牛華鋒，張成東，楊雪嬌，任戰(zhàn)軍，王淑輝，趙永攀

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西楊 凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 7121000；3.陜西畜牧產(chǎn)業(yè)試驗(yàn)示范中心，陜西 涇陽(yáng) 713702)

兔肉被譽(yù)為“保健肉”、“美容肉”、“益智肉”，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值愈來(lái)愈被消費(fèi)者認(rèn)可，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求日益增長(zhǎng)。培育生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮嫩、屠宰率高的肉兔品種，一直是家兔育種工作關(guān)注的熱點(diǎn)。肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostation，MSTN)，又稱為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子8(growth differentiation factor 8,GDF-8)，屬于TGF-β超家族[1]，能夠負(fù)調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)，抑制肌肉的生長(zhǎng)[2]。大量的研究表明，MSTN基因在哺乳動(dòng)物中高度保守，MSTN基因突變或敲除后能產(chǎn)生“雙肌癥狀”[3～7]，過(guò)表達(dá)則會(huì)減少肌肉生長(zhǎng)，是影響畜禽產(chǎn)肉性狀狀的主要功能基因之一。分子輔助育種法對(duì)于家兔育種至關(guān)重要，SNP(single nucleotide polymorphism ,SNP)是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列的多態(tài)性。喬西波等[8](2010)研究了9個(gè)純系肉兔及其37個(gè)雜交組合的MSTN基因，發(fā)現(xiàn)MSTN基因重要SNP位點(diǎn)突變有利于家兔體軀發(fā)育。張柯等[9]研究發(fā)現(xiàn)兔MSTN基因外顯子1和外顯子2的2個(gè)SNP位點(diǎn)(分別是194bP，445bP)，2個(gè)位點(diǎn)堿基突變顯著影響兔135日齡全凈膛重、屠宰率和熟肉率。筆者研究比較分析伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因重要SNP位點(diǎn)的基因型及分布情況，探索其對(duì)家兔產(chǎn)肉性狀有益的分子標(biāo)記，以期為家兔分子選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選取陜西天鑫兔業(yè)有限公司的伊拉肉兔和美系獺兔各70只(公母各35只)。心臟采血10 mL，裝入已添加2.5 mL滅菌ACD抗凝劑的離心管中，用冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。采用酚-氯仿法提取基因組總DNA，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考http://asia.ensembl.org/ 基因庫(kù)中兔子MSTN基因外顯子Ⅰ、外顯子Ⅱ和外顯子Ⅲ序列，并用Primer5設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為577bp、749bp和668bp左右。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 MSTN基因外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的引物序列信息

1.2.2 基因片段的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增總體積為50μL，試驗(yàn)所用2×Taq Master Mix來(lái)自康威世紀(jì)，由Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、藍(lán)色染料以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成，引物濃度為10pmol/μL，DNA模板濃度為100 ng/μL，PCR各物質(zhì)添加量及所用擴(kuò)增程序如表2。

表2 PCR擴(kuò)增體系及其擴(kuò)增程序

擴(kuò)增產(chǎn)物(取5μL)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 各樣本均取30μL擴(kuò)增產(chǎn)物和20μL上下游引物，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化、測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用MegAlign，Chromas Application 2.3.0.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析，通過(guò)序列比對(duì)和序列峰值校正，篩選出SNP位點(diǎn)，判斷出突變位點(diǎn)的基因型。用PopGene32軟件進(jìn)行hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)，以及基因型頻率、等位基因頻率、雜合度和有效等位基因數(shù)等遺傳參數(shù)的計(jì)算。用PIC計(jì)算軟件計(jì)算出多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MSTN外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好，其片段長(zhǎng)度分別為668bp、749bp和577bp，片段長(zhǎng)度符合預(yù)期，適合進(jìn)行測(cè)序。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1、圖2和圖3。

圖1 外顯子ⅠPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

圖2 外顯子ⅡPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

圖3 外顯子ⅢPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

將樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化、測(cè)序。結(jié)果顯示在70只伊拉肉兔和70只美系獺兔MSTN基因中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，分別位于MSTN基因序列外顯子Ⅰ的111bp處，內(nèi)含子Ⅰ的234bp處，外顯子Ⅱ的338bp處和內(nèi)含子Ⅱ的34bp處。外顯子Ⅲ中則未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)。

2.2.1 MSTN外顯子Ⅰ和內(nèi)含子Ⅰ的測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果顯示，MSTN外顯子Ⅰ的SNP位于111bp處，發(fā)生C-T轉(zhuǎn)換，共發(fā)現(xiàn)CC基因型、CT基因型和TT基因型3種基因型(見(jiàn)圖4)。

圖4 MSTN外顯子Ⅰ的3種基因型

內(nèi)含子Ⅰ在的234bp發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，發(fā)生G-A轉(zhuǎn)換，共發(fā)現(xiàn)GG基因型、AA基因型和AG基因型3種基因型(見(jiàn)圖5)。

2.2.2 MSTN外顯子Ⅱ和內(nèi)含子Ⅱ的測(cè)序結(jié)果 MSTN外顯子Ⅱ在338bp處發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP，發(fā)生T-A顛換，共發(fā)現(xiàn)TT基因型、AT基因型和AA基因型3種基因型(見(jiàn)圖6)。

測(cè)序結(jié)果顯示，MSTN內(nèi)含子Ⅱ在34bp處發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP，發(fā)生C-T轉(zhuǎn)換，共發(fā)現(xiàn)型CC基因型、TT基因型和CT基因型3種基因(如圖7)。

圖5 MSTN內(nèi)含子Ⅰ的3種基因型

圖6 MSTN內(nèi)含子Ⅱ的3種基因型

圖7 MSTN內(nèi)含子Ⅲ的3種基因型

2.3 遺傳多態(tài)性分析

2.3.1 MSTN基因4個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率分析 筆者研究對(duì)伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了基因型頻率、等位基因頻率分別進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表3～表6。

表3 MSTN外顯子Ⅰ的111bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表3可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因外顯子Ⅰ的111bp處CC基因型頻率顯著高于CT基因型和TT基因型；C等位基因頻率明顯高于T等位基因頻率，是兩兔群體的優(yōu)勢(shì)基因。通過(guò)Chi-square適合性檢驗(yàn)，該位點(diǎn)各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體中不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，而在美系獺兔群體中則符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表4 內(nèi)含子Ⅰ的234bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表4可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因中內(nèi)含子Ⅰ的234bp處雜合子GA基因型頻率在中最高；G等位基因在伊拉肉兔群體中為優(yōu)勢(shì)基因，占0.55；A等位基因在美系獺兔群體為優(yōu)勢(shì)基因，占0.5143。通過(guò)Chi-square適合性檢驗(yàn)，該位點(diǎn)各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和美系獺兔群體中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表5 外顯子Ⅱ的338bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表5可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因中外顯子Ⅱ的338 bp處雜合子TA基因型頻率最高；T等位基因頻率均略高于A等位基因頻率，為優(yōu)勢(shì)等位基因。通過(guò)Chi-square適合性檢驗(yàn)，該位點(diǎn)各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和在美系獺兔群體中都符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表6 內(nèi)含子Ⅱ的34 bp處基因型頻率和等位基因頻率

由表6可知，伊拉肉兔和美系獺兔的MSTN基因內(nèi)含子Ⅱ的34 bp處雜合子CT基因型頻率最高；T等位基因頻率均略高于C等位基因頻率，為優(yōu)勢(shì)等位基因。通過(guò)Chi-square適合性檢驗(yàn)，該位點(diǎn)各基因型頻率分布在伊拉肉兔群體和在美系獺兔群體中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

2.3.2 MSTN基因4個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳參數(shù)分析 本研究分析了伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因4個(gè)SNP位點(diǎn)遺傳參數(shù)，將MSTN基因外顯子Ⅰ的SNP位點(diǎn)記作A，內(nèi)含子Ⅰ的SNP位點(diǎn)記作B，外顯子Ⅱ的SNP位點(diǎn)記作C，內(nèi)含子Ⅱ的SNP位點(diǎn)記作D。由表7可以看出，伊拉肉兔中A位點(diǎn)的雜合度(0.171 4)和期望雜合度(0.286 1)最低，A位點(diǎn)有效等位基因數(shù)在這兩個(gè)家兔品種中相對(duì)較低(分別為1.396 8和1.618 2)，其他三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)都在1.9以上。在伊拉肉兔和美系獺兔群體MSTN的4個(gè)SNP位點(diǎn)(A、B、C、D)均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25

表7 伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因各多態(tài)位點(diǎn)的遺傳參數(shù)

3 討論與結(jié)論

MSTN基因參與骨骼肌的分化，MSTN基因突變的動(dòng)物骨骼肌肌群分布廣泛且肉質(zhì)優(yōu)良[10]。筆者研究在70只伊拉肉兔和70只美系獺兔MSTN基因中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，其中外顯子Ⅰ和外顯子Ⅱ中的多態(tài)位點(diǎn)，與張柯等[9]的研究結(jié)果一致；外顯子Ⅲ未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，與喬西波等[8]的研究結(jié)果一致；內(nèi)含子Ⅰ和內(nèi)含子Ⅱ的多態(tài)位點(diǎn)在家兔中首次發(fā)現(xiàn)，與其家兔的生長(zhǎng)發(fā)育是否有關(guān)還需要進(jìn)一步的研究。

在伊拉肉兔群體中外顯子Ⅰ的SNP位，三種基因型頻率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，其CC基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)基因，這可能是由于C等位基因影響家兔肌肉生長(zhǎng)。俞成浩等[10]研究發(fā)現(xiàn)在MSTN基因擴(kuò)增片段中發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，27只齊興肉兔和伊拉肉兔均為CC型。結(jié)合已有報(bào)道，推斷伊拉肉兔較美系獺兔生長(zhǎng)速度快或許與此有關(guān)，即可認(rèn)為伊拉肉兔在人工選育的過(guò)程中突出肉用性能的選育，強(qiáng)化了C等位基因的選擇，導(dǎo)致了該位點(diǎn)不符合hardy-weinberg平衡。

筆者研究在伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因除了伊拉肉兔群體中外顯子Ⅰ的SNP位點(diǎn)各基因型頻率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，內(nèi)含子Ⅰ、外顯子Ⅱ和內(nèi)含子Ⅱ的3個(gè)SNP位點(diǎn)各基因型頻率均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。至于MSTN基因在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不明確，但相關(guān)的研究表明，MSTN基因影響畜禽生長(zhǎng)發(fā)育與肌肉生長(zhǎng)。趙振華等[11]發(fā)現(xiàn)MSTN基因突變顯著影響優(yōu)質(zhì)雞肌肉生長(zhǎng)，是雞肌肉生長(zhǎng)主效基因之一。張柯等[9]研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因SNP位點(diǎn)顯著影響了6個(gè)肉兔品種135日齡全凈膛重、屠宰率等。結(jié)合已有的研究，這3個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率分布相似，是由于伊拉肉兔和美系獺兔在品種選育過(guò)程對(duì)生長(zhǎng)速度、屠宰率等肉用指標(biāo)都作為重用經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。

筆者研究表明，伊拉肉兔和美系獺兔MSTN基因各多態(tài)位點(diǎn)的遺傳參數(shù)中，遺傳信息含量較高(0.25