劉衛(wèi)剛，楊少清,2，鈕曉敏，楊直堂，劉志軍,2*,王 宇，蘇偉超，何維紅，陸 云

(1.河北工程大學附屬醫(yī)院，河北 邯鄲056002；2.河北工程大學，河北 邯鄲056002； 3.秦皇島市疾病控制中心；4.武安市第一人民醫(yī)院)

肥胖是一種由多因素引起的慢性代謝性疾病，已成為全球性的重要公共衛(wèi)生問題，超重和肥胖常與高脂血癥、糖尿病、高血壓等疾病在同一個體中聚集，進而導致心腦血管疾病發(fā)生或加重，稱為“代謝綜合征(MS)”[1-2]。PYY(peptide YY)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種由消化道遠端黏膜L細胞分泌的食欲調(diào)節(jié)激素，主要調(diào)節(jié)食物的攝入，與肥胖的發(fā)生密切相關[3]，為了解我國漢族人群PYY受體基因rs1047214位點多態(tài)性與肥胖相關性，對華中地區(qū)成年漢族人群進行了相關研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇華中地區(qū)成年漢族肥胖病例400名，同時選取生活在同一地區(qū)按性別、年齡(±3)為匹配條件的非肥胖400名作為對照。肥胖判定標準[4]：體質(zhì)量過低：BMI<18.5 kg/m2，體質(zhì)量正常：18.5 kg/m2

1.2 PYY基因rs2880412 A/C多態(tài)性檢測從Genebank 下載PYY受體基因rs1047214位點的基因序列，采用PPrimer 5.0進行該位點引物設計，上游5′-CTTCCTGATTATTGGCTTGGC-3′，下游5′-CTGATGGTAGTGGTCATTTGC-3′，PCR擴增條件：94℃條件下預變性5 min，94℃條件下變形30 s，60℃條件下退火40 s，72℃條件下延伸30 s，30個循環(huán)，72℃條件下延伸8 min，4℃保存。反應體系是15 μl，包括10 μl PCR產(chǎn)物、0.5 μl酶和1 μl 10 × Buffer的混合產(chǎn)物，最后加入脫離子水補充體積至15 μl，置37℃水浴8-16 h。酶切過程：PCR產(chǎn)物中加入常規(guī)限制性內(nèi)切酶Nci1(bcn1)，37℃水浴過夜，在80 V電壓下、4.0%的瓊脂糖凝膠中進行電泳實驗60 min，經(jīng)酶切反應后基因型(T/T)片段為66 bp和223 bp，雜合基因(T/C)片段：66 bp、27 bp、196 bp和223 bp；純合子基因(C/C)片段：66 bp、27 bp和196 bp，由于本實驗采用瓊脂糖凝膠電泳，靈敏度較低，故在凝膠中只能識別部分片段T/T：223 bp；T/C：196 bp和223 bp；C/C：196 bp。

1.3 DNA測序為保證測序結(jié)果PCR-RFLP分析的正確性，隨機抽取研究對象10%樣本進行PCR產(chǎn)物基因型測定，符合率100%，對應的PCR序列為：CTTCCTGATTATTGGCTTGGCCTGGGGC-ATCAGTGCCCTGCTGGCAAGTCCCCTGGCCA-TCTTCCGGGAGTATTCGCTGATTGAGATCA-TYCCGGACTTTGAGATTGTGGCCTGTACTG-AAAAGTGGCCTGGCGAGGAGAAGAGCATCT-ATGGCACTGTCTATAGTCTTTCTTCCTTGT-TGATCTTGTATGTTTTGCCTCTGGGCATTA-TATCATTTTCCTACACTCGCATTTGGAGTA-AATTGAAGAACCATGTCAGTCCTGGAGCTGCAAATGACCACTACCATCAG。

1.4 統(tǒng)計學處理采用EpiData軟件進行數(shù)據(jù)雙遍錄入，保證數(shù)據(jù)一致性。采用SPSS18.0軟件進行相關統(tǒng)計分析，其中計量資料以表示，進行t檢驗，計數(shù)資料采用百分數(shù)(%)表示，進行χ2檢驗，基因型分布的Hardy-Weinberg平衡差異檢驗采用haploview軟件分析。采用logistic回歸分析調(diào)整混雜因素分析不同模型基因位點多態(tài)性與肥胖的關聯(lián)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本情況肥胖組和對照組的基因型頻率均符合哈溫平衡(肥胖組：χ2=0.141,P=0.702；對照組：χ2=1.623,P=0.201)；肥胖組和對照組的年齡分別為(51.37±12.55)歲和(50.22±13.24)歲，兩組均值差異無統(tǒng)計學意義(t=1.266，P=0.206)，通過對兩組婚姻狀況、文化程度、年人均收入指標比較，肥胖組和對照組差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，說明研究人群具有較好的人群代表性。見表1。

表1 研究人群的基本情況

2.2 PYY受體基因rs1047214位點等位基因和基因型頻率分布

2.2.1Rs1047214位點等位基因(T/C)頻率分布 肥胖組中等位基因T、C的頻率分布為：82.75%和17.25%，對照組中等位基因T、C的頻率分布為：84.50%和15.50%，該等位基因在兩組中的頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.895，P=0.344)，較等位基因T，等位基因C與肥胖的發(fā)生無關聯(lián)(OR=1.14，95%CI:0.87-1.48)。

2.2.2Rs1047214位點基因型(TT/TC/CC)頻率分布 肥胖組中基因型TT、TC和CC的頻率分布為70.25%、25.00%和4.75%，對照組中基因型TT、TC和CC的頻率分布為70.75%、27.50%和1.75%，三種基因型在兩組中的分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.022,P=0.049)。較基因型TT，基因型CC頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=5.378,P=0.020)，調(diào)整混雜因素體力活動后，基因型CC的OR(95%CI)為2.73(1.13-6.61)，見表2,圖1。

表2 肥胖組和對照組rs1047214位點等位基因和基因型頻率分布[n(%)]

圖1 PYY受體基因rs1047214位點的基因型電泳圖

2.3 PYY受體基因rs1047214位點多態(tài)性與肥胖的關聯(lián)性

以等位基因C為突變基因，調(diào)整部分混雜因素(體力活動、體重、TC、TG、HDL-C、SBP、DBP)，采用相加、顯性和隱性模型進行l(wèi)ogistic回歸分析(肥胖=1，非肥胖=0)。三種模型中，隱形模型顯示基因型CC與肥胖的發(fā)生存在關聯(lián)(OR=2.80，95%CI:1.16-6.74)，見表3，圖2。

表3 Rs1047214位點多態(tài)性與肥胖的關聯(lián)性[n(%)]

圖2 PYY受體基因rs1047214位點基因多態(tài)性測序圖譜

2.4 不同基因型間生化指標比較

不同基因型間生化指標對比，其中基因型TT和TC+TT間血糖指標均值在兩組中的分布差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；基因型TC+TT中膽固醇指標均值在兩組中的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；4種基因型間TG指標均值在兩組中的分布差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；4種基因型間LDL-C指標均值在兩組中的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；四種基因型間HDL-C指標均值在兩組中的分布差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表4。

表4 不同基因型間各生化指標比較

3 討論

目前，肥胖的發(fā)病率不僅在以高熱飲食為主的發(fā)達國家保持著上升趨勢，在發(fā)展中國家也成為影響國民健康的焦點，肥胖對患者的身心均造成一定程度的傷害，還可能導致生活質(zhì)量下降繼而加重經(jīng)濟負擔[5-7]。本研究的基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的選擇主要是采用參考文獻法和標簽SNP法，選擇其他人群中與疾病存在陽性關聯(lián)的PYY受體rs1047214位點，有研究顯示rs1047214位點多態(tài)性突變率與男性兒童青少年肥胖的發(fā)生存在關聯(lián)[8]，本研究針對成年(≥18周歲)人群進行該位點的病例對照研究，從遺傳學角度探討肥胖發(fā)生的可能機制[9]。

本研究抽取華中地區(qū)成年漢族人群進行研究，結(jié)果顯示，肥胖組的血糖、TC、TG、HDL-C、SBP、DBP等指標均顯著高于對照組，但LDL-C在兩組中的頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示LDL-C指標變化不受肥胖發(fā)生的影響[10]。由結(jié)果可以得出，肥胖的發(fā)生對血糖、血脂異常影響較大，進而對機體產(chǎn)生不利影響。本研究的rs1047214位點等位基因T、C在肥胖組合對照組中的頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但病例組中基因型CC的頻率4.75%，顯著高于對照組的1.75%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示基因型CC與肥胖的發(fā)生存在關聯(lián)，本研究進一步調(diào)整混雜因素：體力活動、TC、TG等指標采用相加、顯性和隱形模型進行回歸分析[11]，提示基因型CC與肥胖的發(fā)生仍存在關聯(lián)(OR=2.80，95%CI:1.16-6.74)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，肥胖組的TC+CC、TC、TT、TC+TT基因型的TG指標均值明顯高于對照組(P均<0.05)，而肥胖組的TC+CC、TC、TT、TC+TT基因型的HDL-C指標均值明顯低于對照組(P均<0.05)，提示說明rs1047214位點4種基因型與高TG、低HDL-C的發(fā)生可能存在關聯(lián)；肥胖組的TT、TC+TT基因型的血糖指標均值明顯高于對照組(P均<0.05)，提示rs1047214位點基因型TT、TC+TT與血糖升高可能存在關聯(lián)；肥胖組的TC+TT基因型的膽固醇(TC)明顯高于對照組(P<0.05)，提示rs1047214位點基因型TC+TT與膽固醇(TC)升高可能存在關聯(lián)。本研究僅僅從遺傳角度考慮四種基因型與相關生化指標是否存在關聯(lián)，有一定的局限性，事實上肥胖的發(fā)生不僅受環(huán)境因素影響，而且受多種基因共同影響[12-13]，從多角度分析更為可靠。

本研究僅僅從某一位點進行分析，未考慮環(huán)境因素及基因間的聯(lián)合作用，且樣本量較小，仍需要提高樣本量進一步研究，驗證結(jié)果的可靠性?？傊逝质怯啥嘁蛩匾鸬穆源x性疾病[14]，希望本研究能夠為肥胖的發(fā)生及預防控制提供科學依據(jù)，找到更好的治療途徑或方案[15]。

作者簡介：劉衛(wèi)剛(1985-)，男，碩士研究生，高級統(tǒng)計師，研究方向：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學。