學(xué)成分的內(nèi)在聯(lián)系和比例，通過一種成分含量得出多指標(biāo)成分含量，其方法在中藥化學(xué)成分測定中已經(jīng)得到了證實(shí)。本研究以不同寄主植物肉蓯蓉為研究對(duì)象，采用一測多評(píng)法分析肉蓯蓉中松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的含量變化[19-22]，旨在進(jìn)一步研究不同寄主植物肉蓯蓉中4種苯乙醇苷成分的含量變化，為肉蓯蓉的開發(fā)和利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters公司，美國，型號(hào)：waters Arc)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，瑞士，型號(hào)：AL104)；超聲波清洗器(深圳市得康科技有限公司，型號(hào)：KQ-100E)。

1.2 試劑 松果菊苷(批號(hào)：82854-37-3)、肉蓯蓉苷A(批號(hào)：93236-42-1)、毛蕊花糖苷(批號(hào)：61276-17-3)，購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；管花苷A(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：112516-05-9)；水為超純水，甲酸、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 分析樣品 鮮品肉蓯蓉產(chǎn)地為甘肅省白銀市民勤縣，采收時(shí)間為2019年11月，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)郭曄紅副教授鑒定為肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma帶鱗葉的肉質(zhì)莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；洗脫梯度(0～5 min，15%～20% A；5～12 min，20%～45% A；12～16 min，45%～55% A；16～20 min，55%～35% A；20～22 min，35%～15% A；22～24 min，15% A)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為330 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的對(duì)照品適量，加入50%甲醇，制成每1 mL含松果菊苷0.59 mg、肉蓯蓉苷A 0.14 mg、管花苷A 0.015 mg和毛蕊花糖苷0.027 mg的混合對(duì)照品溶液，4 ℃冰箱保存。

2.3 供試品溶液的制備 取肉蓯蓉樣品1.0 g，置于錐形瓶中，加50 mL的50%甲醇，稱重，浸泡30 min，超聲處理40 min(功率250 W，頻率35 kHz)，冷卻至室溫，加50%甲醇補(bǔ)重，過濾，取連續(xù)濾液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果各組分峰形良好，無干擾成分。

2.5 線性關(guān)系的考察 取上述混合對(duì)照品溶液0.5、5、10、15、20、30 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定。對(duì)照品進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)(X)，峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷的線性范圍分別為0.295～17.7、0.07～4.2、0.007 5～0.45、0.007 5～0.45 μg(r≥0.999 8)。見表1。

表1 4種成分的回歸方程和線性范圍

2.6 精密度試驗(yàn) 吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(Relative Standard Deviation，RSD)分別為0.31%、0.98%、1.87%、0.88%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取“2.3”項(xiàng)下供試品適量，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣，于0、2、4、12 h測定，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的峰面積RSD值分別為1.49%、1.78%、2.60%、2.21%，表明在12 h內(nèi)供試品穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批肉蓯蓉樣品，按照“2.3”項(xiàng)平行配制6份供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的峰面積RSD值分別為2.11%、3.09%、2.30%、3.07%，具有良好的重復(fù)性。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的肉蓯蓉樣品0.3 g，共6份，依次加入適量對(duì)照品溶液(松果菊苷0.95 mg/mL，肉蓯蓉苷A 0.56 mg/mL，管花苷A 0.30 mg/mL，毛蕊花糖苷0.31 mg/mL)，并以50%甲醇補(bǔ)足至50 mL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計(jì)算平均回收率。結(jié)果松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷平均加樣回收率分別為101.14%、102.14%、96.91%、97.22%，RSD分別為0.89%、1.49%、2.99%、1.15%，加樣回收率良好。

3 相對(duì)校正因子計(jì)算及耐用性考察

3.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 準(zhǔn)確吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5、10、15、20、30 μL，以松果菊苷為內(nèi)標(biāo)(s)，計(jì)算肉蓯蓉苷A(a)、管花苷A(b)、毛蕊花糖苷(c)的相對(duì)校正因子fsa、fsb、fsc，結(jié)果見表1。

fs/i=fs/fi=As×Ci/(Ai×Cs)。

As、Cs分別為內(nèi)標(biāo)峰面積和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Ai、Ci分別為待測成分的峰面積和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表2 肉蓯蓉3種苯乙醇苷類成分相對(duì)校正因子

3.2 待測組分色譜峰定位 以松果菊苷(內(nèi)標(biāo))為基準(zhǔn)峰，計(jì)算肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的相對(duì)保留值、保留時(shí)間差，其在色譜圖中的位置見表3。

3.3 考察不同色譜柱對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間的影響 吸取“2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，考察不同色譜柱(Symmetry C18、

表3 肉蓯蓉3種苯乙醇苷類成分相對(duì)保留值和保留時(shí)間差

X-Peonyx AQ-C18、Eclipse Plus C18)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果相對(duì)校正因子的RSD值均小于5%，表明使用不同色譜柱均具有良好的重現(xiàn)性。見表4。

表4 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

3.4 考察不同柱溫、流速對(duì)校正因子的影響 吸取“2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，分別考察0.9、1.0、1.1 mL/min 3個(gè)體積流量，25、30、35 ℃ 3個(gè)柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響。相對(duì)校正因子不受體積流量和柱溫的變化而變化。見表5。

表5 不同因素對(duì)相對(duì)校正因子的影響

4 樣品含有量測定

采用外標(biāo)法和一測多評(píng)法分別測定6批肉蓯蓉藥材中4種苯乙醇成分(松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷)的含量，2種方法的結(jié)果相對(duì)誤差較小，說明一測多評(píng)方法準(zhǔn)確可靠；四翅濱藜寄生肉蓯蓉苯乙醇苷成分含量高于梭梭寄生肉蓯蓉。見表6。

表6 肉蓯蓉含量測定結(jié)果(mg/g)

5 討論

中藥成分復(fù)雜，單一成分不能反映藥物質(zhì)量，因此，中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)應(yīng)選擇多組分。張永等[23]應(yīng)用QAMS同時(shí)測定肉桂藥材中4種成分的含量，結(jié)果表明QAMS可行可用。侯文文等[24]應(yīng)用QAMS同時(shí)測定出何首烏藥材中4種蒽醌類成分，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)測定并分析何首烏藥材中的結(jié)合蒽醌和游離蒽醌，方法具有良好的可行性。木盼盼等[25]同時(shí)測定了葛根中9個(gè)異黃酮成分的含量，其結(jié)果與外標(biāo)法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。QAMS的提出，解決了中藥成分、復(fù)雜活性成分多難以測定的問題，大大加速了中藥成分檢測的發(fā)展，同時(shí)測定了中藥中的多指標(biāo)成分，提供了一種更好的成分質(zhì)量分析方法。但是目前QAMS僅應(yīng)用于單味藥，而在復(fù)雜的復(fù)方制劑中的應(yīng)用較為局限，今后，應(yīng)該大力開發(fā)和研究QAMS相關(guān)技術(shù)，有利于加快中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展，使中藥更好地走向國際化。

結(jié)果表明，肉蓯蓉的主要活性成分是苯乙醇苷類，包括松果菊苷、毛蕊花糖苷等，而肉蓯蓉苷A和管花苷A價(jià)格昂貴，松果菊苷對(duì)照品來源相對(duì)豐富，價(jià)格便宜，易得，化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。因此，選擇其作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行一測多評(píng)試驗(yàn)，并測定了松果菊苷的含量，從而實(shí)現(xiàn)肉蓯蓉多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制。

本研究通過HPLC建立了一測多評(píng)法測定肉蓯蓉中松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷含量的測定方法，并與外標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，結(jié)果2種方法的差異不明顯，表明建立的相對(duì)校正因子準(zhǔn)確可靠，方法簡便、靈敏度高，可用于肉蓯蓉中4種苯乙醇的含量測定。不同寄主植物肉蓯蓉中4種苯乙醇含量以四翅濱藜寄生肉蓯蓉含量較高，為肉蓯蓉的質(zhì)量控制提供了新的理論依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短缺情況下多指標(biāo)組分的含量測定。