何亞偉 陳皖京 于 剛 程云生 汪 泳

肥胖是一種由于各種環(huán)境和生理因素改變使得機體內(nèi)出現(xiàn)能量代謝不平衡從而導(dǎo)致脂肪異常堆積的病理狀態(tài)，已逐漸成為我國醫(yī)療體系所面臨的重大挑戰(zhàn)。目前認(rèn)為，糖尿病、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)等疾病的發(fā)生與肥胖都有著密不可分的聯(lián)系。其中NAFLD已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)其他肝臟相關(guān)疾病的主要原因，并可能成為終末期肝病的主要誘發(fā)因素[1]。相關(guān)研究[2]顯示，腸道微生物群落參與了NAFLD患者肝臟脂肪變性和纖維化的發(fā)生與發(fā)展，細菌源性產(chǎn)物進入門脈循環(huán)可以誘導(dǎo)先天性免疫的觸發(fā)，導(dǎo)致大量炎癥因子釋放，促進肝臟炎性病變。目前認(rèn)為，腸-肝軸(腸道、微生物群和肝臟通過門靜脈循環(huán)相互交流的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò))在肝臟疾病的發(fā)展及預(yù)后中可能具有一定的作用。然而在肥胖患者中，長期不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)以及體內(nèi)脂肪異常堆積也是極為常見的問題。因此研究減重手術(shù)對肥胖患者腸道菌群、NAFLD的影響，以及腸-肝軸在其中調(diào)節(jié)作用的機制具有重要意義。減重代謝手術(shù)是目前國內(nèi)外公認(rèn)的可以迅速、有效、長期治愈病態(tài)性肥胖的方法。Yeo等[3]的研究表明，減肥手術(shù)可以減輕體質(zhì)量的同時改善NAFLD纖維化。另有研究[4]發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可以改善肝臟脂肪變性，其機制可能是通過下調(diào)腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)等炎性介質(zhì)的表達來實現(xiàn)的。但目前減重手術(shù)對肥胖患者腸道菌群和NAFLD的影響、兩者的相互關(guān)系以及腸-肝軸的調(diào)節(jié)機制尚不完全清楚。因此，本研究比較了腹腔鏡袖狀胃切除術(shù)前后肥胖患者脂肪肝、血清炎癥因子以及腸道菌群的變化情況，以探究減肥手術(shù)引起的腸道菌群的變化對肥胖患者NALFD改善的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年7月至2021年1月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸與減重代謝外科就診并接受LSG治療的30例肥胖合并NAFLD患者為研究對象，其中男性11例，女性19例，年齡18～49歲，平均 (31.60±7.66)歲，身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)33.21～62.10 kg/m2，平均(43.90±22.98)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：①BMI≥32.5 kg/m2；②年齡為16～65歲；③根據(jù)2001年中華肝臟病學(xué)會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的非酒精性脂肪診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，患者經(jīng)過腹部超聲檢查符合NAFLD診斷;④排除手術(shù)禁忌后均接受統(tǒng)一減重術(shù)式——腹腔鏡袖狀胃切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前存在長期大量飲酒史或正處于急慢性病毒性肝炎狀態(tài)或有嚴(yán)重的其他肝臟疾??； ②術(shù)前常規(guī)檢查提示存在感染和/或嚴(yán)重疾病不能耐受手術(shù)；③臨床資料不完整。剔除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后合并有手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥。本研究過程均已告知患者，并取得患者本人或其委托人的書面同意，且獲得安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)[倫理審批文件號：YX2021-017(F1)]。

1.2 研究方法 所有患者入院后完善常規(guī)檢查并留取血液、糞便標(biāo)本，排除明顯手術(shù)禁忌癥后予以行統(tǒng)一減肥術(shù)式—腹腔鏡袖狀胃切除術(shù)，術(shù)后3個月完善患者隨訪資料并再次留取血液及糞便標(biāo)本，對比分析術(shù)前和術(shù)后3個月的臨床資料，進行血清炎癥因子與肝臟評分的相關(guān)性分析。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 體質(zhì)量參數(shù) 分別于術(shù)前和術(shù)后3個月于我院門診由我科病案管理師記錄患者身高、體質(zhì)量、腰圍，并計算BMI。

1.3.2 實驗室指標(biāo) 分別于術(shù)前及術(shù)后第3個月清晨空腹?fàn)顟B(tài)抽取患者靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，以4 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液保存在-80℃冰箱待用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中TNF-a、白介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)、IL-4水平。采用化學(xué)發(fā)光免疫法分析三酰甘油(triacylglycerol, TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-gamma-glutamyltransferase, γ-GGT)水平。采用流式細胞術(shù)測定血小板(platelet, PLT)含量。

1.3.3 糞便菌群16S核糖體RNA基因測序 16S rRNA擴增子測序由Genesky生物技術(shù)公司(上海，中國)完成。使用FastDNA?SPIN試劑盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)提取糞便總DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，使用Nanodrop 2000和Qubit3.0分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)檢測基因組DNA的濃度和純度。用以下引物擴增16S rRNA基因V3-V4高變區(qū):341F (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’); 805R (5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)。測序使用Illumina NovaSeq 6000測序儀(San Diego, California, USA)。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)前后人體測量學(xué)及一般實驗室指標(biāo)變化 手術(shù)后3個月隨訪資料顯示，患者的BMI、體質(zhì)量、腰圍、AST、ALT、GGT、TG、TC等在術(shù)后3個月均降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PLT手術(shù)前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 術(shù)前和術(shù)后3個月體質(zhì)量參數(shù)及一般實驗室指標(biāo)

2.2 LSG術(shù)前后炎癥因子水平、FLI、FIB-4評分比較 LSG術(shù)后3個月，患者血清IL-4較術(shù)前上升，而 IL-1β和TNF-a均較術(shù)前下降，F(xiàn)LI和FIB-4評分低于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 術(shù)前和術(shù)后3個月炎癥因子與肝臟評分

2.3 LSG術(shù)前后腸道菌群的變化及與炎癥因子及其相關(guān)性 術(shù)后3個月腸道菌群分析顯示擬桿菌[(0.536±0.115)(術(shù)前)比(0.577±0.072)(術(shù)后),P=0.360]和梭桿菌[(0.007±0.013)(術(shù)前)比(0.034±0.045)(術(shù)后),P=0.046]數(shù)量增加，厚壁菌[(0.118±0.089)(術(shù)前)比(0.051±0.033)(術(shù)后),P=0.036]、變形菌[(0.078±0.089)(術(shù)前)比(0.065±0.087)(術(shù)后),P=0.757]數(shù)量減少(圖1A),患者腸道菌群alpha多樣性增加[(3.62±0.46)(術(shù)前) 比(3.92±0.52)(術(shù)后),P=0.122]。見圖1B。術(shù)前細胞因子與微生物的Spearman相關(guān)性分析顯示，梭桿菌與TNF-a(r=-0.203,P=0.031)，IL-1β(r=-0.329,P=0.023)呈負(fù)相關(guān)，β-變形菌與IL-1β(r=0.065,P=0.798)呈正相關(guān)，與IL-4(r=-0.128,P=0.613)呈負(fù)相關(guān)，厚壁菌與TNF-a(r=-0.315,P=0.033)呈負(fù)相關(guān)，與IL-1β(r=0.459,P=0.046)呈正相關(guān)(圖1 C)。

注：A，手術(shù)前后部分腸道菌群的變化趨勢；B，術(shù)前和術(shù)后3個月腸道菌群Alpha多樣性的變化；C， 細胞因子與菌群的Spearman相關(guān)性分析。

2.4 術(shù)前術(shù)后炎癥因子與FLI、FIB-4評分的相關(guān)性 術(shù)前相關(guān)性分析顯示FIB-4與IL-1β(r=0.373，P=0.043)、TNF-a(r=0.435，P=0.016)呈正相關(guān)，與IL-4呈負(fù)相關(guān)(r= -0.410，P=0.024)；FLI與IL-1β(r=0.402，P=0.028)、TNF-a(r=0.391，P=0.033)呈正相關(guān)，與IL-4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.523，P=0.003)。見圖2。術(shù)后FIB-4與IL-1β(r=0.382，P=0.037)、TNF-a(r= 0.413，P=0.023)呈正相關(guān)，與IL-4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.425，P=0.019)；FLI與IL-1β(r=0.362，P=0.049)、TNF-a(r= 0.363，P=0.048)呈正相關(guān)，與IL-4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.426，P=0.019)。見圖3。

圖2 術(shù)前細胞因子與肝臟評分的相關(guān)性分析

圖3 術(shù)后細胞因子與肝臟評分的相關(guān)性分析

3 討論

在全球范圍內(nèi)，肥胖和超重的人數(shù)呈現(xiàn)出急劇增加的趨勢，其導(dǎo)致的心血管疾病、NAFLD等的風(fēng)險也隨之增加。其中NAFLD已成為世界上最常見的慢性肝病之一，它被定義為一系列由肝臟脂肪變性引發(fā)的肝臟病理變化，并可能會發(fā)展為肝臟壞死性炎癥和纖維化[8]。肥胖患者由于飲食習(xí)慣的改變多有腸道菌群失調(diào)表現(xiàn)，腸道菌群的紊亂可導(dǎo)致腸道屏障功能受損，而腸道菌群是其與宿主相互作用的統(tǒng)一體，因此菌群紊亂能夠?qū)е聶C體生態(tài)失調(diào)。雖然腸道菌群對人體的作用已被證實，但在NAFLD中，菌群與宿主相互作用的機制并不完全清楚，因此本研究的目的是探索LSG手術(shù)引起的腸道菌群的變化對肥胖患者NALFD改善的可能機制。

腸道菌群主要由4個門組成:厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，包括1 000余種微生物，其中約90%的菌群屬于厚壁菌門和擬桿菌門，厚壁菌門/擬桿菌門的比值被認(rèn)為是影響腸道菌群紊亂的重要因素。研究[9]表明，NAFLD患者的腸道微生物群有顯著的改變，這與本研究結(jié)果相同。同時，紊亂的腸道菌群可以通過增加腸道通透性和激活免疫反應(yīng)來促進NAFLD的發(fā)病和進展[10]。有研究[11]認(rèn)為，許多效應(yīng)是由共生細菌產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的，這些代謝產(chǎn)物能夠參與調(diào)節(jié)NAFLD的生理和病理過程。腸道環(huán)境的紊亂和菌群的失衡程度與脂肪肝的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]，與本研究一致，即NAFLD患者微生物群落的紊亂與炎癥因子具有顯著相關(guān)性，而且炎癥因子與FLI、FIB-4評分呈現(xiàn)顯著相關(guān)。此外腸道菌群的改變和腸道通透性的增加導(dǎo)致了肝臟與腸源性細菌接觸機會的增加，其釋放的大量促炎因子既可以參與脂質(zhì)調(diào)節(jié)和NAFLD的發(fā)病，又可以通過門靜脈迅速轉(zhuǎn)移到肝臟，誘導(dǎo)肝臟炎癥和纖維化，促進相關(guān)腸-肝軸的改變，加速NAFLD的發(fā)展[13]。Ruiz等[14]的研究顯示，高脂飲食喂養(yǎng)再進行抗脂肪處理的大鼠血清促炎因子如IL-1β、 TNF-α水平降低，而抗炎因子IL-4水平升高，這與本研究中患者袖狀胃術(shù)后炎癥因子變化一致，同時其對該組大鼠肝臟解剖發(fā)現(xiàn)脂肪沉積較單純高脂喂養(yǎng)的大鼠明顯減輕，這與本研究對肝臟相關(guān)評分的變化相同。此外，Das等[15]的研究得出輕度纖維化和中度纖維化患者血清IL-1β、TNF-a、IL-4之間差異明顯，這說明這些炎癥因子與肝臟纖維可能存在一定程度的相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致。相關(guān)研究[16]表明， IL-1β, TNF-a等炎性因子的過表達能夠激活肝臟星狀細胞以及其它相關(guān)細胞的活動，如Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原細胞，從而增強細胞外基質(zhì)的表達，啟動肝臟纖維化并加速纖維形成，而IL-4則可以對多種肝損害起到保護作用。研究[17]表明，IL-4可以激活M2型巨噬細胞，參與組織重塑和免疫調(diào)節(jié)進程，從而改善肝臟纖維化，而IL-1β和TNF-a等又可以上調(diào)M1巨噬細胞的表達，導(dǎo)致M1/M2極化，從而誘導(dǎo)肝臟脂肪堆積及炎性改變，該過程可能與CaMKK β/ AMPK通路介導(dǎo)的M1/M2去極化被抑制有關(guān)。IL-1β和TNF-a也可以通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ Thr235來上調(diào)11β-HSD1的表達，而 11β-HSD1可以與下游肝臟等多種受體結(jié)合影響脂質(zhì)代謝，促進高血脂、脂肪肝等的發(fā)生[18]。

本研究中，LSG可改善肥胖患者腸道菌群豐度及分布，同時也可以改善NAFLD，這可能與體內(nèi)腸道菌群的改變介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)水平的變化有關(guān)，因此對于NAFLD患者可適當(dāng)予以益生菌的補充來改善腸道菌群，從而調(diào)節(jié)炎癥水平來改善肝脂肪變性和纖維化的發(fā)展。然而本研究存在一定局限性，一是隨訪時間較短，無法對術(shù)后患者菌群改變的長期效應(yīng)以及其對NAFLD改善的長期效果進行評估；二是樣本量小，后續(xù)有待改進；三是未能對腸道菌群影響NAFLD發(fā)生發(fā)展的具體生理病理機制進行揭示。

綜上所述，LSG可以改善肥胖人群腸道菌群分布及豐度，降低了炎癥因子水平，改善了炎癥因子介導(dǎo)的肝臟相關(guān)損害，這對病態(tài)性肥胖患者的NAFLD的治療具有一定的臨床指導(dǎo)意義。